Parte 2: echinacoside induce la morte delle cellule tumorali apoptotiche inibendo l'enzima igienizzante del pool nucleotidico MTh1

l'echinacoside induce la morte delle cellule tumorali apoptotiche inibendo l'enzima igienizzante del pool nucleotidico MTh1

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Risultati

Identificazione dell'echinacoside come inibitore di MTh 1

Per cercare composti naturali in grado di inibire MTH1, abbiamo utilizzato la reazione enzimatica catalizzata da MTH1 come un alto rendimento nel test di screening in vitro. Oltre ai nucleotidi purinici ossidati, MTH1 può anche idrolizzare la normale deossiguanosina trifosfato per generare deossiguanosina monofosfato e pirofosfato. In presenza di pirofosfatasi inorganica in eccesso, tutti i pirofosfati vengono convertiti in fosfati inorganici, che possono essere quantificati utilizzando un saggio di assorbanza a base verde di malachite,41 consentendo così la misurazione indiretta dell'attività di MTH1.32 Per testare il sistema di dosaggio, abbiamo prima misurato l'effetto di(S)-crizotinib, un composto con comprovata potenza come inibitore MTH1.33 Il risultato ha mostrato che (S)-crizotinib ha effettivamente inibito potentemente MTH1 (Figura 1A) con un IC50 di500 nM, che era sette volte superiore a quello riportato da Huber et al (72 nM).33 Ciò era probabilmente dovuto alle differenze nei metodi di rilevamento o nelle fonti di sostanze chimiche ed enzimi. Abbiamo adottato un approccio cromogenico meno sensibile, mentre Huber et al hanno utilizzato un metodo bioluminescente altamente sensibile.33 Tenendo presente questo, abbiamo esaminato 12 composti naturali disponibili in commercio (Tabella S1), ognuno dei quali è un ingrediente importante delle erbe tradizionali con potenziale attività antitumorale.Echinacoside, un composto purificato dalla pianta medicinale parassita Cistanche salsa (Figura 1C), ha inibito significativamente la reazione (Figura 1B), con un IC50 di 7.01±2.13 μM (Figura 1D). L'aggiunta di 50 volte più pirofosfatasi non ha avuto alcun impatto sul risultato, mentre l'aggiunta di cinque volte di piùMTH1proteina ha ridotto significativamente il grado di inibizione, suggerendo cheEchinacosidespecificamente inibito l'attività di MTH1 nel saggio enzimatico in vitro.

L'echinacoside ha inibito l'MTh 1 cellulare per aumentare l'8-oxog intracellulare

Successivamente, abbiamo chiesto seEchinacosidepuò inibire l'attività intracellulare di MTH1. L'inibizione dell'MTH1 cellulare comporterà l'aumento dell'8-oxoG intracellulare. L'avidina ha dimostrato di legarsi all'8-oxoG con elevata specificità;42 pertanto, abbiamo usato la colorazione immunofluorescente con avidina coniugata con Cy3 per confrontare i livelli intracellulari di 8-oxoG in varie linee cellulari tumorali prima e dopoEchinacosidetrattamento. L'osteosarcoma MG-63 umano, l'epatocarcinoma SK-HEP-1, il carcinoma mammario MCF-7 e le cellule tumorali del colon-retto SW480 sono stati trattati con 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM o 80 μM Echinacoside per 5 ore, 12 ore o 24 ore. La colorazione con avidina coniugata con Cy3 ha rivelato che il trattamento con 60 μM di echinacoside per 24 ore ha aumentato chiaramente e significativamente il livello di 8-oxoG cellulare (sostanza reattiva Cy3-avidina) in queste cellule tumorali (Figura 2A e B). Maggiore concentrazione (80 μM) diEchinacosideha portato a una colorazione cellulare 8-oxoG più forte (Figura 2B), suggerendo una relazione dose-risposta. Risultati simili sono stati ottenuti

mediante colorazione immunofluorescente con un anticorpo monoclonale anti-8-oxoG di topo (Figura S1A).43 La concentrazione diEchinacoside(60 μM) richiesto per un aumento significativo dell'8-oxoG cellulare era molto più alto dell'IC50 (7,01 μM) del test in vitro. Ciò era probabilmente dovuto alla differenza di sensibilità dei due saggi. La colorazione immunofluorescente è molto meno sensibile del saggio enzimatico in vitro; inoltre, il numero di molecole inibitrici che possono raggiungere e interagire con mTH1 cellulare è influenzato da processi biologici complessi; inoltre, nel test in vitro, il dGTP meno preferito viene utilizzato come substrato, e quindi può essere più facile (prendere meno inibitori) inibire MTH1, con conseguente IC50 inferiore nel test in vitro.

