Parte 1: Mappatura dell'interazione epigenomica e trascrittomica durante la formazione della memoria e il richiamo nell'insieme dell'engram dell'ippocampo

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Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila- Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*

1Picower Institute for Learning andMemoria, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.

2Dipartimento di Scienze cerebrali e cognitive, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.

3Laboratorio di informatica e intelligenza artificiale, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, USA.

4Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, USA.

5Broad Institute di Harvard e MIT, Cambridge, Massachusetts, USA.

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Astratto

L'epigenoma e l'architettura genomica tridimensionale (3D) stanno emergendo come fattori chiave nella regolazione dinamica dei diversi programmi trascrizionali richiesti per le funzioni neuronali. Qui utilizziamo un sistema di tagging dipendente dall'attività nei topi per determinare lo stato epigenetico, l'architettura del genoma 3D e il paesaggio trascrizionale delle cellule engram nel corso della vita dimemoriaformazione e richiamo. I nostri risultati lo rivelanomemoriala codifica porta a un evento di priming epigenetico, caratterizzato da una maggiore accessibilità dei potenziatori senza corrispondenti cambiamenti trascrizionali.Memoriail consolidamento successivamente si traduce in una riorganizzazione spaziale di grandi segmenti di cromatina e interazioni promotore-potenziatore. Infine, con la riattivazione, i neuroni engram utilizzano un sottoinsieme di interazioni denovolong-range, in cui i potenziatori innescati sono stati messi in contatto con i rispettivi promotori per sovraregolare i geni coinvolti nella traduzione delle proteine ​​locali nei compartimenti sinaptici. Collettivamente, il nostro lavoro chiarisce la trascrizione completa e gli utenti possono visualizzare, stampare, copiare e scaricare testo e dati, estrarre il contenuto in tali documenti, per la ricerca accademica, sempre soggette alle condizioni d'uso complete: http://www.nature. com/authors/editorial_policies/license.html#terms

*Corrispondenza a: marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

Contributi dell'autore:

AM e L.-HT hanno concettualizzato e progettato il progetto. AM e AZ hanno eseguito esperimenti comportamentali, analisi ISH, immunocolorazione e MARIS. CA ha eseguito l'iniezione del virus e le immunocolorazioni. AM e HSM hanno eseguito esperimenti ATAC-seq. AM e AZ hanno eseguito esperimenti nucleari di RNA-seq. AM, HSM e VD hanno eseguito esperimenti pc-Hi-C e Hi-C. AM, HSM, VD, RMR e JDV hanno eseguito l'analisi ATAC-seq. AM, RMR, HSM, VD e FG hanno eseguito l'analisi nucleare dell'RNA-seq. AM, VD, HSM e RMR hanno eseguito analisi pc-Hi-C e Hi-C. Tutti gli autori hanno aiutato a interpretare i dati. AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK e LHT hanno scritto il manoscritto con il contributo di tutti gli autori. LHT ha fornito gli strumenti e ha supervisionato il progetto.

Interessi conflittuali:

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

il paesaggio epigenomico lungo la vita dimemoriaformazione e richiamo nell'insieme dell'engram dell'ippocampo.

La formazione e la conservazione delle memorie a lungo termine dipendono dall'espressione genica coordinata e dalla sintesi delle proteine ​​sinaptiche1. Questi processi molecolari agiscono all'interno di una specifica popolazione di neuroni, denominata cellule engram2–4. Approcci recenti che utilizzano l'espressione dipendente dall'attività dei giornalisti hanno fornito un quadro per esplorare l'insieme di engram5–8, ma i meccanismi molecolari che governanomemorial'archiviazione e il recupero rimangono poco conosciuti. In particolare, le modificazioni epigenetiche e l'architettura 3D-genomica stanno emergendo come un fattore chiave nella regolazione dinamica dell'espressione genica9-17, e c'è un crescente apprezzamento della loro importanza nella funzione neuronale, nello sviluppo e nella malattia14, 16, 18

