PARTE 1 Relazione normativa tra variazione di qualità e ambiente di Cistanche Deserticola in tre ecotipi basati sull'analisi del microbioma del suolo

L'ambiente influenza la composizione e la funzione del microbioma del suolo, che influenza indirettamente la qualità delle piante. In questo studio, il sequenziamento dell'amplicone 16S è stato utilizzato per rivelare le differenze incomposizione della comunità microbica del suolo diCistanche desertichein tre ecotipi (terreno salino-alcalino, pascolo e terreno sabbioso). attraverso l'analisi di correlazione dell'abbondanza della comunità microbica, del contenuto di glicosidi feniletanoidi e dei fattori ecologici, la relazione regolatoria tra la comunità microbica e la variazione di qualitàC. deserticolaè stato esposto. il profilo della funzione metabolica del microbioma del suolo è stato previsto utilizzando Tax4Fun. I dati hanno mostrato che le comunità microbiche del suolo dei tre ecotipi erano significativamente diverse (AMOVA, P <0.001) e="" la="" diversità="" alfa="" della="" comunità="" microbica="" del="" suolo="" dei="" prati="" era="" la="" più="" alta.="" l'analisi="" del="" microbioma="" centrale="" ha="" dimostrato="" che="" le="" comunità="" microbiche="" del="" suolo="">C. deserticolaerano per lo più caratterizzati da siccità, tolleranza al sale, resistenza agli alcali e resistenza allo stress, come Micrococcales e Bacillales. I biomarcatori, vale a dire oceanospirillales (terreno salino-alcali), Sphingomonadales (prato) e propionibacteriales (terreno sabbioso), possono distinguere tre comunità microbiche ecotipiche, sono stati scavati attraverso LEfSe e foresta casuale. I risultati dell'analisi di correlazione hanno dimostrato che il 2′-acetilacteoside è correlato positivamente con gli oceanospirillali nel suolo salino-alcalino. I profili delle funzioni metaboliche mostravano percorsi altamente arricchiti del metabolismo (metabolismo dei carboidrati e degli aminoacidi) e dell'elaborazione delle informazioni ambientali (trasporto di membrana e trasduzione del segnale). nel complesso, la composizione e la funzione dei microbiomi del suolo sono risultati fattori importanti per la variazione della qualitàC. deserticolain diversi ecotipi. Questo lavoro ha fornito nuove informazioni sulla relazione normativa tra l'ambiente, la comunità microbica del suolo e la variazione della qualità delle piante.

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Cistanche deserticheè una pianta parassitaria non fotosintetica che può crescere in habitat aridi, come terreni sabbiosi e fossati di fiumi asciutti, nonché in condizioni stressanti, come terreni salino-alcali1. Questa pianta ha parassitato le radici dello psammofito Haloxylon ammoendron, che mostra una forte resistenza alle condizioni ambientali difficili2. Le piante fanno affidamento sull'interazione benefica tra radici e microrganismi per ottenere nutrienti, promuovere la crescita e resistere allo stress esterno3. Nel frattempo, il microbioma del suolo governa il ciclo biogeochimico di macronutrienti, micronutrienti e altri elementi vitali per la crescita delle piante4. Tuttavia, la relazione traC. deserticolae i microrganismi del suolo della rizosfera rimangono poco chiari. Di conseguenza, presentando il microbioma del suolo della rizosfera diC. deserticolaè necessario.

