PARTE 1 Rivelando l'impatto dell'ambiente sulla salsa di Cistanche: dalla regionalizzazione ecologica globale alle caratteristiche della comunità microbica del suolo

ASTRATTO:Comprendere il rapporto normativo tra ambiente eCistanche salsa, qui abbiamo integrato i metodi delle macro e micro dimensioni. Da una prospettiva macro, il modello MaxEnt indicava che i paesi della Belt and Road Initiative, come Cina, Egitto e Libia, erano particolarmente adatti alla crescita diC. salsadai tempi antichi (ultimo massimo glaciale e metà dell'Olocene) al futuro (2050 e 2070). Il test Jackknife ha rivelato che le precipitazioni sono un importante fattore ecologico che influisce sulla distribuzione di C. salsa. Da una prospettiva macro, i dati di sequenziamento dell'amplicone dell'rRNA 16S hanno mostrato che le comunità microbiche del suolo di tre ecotipi (deserto-steppa, prateria e ghiaia-deserto) erano significativamente diverse (p <0,001). l'analisi="" del="" microbioma="" principale="" ha="" dimostrato="" che="" i="" generi="" batterici="" arthrobacter,="" sphingomonas="" e="" bacillus="" erano="" taxa="" core="" arricchiti="">C. salsa. LEfSe e foresta casuale sono state utilizzate per scavare il Gillisia (deserto-steppa), Flavisolibacter (prato) e Variibacter(ghiaia-deserto) come biomarcatori in grado di distinguere tra comunità microbiche dai tre ecotipi. Il profilo di previsione ha mostrato che la funzione metabolica della comunità microbica è stata arricchita nelle vie metaboliche e nell'elaborazione delle informazioni ambientali. Le analisi di correlazione hanno rivelato che l'altitudine, le precipitazioni del quartiere più caldo (bio18), l'intervallo diurno medio (bio2) e la temperatura media del quartiere più caldo (bio10) erano importanti fattori ecologici che influiscono sulla composizione delle comunità microbiche del suolo. Questo lavoro ha fornito nuove informazioni sulla relazione normativa tra l'adeguata distribuzione diC. salsa, comunità microbiche del suolo e driver ecologici. Inoltre, ha approfondito la comprensione dell'interazione tra piante del deserto e fattori ecologici negli ambienti aridi.

PAROLE CHIAVE:Cistanche salsa, MaxEnt, sequenziamento dell'amplicone dell'rRNA 16S, comunità microbica del suolo, impatto ambientale.

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Per maggiori informazioni si prega di contattare:Joanna.jia@wecistanche.com

1. INTRODUZIONE

Il valore economico delle piante medicinali è aumentato rapidamente negli ultimi anni con lo sviluppo e l'utilizzo a livello mondiale delle piante naturali. Lo stelo carnoso diCistanche salsaè un organo vegetale commestibile e medicinale comunemente usato come tonico renale, afrodisiaco, trattamento antietà e antiossidante, lassativo intestinale, trattamento di protezione del fegato e trattamento anti-radiazioni. I moderni studi fitochimici su C. salsa hanno portato all'identificazione e all'isolamento di notevoli quantità di composti bioattivi, come vari glicosidi feniletanoidi, iridoidi, alditoli e lignina, che hanno importanti valori medici e commestibili.1 Con il rapido sviluppo del mercato per medicine e cibi sani, la domanda diC. salsaè notevolmente aumentata ed è accompagnata dallo sfruttamento eccessivo e dal saccheggio delle risorse selvatiche. Pertanto, l'introduzione artificiale e la coltivazione su larga scala diC. salsasono diventati una misura importante per proteggere le risorse selvatiche e rallentare la desertificazione ecologica. Tuttavia, la ricerca sulla coltivazione artificiale diC. salsarimane limitato.

