Parte 1: Farmacologia di rete integrata e modello Zebrafish per indagare sui componenti a doppio effetto della Cistanche Tubulosa per il trattamento sia dell'osteoporosi che del morbo di Alzheimer
Mar 30, 2022
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Ying-Qi Li 1, Yi Chen 1, Jia-Yi Fang 1, Si-Qi Jiang 1, Ping Li 1, * e Fei Li 1, 2, *
ASTRATTO
Rilevanza etnofarmacologica:L'osteoporosi (OP) e il morbo di Alzheimer (AD) sono comuni malattie geriatriche concomitanti e molti studi indicano la connessione della loro patogenesi. Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) è una medicina tradizionale cinese ampiamente utilizzata ed è stata ampiamente applicata rispettivamente per il trattamento di OP e AD. Tuttavia, i principi attivi sia per le malattie concomitanti che per i meccanismi sottostanti sono limitati.
Scopo dello studio:Questo lavoro mirava a stabilire un metodo di screening di rete efficace e affidabile per trovare composti a doppio effetto in CT in grado di proteggere contemporaneamente AD e OP. E fornirà nuove prospettive del legame tra OP e AD sui meccanismi molecolari.
Materiale e metodi:I doppi effetti della TC sono stati analizzati sistematicamente integrando più database e un'analisi approfondita a livello di farmacologia di rete. È stata costruita una rete classificata di interazione farmaco-bersaglio per rivelare le differenze negli effetti tra i diversi tipi di composti. Per dimostrare l'efficacia di questa rete, sono stati selezionati alcuni composti da verificare nel modello OP pre-indotto e nel modello AD indotto da AlCl3- di zebrafish in base ai parametri topologici.
Parole chiave:Farmacologia di rete; osteoporosi;Il morbo di Alzheimer; Cistanche tubulose; Pesce zebra.
Cistanche ha una funzione anti-Alzheimer.
1. Introduzione
La tendenza all'invecchiamento della popolazione si traduce in una maggiore prevalenza di osteoporosi (OP) e malattia di Alzheimer (AD) nel corso degli anni (Parnetti et al., 2019; Rizzoli, 2018). Al giorno d'oggi sia l'OP che l'AD sono stati riconosciuti come le principali minacce per la salute pubblica poiché possono progredire senza sintomi e portare enormi oneri sociali (Erkkinen et al., 2018; Jonsson et al., 2018). Trattandosi di malattie legate all'età, nella pratica clinica si riscontra spesso una coincidenza con un alto tasso di disabilità e mortalità (Dengler-Crish and Elefteriou, 2019). L'OP è una malattia scheletrica sistemica caratterizzata da ridotta massa ossea e ridotta microarchitettura del tessuto osseo, con aumentata fragilità ossea e aumentato rischio di fratture (Rizzoli, 2018). L'AD è la degenerazione cerebrale più comune caratterizzata dalla progressiva perdita di memoria e di altre funzioni cognitive (Bondi et al., 2017). Finora, non ci sono ancora opzioni sufficientemente potenti per prevenire o curare le due malattie dalla loro complessa eziologia e patogenesi. E quel che è peggio è che il paziente ha più spesso effetti collaterali (Brown, 2017; Huang e Mucke, 2012).
Sulla base teorica della differenziazione della sindrome (Sucher, 2013), le medicine tradizionali cinesi (MTC) con più componenti che prendono di mira più di un meccanismo fisiopatologico hanno una superiorità unica nel trattamento di alcune malattie complesse familiari. Come erba tonica per i reni, Cistanche tubulosa (Schenk) Wight (CT) è ampiamente utilizzata contro la perdita di memoria e la debolezza atrofica delle ossa dai medici tradizionali cinesi (Fu et al., 2018). Oltre alla sua efficacia tradizionale, ricerche considerevoli hanno dimostrato che aveva varie attività farmacologiche, come il miglioramento dei deficit cognitivi e comportamentali (Wu et al., 2014), antinfiammatorio (Fu et al., 2018), la promozione della formazione ossea e la soppressione dell'osso riassorbimento (Li et al., 2013; Li et al., 2012), nonché attività antiossidante (Zhang et al., 2016). Ma la complicazione dei suoi principi attivi e del processo metabolico ha sollevato difficoltà sia nell'esplorazione di bersagli nei tessuti umani che nell'esposizione del meccanismo d'azione.