Qui, abbiamo utilizzato il modello murino Targeted Recombination in Active Populations (TRAP), in cui i neuroni attivati ​​che esprimono il gene Activity Regulated Cytoskeleton Associated Protein, (Arc), sono contrassegnati in modo permanente in modo inducibile. Neuroni attivati ​​durantememoriala codifica, il consolidamento e il richiamo sono stati ordinati e sottoposti a sequenziamento dell'RNA nucleare (nRNA-seq), test per la cromatina accessibile alla trasposasi mediante sequenziamento (ATAC-seq) e cattura della conformazione cromosomica (Hi-C). I nostri dati lo dimostranomemoriala codifica porta a un aumento dell'accessibilità della cromatina a livello del genoma, senza cambiamenti previsti nell'espressione genica. Inoltre, dimostriamo che la fase tardiva del consolidamento della memoria era associata alla rilocalizzazione di grandi segmenti di cromatina (sottocompartimenti) da ambienti inattivi a permissivi e alla riorganizzazione del paesaggio di interazione promotore-potenziatore. Infine, la riattivazione dei neuroni durantememoriail richiamo è associato alle interazioni denovopromotore-potenziatore, utilizzando un ampio sottoinsieme di potenziatori che sono stati innescati durantememoriacodifica. Queste interazioni promotore-potenziatore sono associate a un forte cambiamento nell'espressione dei geni coinvolti nella sintesi proteica locale e nella morfogenesi sinaptica.

Risultati

Identificazione temporale e spaziale di cellule engram attivate e riattivate

Il monitoraggio dell'attività neuronale nel tempo è stata una delle principali sfide nello studio delle cellule engram, poiché i marcatori dell'attività neuronale, noti come geni precoci immediati (IEG), tornano al basale poco dopo l'induzione1,2. Per superare questa limitazione, abbiamo sfruttato il modello TRAP5,6, che richiede due transgeni, uno che esprime CreERT2 da un promotore Arc attività-dipendente e uno che consente l'espressione del reporter della proteina fluorescente gialla (eYFP), in un Cre- modo dipendente. La somministrazione di tamoxifene (TAM) ai topi TRAP determina un'etichetta eYFP permanente nei neuroni dell'arco attivati. Senza TAM, CreERT2 viene trattenuto nel citoplasma e eYFP non viene espresso (dati estesi Fig. 1a). I topi TRAP sono stati sottoposti al classico paradigma Pavloviano del condizionamento contestuale della paura (CFC) (Fig. 1a), un metodo comunemente impiegato per studiare i ricordi avversivi19. Circa 1,5-2 ore dopo l'esposizione a FS, i cervelli sono stati raccolti per identificare i) omologo 3 (Rbfox3) della proteina legante l'RNA fox-1 noto anche come neuroni marcati NeuN plus e eYFP plus che sono stati attivati ​​durante l'esposizione iniziale (Attivato -precoce), che può essere distinto da ii) NeuN plus /eYFP- neuroni dello stato basale non attivati ​​(basale) (Fig. 1a). Dopo cinque giorni, in assenza di recupero, abbiamo raccolto iii) NeuN più /eYFP più neuroni che sono stati contrassegnati il ​​giorno dell'allenamento, denotando a lungo terminememoriaconsolidamento (Attivato-ritardo). In un

coorte diversa, i topi sono stati riesposti allo stimolo condizionato e la successiva espressione della proteina ARC endogena è stata analizzata 1,5-2 ore dopo la riesposizione. Ciò ha consentito l'identificazione di iv) NeuN plus /eYFP plus / neuroni endogeni Arc plus engram che sono stati attivati ​​durante l'allenamento e riattivati ​​durantememoriarichiamo (Riattivato). In particolare, sebbene la ricombinazione del DNA possa non verificarsi completamente 1,5-2 ore dopo la FS, abbiamo osservato un'elevata co-localizzazione (media dell'84%) tra la proteina Arc endogena e il reporter Arc:eYFP (Extended Data Fig. 1b), che era anche coerente con le precedenti relazioni20.

Per confermarememoriacodifica e richiamo durante CFC, il comportamento di congelamento è stato registrato durante l'allenamento e la riesposizione a segnali che inducono paura (dati estesi Fig. 1c). Coerentemente con le pubblicazioni precedenti6,20, i nostri dati hanno mostrato un aumento significativo del numero di neuroni eYFP plus (Activated-early and -late) nell'ippocampo, rispetto ai topi che sono rimasti naïve al CFC nella loro gabbia domestica (F (2, 70)=240.3, pag<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

La formazione della memoria è associata a una maggiore accessibilità della cromatina, principalmente sui potenziatori