L'ambiente ha un impatto enorme sulla crescita e lo sviluppo di C. salsa.2 Le piante crescono in ambienti diversi, formando ecotipi diversi che mostrano cambiamenti significativi degli ingredienti inattivi e dell'espressione genica.3,4 A livello macro, la ricerca ha scoperto che la temperatura, luce, precipitazioni e tipi di suolo hanno tutti un effetto sulla crescita delle piante e sui suoi principi attivi.5,6 Lo studio dell'interazione tra l'ambiente e le piante e la caratterizzazione completa dei diversi ecotipi di piante sono utili per la selezione e la coltivazione di -varietà di qualità.7 Da una prospettiva macro, le piante possono avere un impatto considerevole sugli organismi del suolo anche se hanno poco o nessun contatto diretto con il sistema suolo attraverso le loro radici.8,9 Tuttavia, la ricerca attuale sul rapporto tra piante e l'ambiente, compresi i fattori climatici e la comunità microbica del suolo, non è ancora chiaro.

Il modello di distribuzione delle specie (SDM) è un modello statistico che è stato stabilito utilizzando i dati di distribuzione delle specie esistenti e le variabili ambientali per dedurre i bisogni ecologici delle specie e proiettarne le potenziali aree di distribuzione,10,11 esplorare aree di crescita adatte combinando fattori climatici e del suolo, determinare l'ambiente appropriato per le piante medicinali e proteggere scientificamente e coltivare piante in via di estinzione.12,13 Gli SDM, come MaxEnt e biomod2, hanno risposto con successo alle previsioni delle tendenze di distribuzione imposte alle piante in via di estinzione ed ecologiche durante il cambiamento climatico.14,15

Il sequenziamento dell'amplicone di 16S rRNA di campioni di suolo della rizosfera vegetale è stato eseguito per esplorare la diversità delle comunità microbiche, fornendo nuove informazioni sulla relazione tra piante e comunità microbiche del suolo.16,17

In questo studio, abbiamo esplorato la relazione tra l'ambiente eC. salsadalle dimensioni macro e micro. Abbiamo eseguito quanto segue. (1) Abbiamo utilizzato il modello MaxEnt per prevedere le aree di crescita idonee globali diC. salsadall'antichità al futuro (cinque periodi: Ultimo Massimo Glaciale [LGM], Olocene medio [MH], presente, 2050 e 2070) e calcolò le aree idonee di diversi livelli e l'aliquota di contribuzione e la gamma di variabili bioclimatiche che inffettono distribuzione diC. salsa.(2) In combinazione con il lavoro sul campo, abbiamo raccolto tre campioni di suolo di ecotipi (deserto-steppa, prati e ghiaia-deserto) dalla migliore area di coltivazione (Tacheng e Xinjiang) di

C. salsa. Abbiamo eseguito il sequenziamento dell'amplicone di rRNA 16S per esplorare le caratteristiche delle comunità microbiche del suolo. Abbiamo anche confrontato le differenze nei microbiomi del suolo nei tre ecotipi e determinato i microbiomi centrali e i biomarcatori che potrebbero distinguere tra i tre ecotipi. (3) Abbiamo condotto analisi di correlazione e analisi ridondanti sulla base dell'abbondanza dei microbiomi principali, dei biomarcatori e delle variabili bioclimatiche per esplorare la relazione regolatoria traC. salsae l'ambiente.

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2. MATERIALI E METODI

2.1. Modellistica di nicchia ecologica.

In questa ricerca, sono state utilizzate cinque risorse per cercare i siti attuali diC. salsain tutto il mondo: (1) GBIF ; (3) Infrastruttura nazionale per l'informazione sui campioni (4) letteratura pubblicata; e (5) lavoro sul campo. I dati campione senza latitudine e longitudine sono stati basati su una query di latitudine e longitudine della mappa online. Il metodo di analisi del buffer è stato utilizzato per correggere le bozze e filtrare i punti di distribuzione ottenuti per eliminare l'effetto della simulazione di overfitting causato da un'ampia correlazione spaziale. La risoluzione spaziale delle variabili bioclimatiche era di 2,5 arc-min (circa 4,5 km2) e la distanza del buffer era fissata a 3 km. Un solo punto di distribuzione è stato mantenuto quando la distanza tra i punti di distribuzione era inferiore a 3 km. Dopo che i punti duplicati sono stati rimossi, 76 occorrenze, tutte dall'area di produzione genuina di C. salsa, sono state raccolte e utilizzate per l'analisi (Figura 1a, File supplementare 1).