C. deserticolaè spesso usato in Asia orientale, Asia centrale, Nord Africa e altri paesi come una sorta di medicinale alimentare e sanitario per migliorare la memoria, migliorare la funzione sessuale e proteggere il fegato5,6. I principali principi attivi diC. deserticolasono glicosidi feniletanoidi (PhGs), iridoidi, lignani e polisaccaridi. Tra questi componenti, i PhG sono i componenti attivi7. Uno studio precedente ha riportato che il contenuto di PhG in diversi ecotipi diC. deserticolanotevolmente differenti, tra cui il 2′-acetilacteoside potrebbe essere usato come marcatore chimico per distinguereC. deserticolaprodotto nello Xinjiang e nella Mongolia Interna1. Studi sulle comunità microbiche hanno dimostrato che le comunità microbiche possono regolare il metabolismo dei loro ospiti8,9. Pertanto, un confronto del rapporto tra comunità microbica e metaboliti nel suolo della rizosfera diC. deserticolain diversi ecotipi è urgentemente necessario.16S è stato eseguito il sequenziamento dell'amplicone di campioni di suolo della rizosfera vegetale per esplorare la diversità delle comunità microbiche, fornendo nuove informazioni sulla relazione tra piante e comunità microbiche del suolo10,11. Ad esempio, l'associazione della distribuzione e della dinamica dei funghi endofitici con C. songaricum e N. tangutorum è stata studiata in studi sul microbioma utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento11. In questo studio, abbiamo eseguito il sequenziamento dell'amplicone di rRNA 16S per ottenere i microbiomi del suolo diC. deserticolain diversi ecotipi. Sono state anche confrontate le differenze della comunità microbica del suolo in vari ecotipi e sono stati scavati i biomarcatori che potrebbero distinguere i tre ecotipi. L'analisi di correlazione è stata quindi calcolata tramite l'abbondanza della comunità microbica chiave, il contenuto di PhG e fattori ecologici ed è stata esplorata la relazione normativa. Infine, la funzione dei microbiomi del suolo diC. deserticolain diversi ecotipi è stato previsto.

Materiali e metodi

Descrizione del sito di studio e campionamento.Secondo le indagini di feld,C. deserticolaha tre ecotipi principali, tra cui terreno salino-alcalino, pascolo e terreno sabbioso. Ad aprile 2017 abbiamo raccolto campioni di suolo che rappresentano i principali ecotipi diC. deserticolain Cina. Campioni di terreno salino-alcalino sono stati raccolti dal lago Ebinur (AB1, AB2, AB3) e dalla spiaggia di Baicheng (BJ1, BJ2, BJ3, BJ4, BJ5) nella provincia dello Xinjiang. I campioni di terreno delle praterie sono stati prelevati dal villaggio di Tula (TL1, TL2, TL3, TL4, TL5) nella provincia dello Xinjiang. Campioni di terreno sabbioso sono stati raccolti da Alxa (AL1, AL2, AL3, AL4, AL5, AL6) nella provincia della Mongolia Interna e nella contea di Minqin (GS1, GS2), contea di Changcheng (GS3, GS4) nella provincia di Gansu. Le informazioni su longitudine, latitudine e altitudine di tutti i punti di campionamento sono mostrate nella Tabella 1 e nella Fig. 1. Nel sito di feld, abbiamo utilizzato un trapano cilindrico in acciaio inossidabile con un diametro di 5 cm per raccogliere il terreno adiacente al gambo succulento diC. deserticolae il suo ospite, e lo conservo immediatamente in un frigorifero portatile a –20 gradi . Dopo il trasporto in laboratorio, i campioni di terreno sono stati passati attraverso un setaccio di 2-mm per rimuovere tessuti vegetali, radici, rocce, ecc. e conservati a –20 gradi in frigorifero prima di ulteriori esperimenti.

Estrazione del DNA e sequenziamento dell'rRNA 16S.Il DNA del suolo è stato estratto utilizzando il kit di isolamento del DNA PowerSoil (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA) seguendo il manuale12. La purezza e la qualità del DNA genomico sono state controllate mediante elettroforesi su gel di agarosio 0,8 percento e nanodrop.