Per comprendere meglio le forze molecolari che governano i diversi programmi trascrizionali, abbiamo misurato i cambiamenti a livello del genoma dell'accessibilità della cromatina attraverso diverse fasi dimemoria. I tessuti dell'ippocampo sono stati raggruppati e nuclei isolati (dati estesi Fig. 2a, tabella supplementare 1) sono stati sottoposti alla preparazione della libreria ATAC-seq. L'analisi delle regioni differenzialmente accessibili (DAR) (Diffbind, modalità DESeq2) tra tutte le popolazioni (Fig. 2a) ha rivelato che la maggior parte dei cambiamenti nello stato della cromatina si verificano durante la fase iniziale della formazione della memoria, dove 7,862 regioni attraverso il genoma guadagnano accessibilità (basale vs precoce, tabella supplementare 2). Al contrario, abbiamo osservato cambiamenti relativamente minimi nello stato della cromatina durante la transizione da Attivato-precoce ad Attivato-tardivo (582 DAR) e tra neuroni Attivati-tardivi e Riattivati ​​(725 DAR), con una sovrapposizione del 48% tra di loro (Dati estesi Fig. 2b ). Sorprendentemente, abbiamo identificato un'ampia percentuale (52%) di DAR acquisiti stabilmente che sono diventati più accessibili in Attivato precocemente e sono rimasti accessibili sia nei neuroni Attivati ​​in ritardo che in quelli Riattivati ​​(Fig. 2b, c; Tabella 2 supplementare). È interessante notare che, mentre sia i cambiamenti precoci (Basale vs. Precoce) che i DAR stabilmente acquisiti sono stati arricchiti per le regioni intergeniche, i cambiamenti tardivi della cromatina (precoci vs. tardivi e tardivi vs. riattivati) sono stati per lo più arricchiti per i siti del promotore (Fig. 2d).

L'intuizione funzionale è stata fornita valutando come i DAR sono contrassegnati da diverse modifiche dell'istone. Abbiamo utilizzato ChromHMM per la prima volta per stabilire un modello dello stato della cromatina da due studi indipendenti che utilizzavano il tessuto dell'ippocampo prima e dopo lo shock del piede 21,22. Successivamente, abbiamo eseguito un'analisi di arricchimento delle pieghe (osservata sulla distribuzione prevista) dei DAR per questi diversi stati e abbiamo rivelato che i primi cambiamenti della cromatina e i DAR stabili erano arricchiti per i segni di potenziamento (Fig. 2e; Dati estesi Fig. 2c, Tabella supplementare 3) .

Questi risultati sono in linea con le pubblicazioni precedenti, dimostrando che la stimolazione della coltura neuronale primaria induce un'attività potenziatrice prolungata12,23. Successivamente, abbiamo analizzato la sovrapposizione di singoli loci stabili con H3K4me1 e H3K27ac21. Questi due segni dell'istone delineano diverse popolazioni di potenziatori, che possono essere "attivati" (solo H3K4me1), "attivi" (H3K4me1 e H3K27ac) o "latenti" (nessun segno)18. I picchi stabili hanno mostrato una distribuzione tra potenziatori attivati ​​e attivi (dati estesi Fig. 2d), dove si prevedeva che il 47% di questi siti fosse "latente" (nessuna sovrapposizione tra DAR e segni di istoni21 ottenuti 1 ora dopo FS). Per confermare il nostro modello, abbiamo eseguito l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per i marcatori dell'istone H3K4me1 e H3K27ac, seguita da qPCR. Quattro siti selezionati sono stati scelti dalla nostra analisi di modellazione del potenziatore presunto (dati estesi Fig. 2d; potenziatore 1 - previsto innescato, potenziatore 2- previsto attivo, potenziatore 3 e 4 - previsto latente). In accordo con il nostro modello, abbiamo identificato due loci "latenti" nello stato basale (Enhancer 3 e 4) che si sono trasformati in uno stato "attivo" durantememoriaformazione (Fig. 2f). Inoltre, il presunto potenziatore 1 è risultato essere "adescato" allo stato basale ed è diventato attivo, dove si è verificato un aumento significativo e stabile dei marcatori H3K27ac durante la fase tardiva e il richiamo (Fig. 2f). Insieme, questi dati indicano che il repertorio di potenziatori appena accessibili è stato ampliato nei neuroni engram potenziati, dove le regioni latenti o innescate hanno ottenuto segni H3K4me1 e H3K27ac e quindi sono diventate potenziatori attivi.