Abbiamo utilizzato le 19 variabili bioclimatiche di WorldClim come predittori ambientali. Gli attuali dati delle variabili bioclimatiche di questo studio sono stati raccolti dai dati di monitoraggio del database WorldClim versione 1.418 nel periodo 1960-1990 con una risoluzione di 2,5 arc-min. Le variabili bioclimatiche antiche (LGM e MH) e future (futuro 2050 e futuro 2070) disponibili nella versione 1.4 di WorldClim con una risoluzione di 2,5 arc-min sono state impiegate come predittori dei modelli di distribuzione delle specie. Per evitare la multicollinearità, abbiamo eseguito un'analisi di correlazione sui punti di sfondo ed eliminato una delle variabili in ciascuna coppia con un Pearson

valore di correlazione > 0.819 (Figura S1). Le otto variabili bioclimatiche infine incluse nei modelli erano l'intervallo medio diurno (bio2), la temperatura media del quarto più piovoso (bio8), la temperatura media del quarto più secco (bio9), la temperatura media del quarto più caldo (bio10) , precipitazioni annuali (bio12), precipitazioni del quartiere più secco (bio17), precipitazioni del quartiere più caldo (bio18) e precipitazioni del quartiere più freddo (bio19).

Abbiamo utilizzato il modello di entropia massima del pacchetto software open source (MaxEnt v.3.4.0),20 che può essere scaricato per costruire un modello di distribuzione delle specie perC. salsa. I seguenti parametri sono stati utilizzati nelle impostazioni di base: seme casuale e una percentuale di test casuale di 25 e 10 repliche. Impostando la percentuale del test casuale su 25 percento , abbiamo selezionato casualmente il 75 percento dei punti di distribuzione per il set di allenamento. Impostando il numero di repliche su 10, abbiamo eseguito il modello 10 volte con le stesse impostazioni e abbiamo calcolato la media dell'output di tutte le esecuzioni per ottenere il risultato finale. L'area sotto la curva dell'operatore ricevente (AUC) è stata utilizzata per valutare la bontà di adattamento del modello e il modello con il valore AUC più alto è stato considerato quello con le prestazioni migliori. La procedura del coltello a serramanico è stata utilizzata per valutare l'importanza delle variabili. Le curve di risposta sono state utilizzate per ottenere l'intervallo delle variabili bioclimatiche.

ArcGIS è stato utilizzato per analizzare le variabili bioclimatiche che influiscono sulla distribuzione di C. salsa e per classificare e calcolare l'area adatta alla produzione.

2.2. Raccolta e descrizione del campione del suolo. C. salsa

è distribuito naturalmente nei tre ecotipi di deserto di ghiaia, prateria e steppa desertica. Nell'aprile 2017 abbiamo raccolto campioni carnosi di stelo e suolo che rappresentano i principali ecotipi di C. salsa a Tacheng, Xinjiang, Cina (Figura 1b, Tabella 1). Campioni del deserto di ghiaia sono stati raccolti da Hejiaoke, nella contea di Toli (HJ1, HJ2 e HJ3). I campioni di prati sono stati raccolti dalla contea di Yumin (YM1, YM2, YM3 e YM4). Campioni della steppa del deserto sono stati raccolti da Jiang Alhan (JA1, JA2, JA3, JA4, JA5 e JA6). I campioni di terreno che abbiamo raccolto provengono tutti dal terreno sulla superficie di C. salsa e dal suo sito parassitario ospite. Esemplari di voucher con

i numeri dei voucher da 20170510079-DT a 20170510091-DT sono stati depositati nell'erbario dell'Istituto per lo sviluppo di piante medicinali presso l'Accademia cinese delle scienze mediche a Pechino, in Cina. Dopo essere stati puliti, i tessuti succulenti dello stelo sono stati tagliati in piccoli pezzi, immediatamente congelati in azoto liquido e quindi conservati a -80 gradi fino a un'ulteriore elaborazione. I carotaggi sono stati prelevati a una profondità di 20 cm utilizzando

un trapano cilindrico in acciaio inossidabile con un diametro di 5 cm e poi conservato a -20 gradi in un frigorifero portatile. Dopo essere stati trasportati in laboratorio, i campioni di terreno sono stati passati attraverso un setaccio da 2 mm per rimuovere tessuti vegetali, radici, rocce e altri detriti e quindi conservati a -20 gradi in frigorifero prima di ulteriori esperimenti.