La regione ipervariabile V3-V4 del gene batterico 16S rRNA è stata amplificata con i primer 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) e 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT)13. Per ogni campione di terreno, è stata aggiunta una sequenza di codici a barre 10-cifre all'estremità 5′ dei primer forward e reverse (Allwegene Company, Pechino)12. La PCR è stata eseguita su un Mastercycler Gradient (Eppendorf, Germania) utilizzando 25 ul di volumi di reazione contenenti 12,5 ul di KAPA 2G Robust Hot Start Ready Mix, 1 µl di primer diretto (5 µM), 1 µl di primer inverso (5 µM), 5 µl di DNA (la quantità totale del templato è 30 ng) e 5,5 µl di H2O. I parametri di ciclismo sono i seguenti: 95 gradi per 5 min, seguiti da 28 cicli di 95 gradi per 45 s, 55 gradi per 50 s e 72 gradi per 45 s, con un'estensione finale a 72 gradi per 10 min. Tre prodotti PCR per campione sono stati raggruppati per mitigare le distorsioni della PCR a livello di reazione. I prodotti della PCR sono stati purificati utilizzando un kit di estrazione del gel QIAquick (QIAGEN, Germania) e quindi quantificati utilizzando la PCR14 in tempo reale.

Il sequenziamento profondo è stato eseguito su una piattaforma MISeq presso la Allwegene Company (Pechino). Dopo la corsa, l'analisi dell'immagine, l'identificazione delle basi e la stima degli errori sono state eseguite utilizzando Illumina Analysis Pipeline versione 2.614.

Cistanchetubulosa può antinvecchiamento

Analisi dei dati.I dati grezzi sono stati inizialmente selezionati e le sequenze sono state rimosse sulla base delle seguenti considerazioni: sequenze inferiori a 200 bp con punteggio di qualità basso (inferiore o uguale a 20) e contenevano basi ambigue o non corrispondevano le sequenze di primer e le etichette dei codici a barre15. Le letture qualificate sono state separate utilizzando le sequenze di codici a barre specifiche del campione e tagliate con Illumina Analysis Pipeline versione 2.6. Quindi, i set di dati sono stati analizzati utilizzando QIIME. Le sequenze sono state raggruppate in unità tassonomiche operative (OTU) a un livello di somiglianza del 97 percento 16 per generare curve di rarefazione e calcolare gli indici di ricchezza e diversità. Lo strumento Ribosomal Database Project Classifer è stato utilizzato per classificare tutte le sequenze in diversi gruppi tassonomici15. Le analisi di clustering sono state eseguite sulla base delle informazioni OTU di ciascun campione utilizzando R per esaminare la somiglianza tra diversi campioni17. La matrice UniFracdistances tra le comunità microbiche di ciascun campione è stata calcolata utilizzando il coefficiente di Tayc e rappresentata come un metodo per gruppi di coppie non ponderato con albero di raggruppamento della media aritmetica, che descrive la dissomiglianza ({13}}somiglianza) tra i più campioni18. Attraverso questa analisi è stato generato anche un file albero in formato Newick. La diversità alfa è stata applicata nell'analisi della complessità della diversità delle specie per un campione utilizzando quattro indici, tra cui Chao1, specie osservate, albero intero della diversità filogenetica (PD) e indice di diversità di Shannon. Questi indici sono stati calcolati utilizzando il software QIIME (Boulder, CO, USA) in Python (v.1.8.0) (La Jalla, CA, USA)19. L'analisi della diversità beta è stata utilizzata per valutare le differenze dei campioni in termini di complessità delle specie. La diversità beta è stata calcolata utilizzando l'analisi delle coordinate principali (PCoA) e l'analisi dei cluster in QIIME20. L'analisi della varianza molecolare (AMOVA) è stata eseguita utilizzando mothur. EdgeR è stato utilizzato per calcolare la differenza OTU tra i gruppi. Heatmap.2 è stato utilizzato per disegnare la mappa termica, mentre Ggplot è stato utilizzato per disegnare la mappa di Manhattan.