Per comprendere il ruolo funzionale delle regioni promotrici e potenziatrici accessibili, abbiamo eseguito l'analisi dell'arricchimento del motivo (Tabella supplementare 4). I nostri dati indicano che la maggior parte (70%) dei motivi sui promotori accessibili sono ugualmente arricchiti e sono stati identificati in tutte le fasi dimemoria(Dati estesi Fig. 2e). Al contrario, la maggior parte dei siti di potenziatori ha mostrato modelli distinti di motivi di legame del fattore di trascrizione (TF) in diverse fasi della memoria. È interessante notare che i motivi espressi in modo ubiquo dalla famiglia di TF Jun Proto-Oncogene, Ap-1 Fattore di trascrizione (cioè Jun-Ap1) e dalla famiglia di TF Regulatory Factor X (Rfx), sono stati significativamente arricchiti solo dopo la fase iniziale di codifica (Dati estesi Fig. 2e). In precedenza è stato riportato che il complesso Jun-Ap1 svolge un ruolo centrale nella selezione del potenziatore e potrebbe fungere da TF pionieristico per definire i siti dei potenziatori durante lo sviluppo cerebrale e l'attività neuronale12,24. Questi risultati sono coerenti con i nostri dati che hanno mostrato un'alta percentuale di loci latenti / innescati nello stato basale (Fig. 2f, Dati estesi Fig. 2c, d). Quindi, sembra che l'attività neuronale potrebbe innescare il legame di Jun-Ap1 con potenziatori latenti, che quindi reclutano modificatori della cromatina che attivano potenziatori latenti. Allo stesso modo, l'arricchimento dei motivi del fattore di trascrizione Yin Yang 1 (Yy1) solo negli enhancer degli stati precoci e tardivi, suggerisce che l'organizzazione del promotore-enhancer sia un processo attivo dimemoriaformazione, poiché è stato recentemente riportato che Yy1 facilita la formazione di queste interazioni a lungo raggio25. Nel complesso, questi dati suggeriscono che la fase iniziale dimemoriala formazione altera il panorama dell'accessibilità della cromatina nei neuroni attivati, con cambiamenti stabili di lunga durata che si verificano prevalentemente all'interno delle regioni potenziatrici.

Cambiamenti dinamici nell'architettura nucleare spaziale e accessibilità della cromatina durante l'inizialememoriala formazione corrisponde all'aumento della frequenza delle interazioni promotore-potenziatore durantememoriarichiamare

L'architettura nucleare 3D sta emergendo come un fattore chiave nella regolazione dinamica dell'espressione genica, in molte funzioni neuronali26-28. Quindi, eravamo interessati a delineare i cambiamenti precisi che si verificano nell'organizzazione spaziale della cromatina durantememoriaformazione e consolidamento. Abbiamo prodotto dati Hi-C da neuroni allo stato basale ed eYFP più tag (precoci e tardivi, Tabella supplementare 5). La cromatina è segregata in due compartimenti subnucleari spazialmente distinti, 'A' e 'B', corrispondenti rispettivamente alla cromatina trascrizionalmente attiva e inattiva15, 16,26. Le prime prove suggeriscono che l'attività neuronale e la segnalazione estrinseca potrebbero indurre una riorganizzazione dell'architettura della cromatina 3D14,27,28. La nostra analisi dello stato del compartimento15, 16,26 (Fig. 3a-c) ha rivelato la rilocalizzazione di grandi segmenti di cromatina dall'inattivo (B) all'ambiente permissivo (A) (e viceversa) durante la fase iniziale e tardiva dimemoriaformazione (212 segmenti passati da A a B, 127 da B ad A, dimensione media di ~ 436 Kbp). È interessante notare che il 52% delle regioni nella fase iniziale che sono passate da B ad A hanno mantenuto quello stato nella fase finale (cioè sono rimaste nello stato A, Fig. 3b, c; Tabella Supplementare 6). Inoltre, quasi tutte queste regioni si sono sovrapposte ai DAR acquisiti dalla nostra analisi ATAC-seq, confermando la transizione del sottocompartimento dall'ambiente inattivo a quello permissivo (Fig. 3d). Questi dati indicano che alcuni loci subiscono un cambio di sottocompartimento attraverso diverse fasi della memoria, e quindi potrebbero contribuire a cambiamenti a lungo termine nelle proprietà e nella funzione neuronale dopo l'attivazione iniziale.

Sebbene i nostri dati Hi-C suggerissero una riorganizzazione su larga scala, non è chiaro se questo riorientamento consentisse l'interazione di nuovi repertori di potenziatori del promotore e la messa a punto di diversi programmi trascrizionali (Fig. 3e). Utilizzando la tecnica Hi-C (pc-HiC) di cattura del promotore, abbiamo studiato i precisi cambiamenti che si verificano nelle interazioni promotore-potenziatori durante il processo dimemoriaformazione e richiamo. Per questo studio, abbiamo utilizzato "esche" progettate su misura per circa 5000 promotori29. In accordo con le pubblicazioni precedenti29, abbiamo rilevato ~19.000 (per gruppo) interazioni significative tra promotori-potenziatori (67,5%) e promotori-promotori (46,2%) (dati estesi Fig. 3a,b).