2.3. Estrazione del DNA e sequenziamento dell'rRNA 16S.

Il DNA del suolo è stato estratto utilizzando un kit di isolamento del DNA PowerSoil (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA) in conformità con il manuale. La purezza e la qualità del DNA genomico sono state controllate su gel di agarosio 0,8%. La regione ipervariabile V3-4 del gene batterico 16S rRNA è stata amplificata con i primer 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) e 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT).21 Per ogni campione di terreno, è stata aggiunta una sequenza di codici a barre di 10- cifre alla 5 ′ fine dei primer forward e reverse (Allwegene Co., Pechino). La PCR è stata eseguita su un Mastercycler Gradient (Eppendorf, Germania) utilizzando 25 μL di volumi di reazione contenenti 12,5 μL di KAPA 2G Robust HotStart ReadyMix, 1 μL di primer di inoltro (5 μM), 1 μL di primer inverso (5 μM), 5 μL di DNA (la quantità totale del modello è 30 ng) e 5,5 μL di H2O. I parametri del ciclo erano i seguenti: 95 gradi per 5 minuti, seguiti da 28 cicli di 95 gradi per 45 s, 55 gradi per 50 s e 72 gradi per 45 s, con un'estensione finale a 72 gradi per 10 minuti. Tre prodotti PCR per campione sono stati raggruppati per mitigare le distorsioni della PCR a livello di reazione. I prodotti della PCR sono stati purificati utilizzando un kit di estrazione di gel QIAquick (QIAGEN, Germania) e quindi quantificati utilizzando la PCR in tempo reale. Il sequenziamento profondo è stato eseguito su una piattaforma MiSeq da Allwegene Co. (Pechino). Dopo la corsa, l'analisi dell'immagine, l'identificazione delle basi e la stima degli errori sono state eseguite utilizzando Illumina Analysis Pipeline versione 2.6.

2.4. Analisi dei dati di sequenziamento dell'amplicone 16S rRNA.

Tutti i dati di sequenziamento sono stati inviati all'NCBI Short Archive (SRA) con l'invio SRA SUB7456002. I dati grezzi sono stati prima esaminati e le sequenze sono state rimosse sulla base delle seguenti considerazioni: sequenze inferiori a 200 bp con punteggio di bassa qualità (inferiore o uguale a 20) e contenenti basi ambigue o sequenze di primer e tag di codici a barre non corrispondenti. Le letture qualificate sono state separate utilizzando sequenze di codici a barre specifiche del campione e tagliate con Illumina Analysis Pipeline versione 2.6. Quindi i set di dati sono stati analizzati utilizzando QIIME. Le sequenze sono state raggruppate in unità tassonomiche operative (OTU) a un livello di somiglianza del 97 percento 22 per generare curve di rarefazione e calcolare indici di ricchezza e diversità. Lo strumento Ribosomal Database Project Classifier è stato utilizzato per classificare tutte le sequenze in diversi gruppi tassonomici, in cui la soglia di confidenza è impostata su 0.7.23 Le analisi di clustering sono state eseguite sulla base delle informazioni OTU da ciascun campione utilizzando R 3.6.1 per esaminare il somiglianza tra diversi campioni.24 La matrice delle distanze UniFrac tra le comunità microbiche di ciascun campione è stata calcolata utilizzando il coefficiente di Tayc e rappresentata come un metodo per gruppi di coppie non ponderato con albero di clustering della media aritmetica, che descrive la dissomiglianza ({17}} similarità) tra campioni multipli.25 Attraverso questa analisi è stato generato anche un file ad albero in formato Newick. La diversità alfa è stata applicata per analizzare la complessità della diversità delle specie per un campione utilizzando quattro indici, ovvero Chao1, specie osservate e Shannon e Fisher