Soprattutto, è necessaria una discussione affidabile degli obiettivi terapeutici di OP/AD. Soprattutto sulla base del pensiero dello "stesso trattamento per diverse malattie" nelle MTC e delle metodologie della farmacologia in rete "terapeutica multicomponente, rete biologica", i tentativi di ricerca di bersagli comuni significativi tra le due malattie possono avere un risvolto particolarmente pratico significato nel fornire una guida per la prevenzione e il controllo di OP e AD. I pesci zebra hanno forti somiglianze nella loro fisiologia scheletrica con i mammiferi e geni altamente omologhi con gli esseri umani. È un modello animale disponibile e attraente in vivo per la ricerca OP e AD (Bergen et al., 2019; Newman et al., 2014). Pertanto, questa ricerca farmacologica di rete era finalizzata allo screening dei costituenti attivi a doppio effetto della TC, esplorando i potenziali bersagli comuni di OP e AD, oltre a scoprire la possibilità di utilizzare la TC per trattare due malattie contemporaneamente. In questo studio, le informazioni sui bersagli di principi attivi CT, genomi e informazioni sulla proteomica di OP e AD sono state raccolte rispettivamente da diversi database per stabilire una rete interattiva ed è stata costruita un'analisi di arricchimento per scoprire i meccanismi sinergici della CT per il trattamento di OP e AD . Inoltre, abbiamo indotto rispettivamente modelli di pesce zebra OP e AD e catturato i composti chiave nella rete per verificarne l'efficacia e gli obiettivi per due malattie.
Cistanche aumenta la crescita della sclerotina.
2. Materiali e metodi
2.1 Reagenti
Gli standard chimici di genisteina (GE), quercetina (QU), acido abietico (AA), -sitosterolo (BSS) (purezza maggiore o uguale al 98 percento) sono stati acquistati da Chroma Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Cina). Le piastre di coltura sono state ottenute da Wuxi NEST Biotechnology Co., Ltd. (Wuxi, Cina). Prednisolone (Pre), Etidronate Disodium (Ed), Donepezil HCL (DPZ), AlCl3·6H2O è stato acquistato da Aladdin Reagent Inc. Fosfatasi alcalina di pesce zebra (ALP), fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP), acetilcolinesterasi (AChE) e colina il kit di test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per l'acetiltransferasi (ChAT) è stato fornito da Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Trizol è stato ottenuto da Nanchino KeyGen Biotech. Co., Ltd. (Nanchino, Cina). Transtar Top Green qPCR SuperMix è stato acquistato da TransGen Biotech. Co., Ltd. (Pechino, Cina).
estratto di cistanche
2.2 Animali
Il pesce zebra adulto (ceppo AB, 4 mesi) è stato mantenuto a 28 gradi sotto un ciclo luce/buio di 14/10 h in un acquario rifornito con lo scambio d'acqua dolce. Sono stati tenuti due volte al giorno con una dieta di artemia appena schiusa (Chen et al., 2018). Gli embrioni normalmente fecondati sono stati selezionati e coltivati a 3 giorni dopo la fecondazione (dpf) in un'incubatrice a crescita leggera. Tutti gli esperimenti sugli animali erano conformi alle linee guida dell'istituzione e del governo per gli esperimenti sugli animali.
2.3 Processo farmacologico di rete
2.3.1 Calcolo dello spazio chimico e screening dei composti candidati
Tutti i dati sugli ingredienti chimici della TC sono stati raccolti dal database di farmacologia e dalla piattaforma di analisi dei sistemi di medicina tradizionale cinese. TCMSP è una piattaforma di farmacologia sistemica di medicinali a base di erbe cinesi che cattura le relazioni tra farmaci, bersagli e malattie (Ru et al., 2014). Nel frattempo, sono stati acquisiti quattro parametri farmacologici essenziali in TCMSP per l'analisi dei componenti principali (PCA), tra cui peso molecolare (MW), coefficiente di partizione tra ottanolo e acqua (AlogP), conteggio dei donatori di idrogeno (Hdon) e conteggio degli accettori di idrogeno ( Hacc). La distribuzione chimica di CT è stata costruita con i parametri sopra indicati utilizzando il software SIMCA (Versione 14.1, Umetrics). E nello stesso corso sono stati elaborati farmaci a piccole molecole approvati per AD/OP da DrugBank. Gli ingredienti della CT sono stati filtrati per somiglianza con il farmaco (DL). DL è un concetto qualitativo utilizzato nella progettazione di farmaci per una stima di quanto sia "simile a un farmaco" un potenziale composto. Questa proprietà vitale viene utilizzata come criterio di selezione per i composti "simili a farmaci" nelle erbe tradizionali cinesi e aiuta a ottimizzare la farmacocinetica e le proprietà farmaceutiche (Tao et al., 2013). Sulla base dei suggerimenti in letteratura e TCMSP, abbiamo selezionato DL maggiore o uguale a 0.18 come condizioni di filtro. Gli ingredienti conformi alla condizione sono stati esportati per analisi successive. Le loro 2-strutture dimensionali (2D) e 3D sono state dipinte dal software ChemDraw Professional 16.0. E le strutture 3D sono state ottimizzate dalla funzione di minimizzare l'energia in Chem3D 16.0.
