Parte 2 Rilevazione di cistanches Herba (Rou Cong Rong) Medicinali utilizzando firme nucleotidiche specifiche per specie

Cercando le firme dei nucleotidi sviluppate in questo studio, abbiamo scoperto che 15 dei 31 medicinali brevettati cinesi etichettati come contenentiCstanches Herbaconteneva invece adulteranti, inclusi otto ingredienti contraffatti e sette adulteranti (Tabella 2). Ad esempio, sei lotti sono stati sostituiti con Cy. songaricum, inclusi tre lotti di pillole Shihu Yeguang, un lotto di pillole Kangguzhi Zengsheng, un lotto di capsule Sanbao e un lotto di particelle Wenweishu.

Inoltre, lotti diversi dello stesso produttore hanno prodotto risultati leggermente diversi. Ad esempio, tra tre lotti di un produttore (ZCY16, ZCY69 e ZCY71), un lotto comprendeva una miscela di Ci.deserticoe Cy. songaricum, un lotto comprendeva una miscela diCi. deserticoeCi. tubulosae un lotto contenuto soloCi. tubulosa. Anche due lotti di un altro produttore (ZCY44 e ZCY70) differivano: un lotto conteneva Cy. songaricum, mentre l'altro lotto contenevaCi. deserticoeCi. tubulosa.

Cstanches Herbaè stato rilevato in 23 dei 31 medicinali brevettati cinesi testati (Tabella 2) e solo 16 campioni erano autentici, ad esempio senza adulteranti o ingredienti contraffatti.Ci. tubulosaè stato rilevato in 16 lotti di medicinali brevettati cinesi e Ci. deserticola è stata rilevata in 10 lotti. O. coerulescens non è stato rilevato in nessuno dei prodotti (Tabella 2).

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DISCUSSIONE

La necessità di sviluppare un nuovo metodo per il monitoraggio dei medicinali contenenti medicinali disponibili in commercioCistanceErba

Cstanches Herbaè un tonico ampiamente utilizzato nei medicinali brevettati cinesi e in altri prodotti medicinali. Tuttavia, il controllo di qualità dei medicinali brevettati cinesi rappresenta una grande sfida a causa della diversità e della complessità degli ingredienti. A causa della mancanza di controllo normativo, esiste una notevole possibilità di adulterazione o contraffazione del prodotto. Inoltre, tutti i prodotti devono essere lavorati in conformità con la Farmacopea o altri standard; durante l'elaborazione non sono consentite adulterazioni o contraffazioni. Pertanto, sono state stabilite varietà di metodi di controllo della qualità, come la cromatografia liquida bidimensionale multi-heart-cutting (Yao et al., 2015), la spettroscopia di riflettanza nel vicino infrarosso (Zhang e Su, 2014; Zhang et al., 2015 ) e cromatografia liquida-spettrometria di massa (Wang et al., 2016b). Tuttavia, i metodi di chimica analitica attualmente nella Chinese Pharmacopoeia Commission (2015) non possono essere utilizzati per autenticare tutti gli ingredienti nei medicinali brevettati cinesi o per rilevare la presenza di ingredienti adulteranti. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che i metaboliti mirati nelle piante vengono alterati durante la lavorazione del prodotto, determinando una notevole variabilità nei risultati dei test o il completo fallimento dei metodi di test (Ananingsih et al., 2013). Pertanto, gli strumenti molecolari come le firme di nucleotidi specie-specifiche sono pronti a rafforzare i sistemi di controllo della qualità contro il rischio di sostituzione fraudolenta del prodotto, adulterazione e inclusione di ingredienti non etichettati.