indici di diversità. Questi indici sono stati calcolati utilizzando il software QIIME (Boulder, CO, USA) in Python (v.1.8.0) (La Jolla, CA, USA).26 L'analisi della diversità beta è stata utilizzata per valutare le differenze nei campioni in termini di complessità delle specie. La diversità beta è stata calcolata utilizzando l'analisi delle coordinate principali (PCoA) e l'analisi dei cluster in QIIME.27 L'analisi della varianza molecolare (AMOVA) è stata eseguita utilizzando la madre.28 Il test di Kruskal-Wallis è stato utilizzato per calcolare la differenza OTU tra i gruppi (valore p<0.05), and="" heat="" maps="" were="" drawn="" using="" pheatmap="" (r="" package).="" core="" microbiome="" analysis="" was="" adopted="" from="" the="" core="" function="" in="" the="" r="" package="" microbiome="" (sample="" prevalence="20%," relative="" abundance="0.01%)" by="" microbiomeanalyst29="" (https://www.="">

Per determinare i biomarcatori del microbioma sono stati utilizzati metodi di analisi discriminante lineare (LDA) e random forest (RF) nel sito Web di MicrobiomeAnalyst. Per prima cosa è stato eseguito un test fattoriale non parametrico di Kruskal-Wallis sum-rank per identificare le caratteristiche con significativa abbondanza differenziale considerando il fattore sperimentale o la classe di interesse. Successivamente, è stata eseguita LDA (la soglia è impostata su 2) per calcolare la dimensione dell'effetto di ciascuna caratteristica differenziale abbondante. Le caratteristiche sono state considerate significative sulla base del loro valore p aggiustato. Il valore di p-value aggiustato predefinito era 0.05. L'analisi RF è stata eseguita utilizzando il pacchetto randomForest5. Questo metodo utilizza un insieme di alberi di classificazione, ognuno dei quali è cresciuto tramite la selezione casuale di caratteristiche da un campione bootstrap in ogni ramo.

Tax4Fun (pacchetto R, http://tax4fun.gobics.de/) è stato utilizzato per prevedere i profili funzionali microbici dei microbiomi nei campioni di suolo. La tabella OTU Biom del microbioma del suolo è stata utilizzata come file di input per l'imputazione del metagenoma dei campioni di suolo di C. salsa. Quindi le abbondanze di classi geniche previste sono state analizzate al livello 3 del gruppo KEGG Orthology (KO). I risultati di Tax4Fun sono stati analizzati in Doby (pacchetto R).

2.5.Analisi di correlazione delle principali comunità microbiche e dei fattori bioclimatici.

Abbiamo utilizzato ArcGIS per estrarre numericamente i fattori bioclimatici chiave dai 13 punti di campionamento del suolo. L'analisi di ridondanza dei generi chiave delle comunità microbiche (cinque biomarcatori, cinque microbiomi principali) e dei fattori bioclimatici è stata eseguita utilizzando

Software Canoco 5. La conversione dei dati Log2 è stata eseguita in modo uniforme prima dell'analisi. I coefficienti di correlazione di Spearman sono stati calcolati per l'abbondanza di cinque biomarcatori, cinque microbiomi principali e l'integrazione dei dati dei fattori bioclimatici applicando SPSS. I risultati dell'analisi di correlazione sono stati disegnati da pheatmap (pacchetto R).

Cistanchepuò resistere all'invecchiamento

3. RISULTATI

Previsione dello spostamento della distribuzione globale di C. salsa nei diversi periodi. Il ROC calcolato ha mostrato

che il valore AUC era {0}}.977 (Figura S2), indicando che il modello concordava bene con i dati.30 Risultati della simulazione dell'idoneità dell'habitat per cinque periodi (LGM, MH, presente, 2050 e 2070 ) sono stati illustrati nella Figura 2 e nella Tabella 2. C. l'idoneità alla coltivazione della salsa è stata suddivisa in cinque categorie sulla base della soglia statistica: non idoneo (classe 5: 0-20 percento), marginale (classe 4: 20-50 percento), discreto (classe 3: 50-75 percento), buono (classe 2: 75-