Determinazione del biomarcatore e del core microbioma.I metodi di analisi discriminante lineare (LDA) e foresta casuale (RF) nel sito Web di Microbiome Analyst21 sono stati utilizzati per determinare il microbioma biomarcatore.

Il sito Web esegue in primo luogo il test fattoriale Kruskal–Wallis sum-rank test per identificare le caratteristiche con abbondanza differenziale significativa considerando il fattore sperimentale o la classe di interesse, seguito da LDA per calcolare la dimensione dell'effetto di ciascuna caratteristica diferenziale abbondante21. Le caratteristiche sono considerate significative in base al loro valore p aggiustato. Il valore di adj.p predefinito cutof=0.05. L'analisi RF viene eseguita utilizzando il pacchetto randomForest5. RF è un algoritmo di apprendimento supervisionato adatto per l'analisi di dati ad alta dimensione. Questo metodo utilizza un insieme di alberi di classificazione, ognuno dei quali è cresciuto tramite una selezione casuale di caratteristiche da un campione bootstrap in ogni ramo22. L'analisi del microbioma principale è stata adottata dalla funzione principale nel microbioma del pacchetto R da Microbiome Analyst

analisi di correlazione delle principali comunità microbiche, contenuto di PhG e fattori ecologici.Il contenuto di sette glicosidi feniletanoidi (PhGs) dei tre ecotipi di C. deserticola, vale a dire, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, 2′-acetilacteosid, tubuloside A e cistanoside F, sono stati determinati mediante HPLC. Le condizioni cromatografiche coinvolgono una colonna Waters C18 (150 mm × 3,9 mm, 4,6 μm) e la fase mobile comprende acetonitrile e 0,2% di acido formico. Le impostazioni cromatografiche erano le seguenti: 0–10 min, 10 percento → 15 percento A; 10–30 min, 15 percento → 40 percento A. La velocità di flusso era di 1 ml/min. La lunghezza d'onda di assorbimento, il volume di iniezione e la temperatura della colonna erano rispettivamente di 330 nm, 10 μL e 27 gradi. Lo studio metodologico fa riferimento al lavoro sperimentale preliminare del gruppo di riferimento1.

Questo studio ha raccolto 16 stazioni meteorologiche vicino ai tre tipi ecologici diC. deserticolaXinjiang Bole 51238, Tacheng 51133, Tori 51241, Karamay 51243, Buxail 51156, Yumin 51137, Emin

51145, Gansu Minqin 52681, Yongchang 52674, Wuwei 52679, Gulang 52784, Inner Mongolia Suikou 53419, Hangjinhouqi 53420 e Wuhai 53512. I dati di sette fattori climatici dal 1981 al 2010 sono serviti come dati dei fattori climatici per la successiva analisi di correlazione.

Redundancy analysis of diferential metabolites and bioclimatic factors was performed by using Canoco 5 software23. Pearson correlation coefcient was calculated for biomarker microbiome abundance, compound con- tent and ecological factor data integration. In this study, the log2 data conversion was uniformly performed before the analysis. SPSS was used to calculate the Pearson correlation coefcient of the six biomarkers, six core micro- biomes, seven main active components of C. deserticola and the ecological factors in the three habitats, and the screening standard was as follows: pearson correlation coefcient (r) >{{0}}.5 e p valore < 0.05.="" le="" relazioni="" tra="" i="" suddetti="" fattori="" sono="" state="" visualizzate="" utilizzando="" cytoscape24="" (the="" cytoscape="" consortium,="" san="" diego,="" ca,="" usa,="" versione="" 3.7.0)="" e="" pheatmap="" (pacchetto="">

Predizione dei profili funzionali microbici del microbioma.Tax4Fun25 (pacchetto R, http:// tax4fun.gobics.de/) è stato utilizzato per prevedere i profili funzionali microbici dei microbiomi nei campioni di suolo. La tabella OTU Biom del microbioma del suolo è stata utilizzata come file di input per l'imputazione del metagenoma di campioni di suolo di C. deserticola. Quindi, le abbondanze di classi geniche previste sono state analizzate al livello 3 del gruppo KEGG Orthology (KO). I risultati di Tax4Fun sono stati analizzati in doBy (pacchetto R)26.