Sebbene ITS/ITS2 sia considerato uno strumento ad alta efficienza per l'identificazione di medicinali a base di erbe, queste sequenze non possono essere amplificate da campioni altamente elaborati (Newmaster et al., 2013; de Boer et al., 2015). Wang et al. ha riferito che ITS2 non poteva essere amplificato dall'estratto di Angelicae Sinensis Radix o dai decotti bolliti per più di 120 minuti (Wang et al., 2016a). Secondo le tecnologie tradizionali e la Chinese Pharmacopoeia Commission (2015), Cistanches Herba è sempre altamente elaborato per aumentarne l'efficacia medicinale; questi processi includono l'essiccazione in forno, la salatura e la cottura a vapore con il vino (Zou et al., 2017), che portano alla degradazione del DNA. Inoltre, durante la lavorazione vengono aggiunti vari eccipienti, come miele, amido e destrina. Se questi eccipienti non vengono rimossi completamente, la purezza del DNA ne risentirà. Ad esempio, il seguente processo di produzione viene utilizzato per generare capsule Sanbao contenenti Cistanches Herba: "Fai bollire due volte le fette medicinali per 1,5 h, unisci i decotti e filtra la miscela. Concentra il filtrato a una densità relativa di 1,20~1,25 (a 80 ◦C). Aggiungere le altre polveri macinate e unirle fino ad ottenere un composto omogeneo. Successivamente essiccare il composto a 60◦C, quindi tritarlo finemente

polvere." Tuttavia, dopo il processo di produzione sopra descritto, potrebbero verificarsi difficoltà durante l'estrazione del DNA di medicinali brevettati cinesi e frammenti lunghi potrebbero non essere amplificati dal DNA degradato, il che impedirebbe l'identificazione di adulteranti. Pertanto, per garantire il qualità e purezza del DNA, abbiamo aggiunto ulteriori passaggi prima dell'estrazione del DNA genomico, incluso il lavaggio con tampone di prelavaggio e l'eluizione di dieci provette parallele in una provetta per ogni lotto.

Sebbene tutti i medicinali brevettati cinesi utilizzati nel presente studio contenessero 6-25 ingredienti, le coppie di primer sviluppate potrebbero amplificare in modo specifico le sequenze degli adulteranti in questi medicinali brevettati cinesi. Il sequenziamento diretto dei prodotti PCR ha mostrato file di traccia puliti. Pertanto, questo metodo di firma del nucleotide è in grado di identificare sia gli ingredienti di specie autentiche che gli adulteranti e dovrebbe ampliare l'applicazione degli strumenti diagnostici molecolari basati sul DNA per la supervisione del mercato.

il danno e la malattia ai reni possono essere trattati da cistanche

Firme nucleotidiche per l'identificazione efficace delle cistanche Prodotti Herba

Gli strumenti molecolari che utilizzano la tecnologia PCR sono molto promettenti per l'autenticazione dei medicinali all'interno dei sistemi di controllo della qualità. L'applicazione di successo dei primer per l'identificazione di adulteranti degradati dal DNA da Cistanches Herba suggerisce che un metodo di rilevamento basato sulla PCR potrebbe essere ampiamente utilizzato. Nel mercato cinese della fitoterapia, il prezzo degli ingredienti autentici delle specie Cstanches Herba è più di cinque volte superiore ai prezzi dei suoi adulteranti. I nostri risultati hanno mostrato che Cy. songaricum è l'adulterante più comune di Cistanches Herba sul mercato, seguito da Ci. Sinensis. Ci. songaricum è stato aggiunto perché questi medicinali condividono caratteristiche morfologiche simili. Inoltre, la composizione chimica di Ci. sinensis è simile a quello di Cistanches Herba. Come marcatori di controllo qualità perCstanches Herbaestratti, echinacoside e acteoside possono essere estratti a buon mercato da Ci. sinensis. Pertanto, alcune fabbriche farmaceutiche utilizzano Ci. sinensis come sostituto nella produzione degli estratti di Cistanches Herba. Nel complesso, i risultati di questo studio indicano che esiste una notevole frode nel mercato dei medicinali.

L'adulterazione nella medicina brevettuale cinese è simile a quella riscontrata in altri paesi. Livelli simili di adulterazione sono stati registrati in Nord America (Newmaster et al., 2013), Europa (Raclariu et al., 2017) e Asia (Cheng et al., 2014; Shanmughanandhan et al., 2016; Gao et al. , 2017). In questo studio, il tasso di adulterato di medicinali brevettati cinesi era di circa il 48,4 per cento, con solo 16 dei 31 campioni che erano autentici Cistanches Herba. Inoltre, abbiamo ipotizzato che i diversi risultati ottenuti con i prodotti dello stesso produttore potessero essere attribuiti a differenze nelle qualità dei diversi lotti di materiali della medicina cinese. Pertanto, per controllare la qualità dei medicinali brevettati cinesi, le materie prime dovrebbero essere autenticate prima di essere trasformate in prodotti.