2.3.2 Raccolta dei bersagli associati OP e AD
Tutte le associazioni geniche per OP e AD sono state raccolte in modo indipendente da DisGeNET e GeneCards. Il database DisGeNET è una delle più grandi piattaforme di scoperta pubblicamente disponibili di geni e varianti associati alle malattie umane (Pinero et al., 2017). GeneCards è un database integrato di geni umani che include informazioni genomiche, trascrittomiche, proteomiche, genetiche, cliniche e funzionali (Safran et al., 2010).
2.3.3 Raccolta di bersagli composti e previsione di aggancio inverso
Il database GeneCards e il database Swiss TargetPrediction sono stati combinati per prevedere gli obiettivi rilevanti dei principi attivi nella TC. GeneCards indica i bersagli attivi noti dei composti, mentre il database Swiss TargetPrediction può stimare i bersagli macromolecolari più probabili di piccole molecole (Daina et al., 2019). Prima della previsione, le strutture delle molecole candidate sono state convertite dal formato mol2 al formato SMILES utilizzando Open Babel (versione 2.4.1).
2.3.4 Analisi dell'interazione proteina-proteina
Il database STRING è stato applicato per scoprire le interazioni tra un gruppo di bersagli condivisi CT-OP-AD. Dopo aver cercato sotto lo schema di "Homo sapiens", la rete di interazione proteina-proteina (PPI) è stata visualizzata dal software Cytoscape (versione 3.7.2). STRING è un database di PPI noti e previsti, derivati da previsioni del contesto genomico, esperimenti di laboratorio ad alto rendimento, coespressione (conservata), estrazione di testo automatizzata e conoscenze precedenti nei database (Szklarczyk et al., 2017).
Cistanche fa bene al morbo di Alzheimer.
2.3.5 Analisi dell'arricchimento del percorso GO e KEGG
L'analisi dell'arricchimento di Gene Ontology (GO) è stata eseguita sul software Funrich. FunRich (versione 3.1.3) è un software funzionale utilizzato principalmente per l'analisi di arricchimento di geni e proteine (Pathan et al., 2015). Il database ConsensusPathDB-umano è stato impiegato per condurre l'analisi dell'arricchimento del percorso. L'elenco dei geni ottenuto è stato inviato al database con l'impostazione "cutoff del valore p" come 0,01. Dopo aver ottenuto i risultati, solo questi percorsi relativi a OP e/o AD sono stati selezionati e divisi in gruppi in base alle categorie di funzioni KEGG. CPDB è una rete di interazione senza soluzione di continuità contenente interazioni proteine-proteine binarie e complesse, genetiche, metaboliche, di segnalazione, regolatorie geniche e farmaco-bersaglio, nonché percorsi biochimici nell'Homo sapiens (Kamburov et al., 2013).
2.4 Procedure sperimentali per il modello OP Zebrafish
2.4.1 Raggruppamento di modelli
Le larve di pesce zebra sono state divise in diversi gruppi: gruppo di controllo, gruppo modello, gruppo modello più Ed, gruppo modello più composti, ognuno dei quali conteneva 30 larve. Il gruppo di controllo è stato mantenuto nel mezzo con lo 0,2% di DMSO. Il gruppo modello è stato trattato con Pre (25 µM) da 3 dpf a 8 dpf. Il gruppo modello più Ed è stato co-trattato con Pre ed Ed (30 µg/mL).
2.4.2 Colorazione con rosso alizarina
Dopo 5 giorni di coltura con diversi composti, le larve sono state anestetizzate, fissate e sbiancate a loro volta. Il rosso alizarina è stato usato per macchiare le ossa della testa del pesce zebra. Per rimuovere l'eccesso sono stati applicati rispettivamente l'1% di KOH e glicerolo (rapporti di 3:1, 1:1 e 1:3). Infine, è stato impiegato uno stereomicroscopio (Olympus SZX16) per catturare le immagini di colorazione del pesce zebra in posizione prona. L'area di colorazione e la densità ottica integrata (IOD) sono state calcolate da Image-Pro Plus 6.0.