90 percento) ed eccellente (classe 1: 90-100 percento). Questo articolo ha discusso solo le aree di distribuzione adatte per la classe 1, classe 2 e classe 3. Le attuali potenziali distribuzioni di C. salsa hanno indicato che questa specie era ampiamente distribuita in tre zone climatiche: clima temperato desertico, clima mediterraneo subtropicale e deserto tropicale regioni climatiche. Tutti i continenti, ad eccezione dell'Antartide, contengono regioni adatte per C. salsa. Queste regioni erano distribuite principalmente nell'Asia centrale e occidentale e nell'Africa settentrionale ed erano sparse nell'America settentrionale centrale e occidentale, nell'America meridionale centrale e nell'Oceania occidentale. Le aree idonee eccellenti (classe 1) erano le più distribuite in Egitto (76 750 km2), mentre le aree idonee buone (classe 2) e discrete (classe 3) erano le più ampiamente distribuite in Cina (classe 2: {{ 13}} km2 e classe 3: 1 024 600 km2). Le aree ecologicamente adatte in Asia erano principalmente limitate a Cina (classe 1: 45 775 km2), Giordania (classe 1: 16 075 km2), Israele (classe 1: 14 975 km2), Arabia Arabia (classe 1: 14 925 km2) e Iran (classe 1: 12 600 km2). Le aree adatte di C. salsa in Africa sono state distribuite principalmente in Egitto, Libia (classe 1: 34 400 km2) e Tunisia (classe 1: 275 km2). Le aree adatte per C. salsa in Sud America sono state distribuite principalmente in Cile (classe 1: 16 550 km2).

Da una prospettiva spaziale (figura 2), la tendenza al cambiamento regionale adatta per i cinque periodi prima è aumentata e poi è diminuita con l'area più ampia nel 2050 (figura 3a, figura S3). Abbiamo visto una forte diminuzione dell'area adatta di C. salsa all'interno dell'LGM rispetto a quella degli altri quattro periodi. Rispetto all'attuale (4 358 775 km2), le aree idonee sono diminuite del 50 percento ({7}} km2) nel periodo LGM, del 10 percento (MH: 3 910 350 km2) nel periodo MH, e dell'1% ({13}} km2) nel periodo 2070 ed è aumentato del 2% ({17}} km2) nel periodo 2050. In particolare, dal presente al futuro (dal 1960 al 2080), l'area eccellente (classe 1) per C. salsa si è gradualmente ridotta (presente, 243 200 km2; 2050, 232 425 km2; 2070, { {29}} km2).

Cistanchel'estratto ne ha moltiSalutebenefici

3.2. Previsione delle aree di distribuzione idonee di C. salsa in Cina e della gamma di variabili bioclimatiche.

Le aree adatte per la crescita di C. salsa in Cina erano principalmente limitate allo Xinjiang nordoccidentale, alla Mongolia interna centrale, allo Shaanxi settentrionale, allo Shanxi settentrionale, al Qinghai nord-orientale, al Gansu settentrionale e alla maggior parte del Ningxia (Figura 2b). Le aree più vocate della Cina erano distribuite principalmente nello Xinjiang, di cui l'area eccellente (classe 1) copriva 23 650 km2, la zona buona (classe

2) ha coperto 220 950 km2 e l'area fieristica (classe 3) ha coperto 189 975 km2. Tra le aree buone (classe 2), lo Xinjiang rappresentava il 60,99%, seguito dalla Mongolia Interna (86 300 km2) e dal Gansu ({11}} km2) rispettivamente con il 23,82% e il 6,75% (Figura 3b). I risultati del modello MaxEnt hanno indicato che lo Xinjiang era particolarmente adatto per la crescita di C. salsa. Tuttavia, diversi habitat, come il deserto di ghiaia, i prati e la steppa desertica, sono stati trovati nella stessa area durante le gite sul campo. Pertanto, eravamo molto interessati alle caratteristiche delle comunità microbiche del suolo e al loro rapporto con l'ambiente in diversi ecotipi di C. salsa a Tacheng, Xinjiang, Cina.