Poiché i promotori nel cervello dei mammiferi potrebbero essere sotto il controllo di molteplici elementi regolatori14,30,31, abbiamo analizzato la sovrapposizione tra tutti i potenziatori interagenti e i rispettivi promotori. Lo abbiamo scoperto durante ciascunomemoriafase, gli stessi promotori interagiscono più frequentemente con un sottoinsieme distinto di potenziatori (cioè unico, basale – 3243, precoce - 7602, tardo - 7028, riattivato – 7244; Fig. 4a, b; Dati estesi Fig. 3c; Tabella Supplementare 7). Questo risultato è coerente con le pubblicazioni precedenti che mostrano che molteplici potenziatori che circondano diversi geni (c-Fos e Arc) sono cruciali per la loro attivazione e la loro frequenza di interazione con i rispettivi promotori è alterata in risposta a vari agenti depolarizzanti nei neuroni in coltura31. Abbiamo anche identificato un sottoinsieme più piccolo di interazioni in cui i promotori interagivano con gli stessi potenziatori attraverso diversimemoriafasi (cioè comune, ~ 31 per cento di tutte le interazioni; Tabella supplementare 7). Inoltre, i neuroni riattivati ​​presentavano punteggi di interazione significativamente più forti (come calcolato da Chicago, Fig. 4b; Dati estesi Fig. 3d). Quindi, sebbene il numero di interazioni uniche fosse simile negli stati precoci, tardivi e riattivati, punteggi di interazione più forti indicano che interazioni specifiche promotore-potenziatore si verificano più frequentemente durante la memoria

richiamare. Questa nozione è stata ulteriormente convalidata da esperimenti 3C, con primer progettati per misurare la frequenza di interazione tra potenziatore selezionato (E) e promotori genici (P) che codificano per il fattore di inizio della traduzione eucariotica 3 subunità D (Eif3d) o il recettore del glutammato, ionotropico, kainato 3 (Grik3) (Fig. 4c). I nostri dati hanno mostrato che i neuroni riattivati ​​hanno avuto un aumento significativo della frequenza di interazione tra il promotore Eif3d e il potenziatore selezionato, rispetto alle altre popolazioni (Fig. 4c). Collettivamente, questi dati indicano che le interazioni promotore-potenziatore si verificano più frequentemente durantememoriarichiamare.

Successivamente, abbiamo chiesto se le interazioni dinamiche a lungo raggio identificate tramite pc-HiC corrispondano a regioni della cromatina che diventano più accessibili, come determinato tramite ATAC-seq. Ciò confermerebbe che la maggiore accessibilità ha una conseguenza funzionale nel determinare nuove interazioni promotore-potenziatore. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo confrontato la sovrapposizione tra potenziatori interagenti in ciascuna popolazione cellulare con DAR (osservati) o un insieme casuale di loci genomici accessibili (previsto). La nostra analisi ha rivelato una sovrapposizione significativa tra entrambi i DAR acquisiti nei neuroni attivati ​​​​precoci e i DAR acquisiti stabilmente con i potenziatori interagenti, in tutte le popolazioni cellulari (Tutte le Ps <{5}}.0001, dati="" estesi="" fig.="" 3e).="" al="" contrario,="" i="" cambiamenti="" nell'accessibilità="" della="" cromatina="" che="" si="" sono="" verificati="" durante="" la="" fase="" tardiva="">memoriail consolidamento e la riattivazione non si sovrapponevano in modo significativo ai potenziatori interagenti (dati estesi Fig. 3e). Insieme, questi risultati indicano che il guadagno di accessibilità durante la codifica della memoria è un evento di priming e questi loci innescati si impegnano in interazioni de-novo funzionale promotore-potenziatore durante le fasi successive dimemoriaformazione. Questo paesaggio dinamico è illustrato visualizzando le regioni genomiche attorno al gene della subunità A (Eif5a) del fattore 5 di inizio della traduzione eucariotica (Fig. 4d). Questa dissezione molecolare temporale della durata della vita dell'engram evidenzia come l'adescamento coordinato dello stato epigenetico di una cellula durantememoriala codifica e il consolidamento facilitano le interazioni a lungo raggio durante la riattivazione.