2.4.3 Determinazione dell'attività ALP e TRAP
Le larve di pesce zebra a 3 dpf sono state sottocoltivate in 6-piastre a pozzetti e incubate con Pre in presenza o assenza di composti per 5 giorni. Quindi sono stati raccolti per misurare l'attività dell'ALP. L'attività dell'ALP è stata determinata utilizzando il kit ALP ELISA di zebrafish basato sul protocollo del produttore. Il metodo per valutare l'attività TRAP era lo stesso di ALP.
2.5 Procedure sperimentali per il modello AD Zebrafish
2.5.1 Raggruppamento di modelli
Le larve di pesce zebra sono state divise in diversi gruppi: gruppo di controllo, gruppo modello, gruppo modello più DPZ, gruppo modello più composti, ognuno dei quali conteneva 30 larve. Il gruppo di controllo è stato mantenuto nel mezzo con lo 0,2% di DMSO. Il gruppo modello è stato trattato con AlCl3 (150 µM, pH 5,8) da 3 dpf a 6 dpf. Il modello più il gruppo DPZ sono stati co-trattati con AlCl3 e DPZ (8 µM).
2.5.2 Analisi comportamentale
Dopo 3 giorni di somministrazione di farmaci, il movimento delle larve è stato registrato dall'analizzatore comportamentale ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.). Tutti gli esperimenti sono stati completati in 60 minuti a 28°C, contenenti 3 cicli di fase chiara/scura (10 minuti ciascuno per luce e buio). Secondo i metodi del rapporto precedente, la velocità media (AS), il cambio di velocità (∆S), il tasso di recupero dalla discinesia (DRR, equazione a) e l'efficienza della risposta (RE, equazione b) sono selezionati come efficienza del farmaco anti-AD indice di valutazione in questo modello (Pan et al., 2019; Wenhai et al., 2016).
AS (mm/sec)=D / T, DRR ( percentuale )=100 × (ASDrug - ASModel) / (ASControl - ASModel), a
dove D è la distanza di movimento del pesce zebra durante 60 min, T è il tempo sperimentale.
RE ( percentuale )=100 × (∆SDrug - ∆SModel) / (∆SControl - ∆SModel), b
dove ∆S è il cambio di velocità del pesce zebra nei cicli luce/buio.
2.5.3 Misurazione dell'attività AChE e CHAT
Le larve di pesce zebra a 3 dpf sono state sottocoltivate in 6-piastre a pozzetti e incubate con AlCl3 in presenza o assenza di composti per 3 giorni. Quindi sono stati raccolti per l'attività AChE. L'attività AChE è stata rilevata utilizzando il kit zebrafish AChE ELISA basato sul protocollo del produttore. Il metodo per valutare l'attività ChAT era lo stesso di AChE.
2.6 Analisi PCR quantitativa in tempo reale
Le larve di pesce zebra sono state divise in gruppi OP e AD. I gruppi OP erano costituiti dal gruppo di controllo, dal gruppo Pre e dai gruppi di composti Pre plus, coltivati da 3 dpf a 8 dpf. I gruppi AD includevano il gruppo di controllo, il gruppo AlCl3 e i gruppi AlCl3 più composti, coltivati da 3 dpf a 5 dpf. Ogni gruppo conteneva 30 larve. L'RNA totale è stato rispettivamente estratto da questi campioni di larve di pesce zebra da Trizol. I campioni di RNA sono stati trascritti in senso inverso in cDNA secondo le istruzioni del produttore del kit cDNA. Il livello di espressione dell'mRNA è stato rilevato mediante PCR quantitativa fluorescente in tempo reale (Roche LightCycler96). I risultati sono stati normalizzati all'espressione di -actina e quantificati con il metodo comparativo (2−∆∆Ct). I primer forward e reverse utilizzati sono stati sintetizzati da Sangon Biotech (Shanghai, Cina) ed elencati nella tabella supplementare S1.
cistanche e Tongkat ali in polvereaiuta a migliorare l'immunità.
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2.7 Analisi statistica
GraphPad Prism versione 8.00 è stato utilizzato per analisi statistiche descrittive. I dati sono stati espressi come media ± DS e analizzati con il metodo ANOVA per verificare la variabilità tra ogni prova considerando P minore o uguale a 0.05 come significativo.