L'importanza di ciascuna variabile bioclimatica per la distribuzione di C. salsa è mostrata nella Tabella 2. Tutti i valori erano mezzi di 10 esecuzioni replicate. Le prime tre variabili bioclimatiche con la maggiore influenza sulla distribuzione di C. salsa sono state le precipitazioni del trimestre più secco (bio17), le precipitazioni del trimestre più caldo (bio18) e l'intervallo medio diurno (bio2) con tassi di contribuzione relativi di 25,81 percento, 17,65 percento e 13,70 percento, rispettivamente. Come indicato dalla curva di risposta ottenuta dal modello MaxEnt, l'intervallo del fattore bio potrebbe essere calcolato quando la probabilità di previsione superava 0,5. Ad esempio, l'intervallo di bio17 era compreso tra −135,30 e 11,34 mm, quello di bio 18 era compreso tra −206,60 e 4,40 mm e quello di bio2 era compreso tra 11,65 e 12,50 gradi.

3.3. Microbiomi del suolo da tre ecotipi di C. salsa che esibiscono comunità microbiche distinte e sovrapposte.

Il sequenziamento dell'rRNA 16S ha prodotto 518 217 letture grezze, tra le quali 441 576 sono state esaminate per qualità e lunghezza. Il set di dati conteneva 11 818-{4}} (media: 20 150) sequenze per campione. Le letture di alta qualità sono state raggruppate sulla base di

>97 percento di identità di sequenza in 2 788 OTU microbiche (Tabella 1).

La comunità microbica è stata classificata in 34 phyla e 321 generi. A livello di phylum (Figura 4a), Actinobacteria (DS, 31,94 percento; GD; 46,42 percento; GL, 33,33 percento), Proteobacteria (DS,

23,25 per cento; GD, 22,53 per cento; GL, 24,68 percento) e Gemmatimonadetes (DS, 17,77 percento; GD, 8,02 percento; GL, 8,36 percento) erano dominanti nei tre ecotipi. A livello di genere (Figura 4b), la steppa desertica era dominata da Euzebya (4,82 percento) e Arthrobacter (1,74 percento), mentre i generi più dominanti nel deserto di ghiaia erano Arthrobacter (8,35 percento) e Bacillus (4,95 percento). ). Bacillus (6,89%) e Arthrobacter (5,57%) erano dominanti nelle praterie. Le prime 10 comunità microbiche abbondanti nella steppa desertica sono state classificate in otto phyla (Figura 4c), quelle nel deserto di ghiaia sono state classificate in sette phyla (Figura 4d) e quelle nelle praterie sono state classificate in 10 phyla (Figura 4e ).

Le misurazioni della diversità all'interno del campione (-diversity) hanno rivelato un cambiamento di diversità dalla prateria al deserto di ghiaia e alla steppa desertica (Figura 4f). La -diversità delle comunità microbiche del suolo in ciascun campione è stata valutata sugli indici di diversità delle specie Shannon, Chao 1, Fisher e osservati. Gli indici Shannon, Chao 1, specie osservati e Fisher hanno suggerito che la -diversità delle comunità del suolo delle praterie

era superiore a quello delle altre due comunità ecotipiche. I risultati delle curve di rarefazione (Figura S5) erano simili ai risultati precedenti, ad eccezione di YM1 e HJ3. I risultati di AMOVA (Tabella S3) hanno mostrato che ci sono differenze significative (p < 0.01)="" tra="" i="" tre="" ecotipi.="" i="" risultati="" dei="" pcoas="" non="" vincolati="" dei="" grafici="" 2d="" a="" distanza="" unifrac="" non="" ponderati="" (figura="" 4g)="" hanno="" indicato="" che="" i="" campioni="" di="" suolo="" di="" microbiomi="" batterici="" di="" diversi="" ecotipi,="" ad="" eccezione="" di="" ym1="" e="" hj3,="" erano="" ben="" raggruppati.="" il="" raggruppamento="" dell'albero="" della="" diversità="" a="" distanza="" di="" bray="" basato="" sui="" risultati="" dell'algoritmo="" di="" raggruppamento="" singolo="" (figura="" 4h)="" dei="" tre="" campioni="" di="" suolo="" di="" ecotipi="" ha="" dimostrato="" che="" i="" campioni="" di="" praterie,="" eccetto="" ym2,="" erano="" strettamente="" raggruppati,="" i="" campioni="" di="" suolo="" della="" steppa="" desertica,="" eccetto="" ja1,="" erano="" strettamente="" raggruppati,="" ed="" i="" campioni="" di="" suolo="" del="" deserto="" di="" ghiaia="" erano="" strettamente="">