Risultati

Composizione della comunità microbica. The 16S rRNA sequencing resulted in 834,323 raw reads, amongst which 522,929 passed the quality and length fltering. The data set comprised 20,511–48,337 (mean: 33,994) sequences per sample. The high-quality reads were clustered using >97 percento di identità di sequenza in 3541 OTU microbiche (Tabella 1).

La comunità microbica è stata generalmente classificata in 19 phyla, 46 classi e 87 ordini (Figg. 2a, b e S1–S3). A livello di phylum, Actinobacteria (35%), Proteobacteria (31%) e Firmicutes (15%) erano dominanti nei terreni salino-alcali. La prateria era dominata da Actinobacteria (37%), Proteobacteria (29%) e Bacteroidetes (9%). Nella terra sabbiosa, Actinobacteria (42 percento), Proteobacteria (33 percento) e Firmicutes (6 percento) erano dominanti. A livello di classe, Actinobacteria (25%), Gammaproteobacteria (21%) e Bacilli (15%) erano dominanti nei terreni salino-alcali, mentre Actinobacteria (22%), Alphaproteobacteria (16%) e Bacilli (8%) erano dominanti in pascolo. Nei terreni sabbiosi dominavano Actinobacteria (23%), Alphaproteobacteria (20%) e Gammaproteobacteria (9%). A livello di ordine (Fig. 2c-e), Micrococcales (22 percento), Oceanospirillales (15 percento) e Bacillales (15 percento) erano dominanti nei terreni salino-alcalini. Micrococcales (11%) e Bacillales (8%) dominavano nelle praterie. Pertanto, gli ordini batterici più dominanti erano Micrococcales (10%) e Acidimicrobiales (7%).

Diversità dei batteri del suolo nei tre ecotipi di C. deserticola.Le misure della diversità all'interno del campione (-diversità) hanno rivelato un gradiente di diversità tra i tre habitat (Fig. 2f e Tabella S1). La diversità alfa della comunità microbica batterica del suolo di ciascun campione è stata stimata utilizzando la ricchezza della comunità (Chao 1, che è stata espressa come numero totale previsto di OTU in ciascun campione), le specie osservate, l'intero albero PD e l'indice di diversità di Shannon. Le specie osservate, Chao 1 e PD whole tree index, hanno suggerito che le comunità del suolo dei prati avevano la più alta diversità, mentre la diversità dei suoli salino-alcali e sabbiosi è simile. I risultati delle curve di therarefaction (Fig. S1) sono simili ai risultati di cui sopra.

Atteosidiincistancheavere buoni effetti surene

I risultati AMOVA (Tabella S2) hanno mostrato che p < 0.001,="" che="" indica="" una="" differenza="" significativa="" tra="" i="" tre="" habitat.="" i="" risultati="" del="" raggruppamento="" degli="" alberi="" della="" diversità="" della="" distanza="" di="" raglio="" (fig.="" s2)="" dei="" tre="" campioni="" di="" suolo="" dell'habitat="" hanno="" dimostrato="" che="" i="" campioni="" di="" suolo="" salino-alcalino="" erano="" strettamente="" raggruppati="" e="" la="" distanza="" tra="" i="" campioni="" di="" terreno="" erboso="" e="" sabbioso="" era="" vicina.="" i="" risultati="" dei="" pcoa="" non="" vincolati="" dei="" grafici="" 2d="" a="" distanza="" unifrac="" non="" ponderati="" (fig.="" 2g)="" hanno="" mostrato="" che="" i="" diversi="" campioni="" di="" suolo="" della="" comunità="" microbica="" batterica="" provenienti="" da="" diversi="" habitat="" erano="" ben="">