Adulterazione diCstanches Herbaè stato tradizionalmente associato a problemi di domanda e offerta di materie prime.Ci. deserticoeCi. tubulosasono le due piante originarie attualmente utilizzate per la formulazioneCstanches Herba. Tuttavia, Ci. deserticola è l'unica specie originale nelle tradizionali autentiche Cstanches Herba elencate nella Chinese Pharmacopoeia Commission (2000), in cui Ci. tubulosa è identificato come adulterante. A causa della carenza di Ci. risorse della deserticola,Ci. tubulosaè stato elencato come integratore nella farmacopea cinese dal 2005 (Jiang e Tu, 2009). Fino a poco tempo, i prezzi di queste erbe erano notevolmente diversi; Ci. tubulosa è stata molto meno costosa di Ci. deserticola perché della prima c'è un'offerta molto maggiore. Qui, i nostri risultati hanno mostrato che Ci. tubulosa è più ampiamente utilizzato nei prodotti Cstanches Herba disponibili in commercio.

In conclusione, le firme dei nucleotidi e basate sulla PCR

i metodi sviluppati in questo studio possono servire come strumenti utili per l'industria dei medicinali per autenticare gli ingredienti e rilevare gli adulterantiCistanceProdotti Herba. In base al risultato della sensibilità, anche se la proporzione di adulterante era uno su diecimila, può essere rilevata tramite qRT-PCR. Significa che una volta rilevata una firma nucleotidicaCistanceProdotti funzionali contenenti erbe, potrebbe essere identificato come ingrediente adulterante o contraffatto. È stata fornita una nuova soluzione per rilevare ingredienti contraffatti o Cstanches Herba adulterati che non era precedentemente disponibile tramite metodi di rilevamento chimico nella farmacopea cinese. Inoltre, questo metodo potrebbe essere utilizzato per convalidare tipi crescenti di farmaci e per ampliare le applicazioni degli strumenti diagnostici molecolari basati sul DNA per la supervisione del mercato.

Per alleviare ilcronicorenepatologiainsieme acistanche

CONTRIBUTI D'AUTORE

JH ha ideato lo studio e ha partecipato alla sua progettazione. XW, RX e JC hanno fornito campioni ed eseguito gli esperimenti. XW ha analizzato i dati. XW, JH, ZZ, S-GN, JS e SC hanno redatto il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

FINANZIAMENTI

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [numero di sovvenzione 81673552], CAMS Innovation

Fund for Medical Sciences [numero di sovvenzione 2016-I2 M- 3-016] e United Fund Key Project della National Natural Science Foundation of China [numero di sovvenzione U1403224].

RINGRAZIAMENTI

Vorremmo ringraziare i nostri colleghi che hanno aiutato con la raccolta dei campioni, l'identificazione, il lavoro di laboratorio e la preparazione del manoscritto, inclusi Chaokui Sun, Dianyun Hou e Piao Zhang.

MATERIALE SUPPLEMENTARE

Il materiale supplementare per questo articolo è disponibile online all'indirizzo: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018. 01643/full#materiale-suppletivo

Figura supplementare S1|Il risultato dell'allineamento della sequenza ITS2 da sei specie.

Figura supplementare S2|Elettroforesi su gel di agarosio di tutti i campioni.

Tabella Supplementare S1|Informazioni di campionamento di Cistanches Herba e dei suoi adulteranti.

Tabella Supplementare S2|Informazioni sulla sequenza delle specie correlate scaricate da GenBank.

Tabella Supplementare S3|Le composizioni dichiarate di diversi campioni di medicina brevettuale cinese.

Scheda Tecnica Supplementare S1|Tutte le sequenze ottenute in questo studio.

Cistanchedeserticola ha molti effetti

RIFERIMENTI

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Dichiarazione sul conflitto di interessi: gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di rapporti commerciali o finanziari che potrebbero essere interpretati come un potenziale conflitto di interessi.

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