3.4. Screening differenziale del microbioma di tre ecotipi di C. salsa.

Le mappe di calore delle abbondanze di generi diversi (Figura 5a) indicavano che l'abbondanza di genere dei campioni della steppa desertica era diversa da quella dei campioni degli altri due ecotipi. Come mostrato nei risultati di

LEfSe (Figura 5c) e RF (Figura 5d), la mini mappa termica a destra indica l'abbondanza delle caratteristiche microbiche nei tre ecotipi a livello di genere. I generi che possono rappresentare l'ecotipo della steppa desertica includono Gillisia, Illumatobacter, Salegentibacter, Marinimicrobium, ecc. Variibacter è un

livello di genere che può rappresentare l'ecotipo ghiaia-deserto. I biomarcatori nell'ecotipo dei prati contengono Flavisolibacter e Agromyces. Dopo che i risultati dei due metodi sono stati combinati, sono stati selezionati 11 biomarcatori (Tabella S4). La Figura 5b mostra la mappa termica dell'abbondanza di 11 biomarcatori.

3.5. Screening del microbioma centrale e previsione della funzione metabolica dei tre ecotipi di C. salsa.

È stato tracciato un diagramma di Venn (Figura 5e) per le OTU ottenute da tutti i campioni di suolo ei risultati hanno mostrato che i tre ecotipi condividevano 1712 OTU. Il metodo di persistenza è stato adottato dalla funzione centrale nel microbioma del pacchetto R per identificare il microbioma centrale nei tre ecotipi di C. salsa. Questo microbioma batterico centrale conteneva sei OTU e corrispondeva al 19,64% dell'intero microbioma. Con l'esclusione dei generi non definiti e duplicati, queste OTU sono state classificate in sei generi e le loro abbondanze sono state tracciate in una mappa termica (Figura 5f).

I risultati della previsione funzionale (Figura 6, File supplementare 2) hanno suggerito che le vie metaboliche funzionali dei microbiomi del suolo nei tre ecotipi di C. salsa erano identiche nei carboidrati e che il metabolismo degli aminoacidi era abbondante tra le vie metaboliche. Anche il trasporto di membrana e la trasduzione del segnale erano abbondanti nell'elaborazione delle informazioni ambientali.

3.6.Analisi di correlazione tra comunità microbiche e variabili bioclimatiche di tre ecotipi di C. salsa.

L'analisi ridondante del nucleo, dell'abbondanza del microbioma del biomarcatore e delle variabili bioclimatiche è stata eseguita a livello di genere e la rianalisi è stata eseguita sulla base degli effetti. L'interpretazione corretta della varianza è stata del 32,5%. Le precipitazioni del trimestre più caldo (bio18) spiegano il 23,9% delle comunità microbiche (p=0.07). La temperatura media del quarto più caldo (bio10) e l'intervallo diurno medio (bio2) erano correlati positivamente con Illumatobacter e correlati negativamente con Bacillus (Figura 7a).

L'analisi di correlazione è stata condotta per il nucleo, l'abbondanza del microbioma del biomarcatore e sette variabili bioclimatiche. I risultati della rete di correlazione (Figura 7b) hanno rivelato che Illumatobacter e Salegentibacter (biomarcatori nella steppa desertica) erano significativamente correlati positivamente con l'intervallo medio diurno (bio2) e la temperatura media del quartiere più caldo (bio10), ma significativamente correlati negativamente con l'altitudine ( alt) e precipitazioni del quarto più caldo (bio18). Al contrario, Agromyces (biomarcatore nei prati) era correlato positivamente con l'altitudine (alt) e le precipitazioni del quartiere più caldo (bio18) ma era correlato negativamente con l'intervallo medio diurno (bio2) e la temperatura media del quartiere più caldo (bio10). Inoltre, Arthrobacter (microbioma centrale) era significativamente correlato negativamente con l'intervallo medio diurno (bio2) e la temperatura media del quarto più caldo (bio10). Rubrobacter era significativamente correlato positivamente con le precipitazioni annuali (bio12).