confronto delle comunità batteriche del suolo dei tre ecotipi di c. desertico.Diverse mappe di calore dell'abbondanza di OTU e mappa del vulcano (Fig. 3b, e, d, h e Tabella S3) hanno indicato che rispetto ai campioni di terreni sabbiosi, 24 e 17 OTU erano rispettivamente arricchiti e impoveriti in terreni salino-alcalini a livello di ordine. Inoltre, rispetto ai campioni di terreno sabbioso, 8 e 11 OTU sono state rispettivamente arricchite ed esaurite nei prati. Il diagramma di Venn (Fig. 3c, f) ha illustrato che 216 OTU erano esaurite in terreno sabbioso, 8 erano esaurite in soluzioni saline-alcali

terra e 1 OTU sovrapposte tra saline-alcali e terre sabbiose. Inoltre, 3 OTU sono state arricchite in prati, mentre 161 sono state arricchite in terreni sabbiosi, di cui 6 OTU sovrapposte tra prati e terreni sabbiosi. I lotti di Manhattan (Fig. 3a) hanno dimostrato che gli Xanthomonadales erano più arricchiti e impoveriti in terreni salino-alcalini rispetto a quelli in terreni sabbiosi, mentre il batterio Xanthomonadaceae WWH73, WD2101 soil group, Vibrionales e Verrucomicrobiales erano significativamente esauriti a livello di ordine. Confrontando i prati con i terreni sabbiosi, Xanthomonadales, il gruppo di suolo WD2101, Vibrionales e Verrucomicrobiales erano significativamente esauriti.

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Determinazione del biomarcatore e del core microbioma nei tre ecotipi di C. deserticola.I metodi LEfSe e RF (Fig. 4a, b, d) sono stati utilizzati per identificare le caratteristiche con significativa abbondanza differenziale attraverso i campioni di suolo, calcolare la dimensione dell'effetto di ciascuna caratteristica differenzialmente abbondante e determinare il microbioma batterico biomarcatore nei tre habitat a livello di ordine . I risultati presentati nella tabella S4 hanno rivelato che il punteggio LDA di Oceanospirillales, Bacillales e Flavobacteriales era il più alto tra quelli nei terreni salino-alcali, mentre quello di Sphingomonadales, Gaiellales, Rubrobacterales, Burkholderiales e Sphingobacteriales era il più alto tra quelli nei prati. Il punteggio LDA di Propionibacteriales, Rhodospirillales, Solirubrobacterales, Rhizobiales, Xanthomonadales e Pseudonocardiales era dominante nei terreni sabbiosi. Con l'esclusione degli ordini indefiniti e duplicati, queste OTU sono state classificate in sei ordini e le loro abbondanze sono state disegnate in una mappa di calore (Fig. 4c).

Il metodo di persistenza è stato adottato dalla funzione principale nel microbioma del pacchetto R per identificare il microbioma principale nei tre ecotipi di C. deserticola. Questo microbioma batterico centrale conteneva sei ordini, inclusi Micrococcales, Bacillales, Rhizobiales, Acidimicrobiales, Streptomycetales e Sphingomonadales. Con l'esclusione degli ordini indefiniti e duplicati, queste OTU sono state classificate in sei ordini e le loro abbondanze sono state disegnate in una mappa di calore (Fig. 2h).

Il metodo di persistenza è stato adottato dalla funzione principale nel microbioma del pacchetto R per identificare il microbioma principale nei tre ecotipi di C. deserticola. Questo microbioma batterico centrale conteneva sei ordini, inclusi Micrococcales, Bacillales, Rhizobiales, Acidimicrobiales, Streptomycetales e Sphingomonadales. Con l'esclusione degli ordini indefiniti e duplicati, queste OTU sono state classificate in sei ordini e le loro abbondanze sono state disegnate in una mappa di calore (Fig. 2h).