Leanticancroeantiossidanteeffetti diechinacosideDaCistanchedeserticola

L'8-oxoG cellulare è generato da ROS, che è antagonizzato dagli antiossidanti. Pertanto, un aumento dei ROS cellulari o la soppressione dell'attività degli antiossidanti comporterebbe anche un aumento del livello cellulare di 8-oxoG.Echinacosideesso stesso è un potente antiossidante44,45 e quindi dovrebbe migliorare piuttosto che sopprimere l'attività degli antiossidanti. Per esaminare se il livello di ROS cellulare è stato modificato daEchinacosidele stesse cellule tumorali sono state trattate con 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM o 80 μM Echinacoside per 5 ore, 12 ore o 24 ore e poi analizzate mediante citometria a flusso dopo la colorazione con la sonda fluorescente 2′,7′-diclorofluoresceina diacetato. I risultati hanno mostrato che nessuno di questi trattamenti ha cambiato i livelli di ROS cellulare (Figura 2C e D). Pertanto, l'aumento del livello cellulare di 8-oxoG molto probabilmente è il risultato dell'inibizione di MTH1 da parte dell'echinacoside.

echinacosidel'incorporazione di 8-oxoG nel DNA nel DNA stimolerà BER e MMR, che generano rotture e lacune del DNA a singolo filamento (SSB) e lacune.16,17 Normalmente, queste rotture e lacune sono sigillate da meccanismi di riparazione che coinvolgono il riempimento e la legatura delle lacune da parte delle DNA polimerasi e delle ligasi.46,47 Tuttavia, rapidi aumenti dell'SSB cellulare possono saturare la capacità di riparazione cellulare, portando alla formazione di numerose rotture del DNA a doppio filamento (DSB)18 e segnalazione DDR. Per esaminare se l'opzioneEchinacoside-l'aumento indotto di 8-oxoG cellulare ha causato danni al DNA, abbiamo esaminato uno dei primi marcatori di danno al DNA, 53BP1, che si lega ai siti diDSB come la prima risposta cellulare a DSB.48 Le linee cellulari di cancro MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 e SW480 e le linee cellulari non tumorali fegato umano normale L-O2,49 rene embrionale umano HEK 293 e fibroblasto di topo NIH /3T3 sono stati trattati con 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM o 80 μM Echinacoside per 5 ore, 12 ore o 24 ore. L'immunocolorazione fluorescente ha mostrato che il trattamento con Echinacoside da 60 μM per 24 ore ha aumentato specificamente il numero di cellule con cinque o più focolai nucleari 53BP1 fortemente colorati in tutti i tumori ma non in nessuna delle linee cellulari non tumorali (Figura 2E e F). Un aumento significativo del numero di cellule 53BP1+ è stato osservato già 5 ore dopo l'inizio del trattamento con echinacosidi (Figura 2F). Una concentrazione più elevata (80 μM) di Echinacoside o un tempo di trattamento più lungo (12 ore e 24 ore) ha comportato un aumento maggiore sia del numero di cellule 53BP1+ (Figura 2F) che del numero di focolai cellulari 53BP1. Insieme, questi risultati suggeriscono che l'inibizione di MTH1 da parte dell'echinacoside ha causato l'accumulo di 8-oxoG e ampi danni al DNA nel cancro ma non nelle cellule non tumorali.

echinacoside soppressa la proliferazione delle cellule tumorali

Nelle cellule cicliche, le rotture del filamento di DNA non riparate causeranno un collasso delle forche di replicazione del DNA, che porteranno quindi al blocco della proliferazione cellulare per induzione dell'arresto del ciclo cellulare e dell'apoptosi.50 Per verificare gli effetti diEchinacosidesulla crescita e la proliferazione cellulare, abbiamo prima analizzato la crescita delle cellule tumorali MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 e SW480 trattate con echinacoside da un test di formazione di colonie. I risultati hanno mostrato che le cellule tumorali trattate con 60 μM o 80 μMEchinacosideformarono molte meno colonie e le colonie che si formarono erano molto più piccole (Figura 3A e B), indicando un potenziale di crescita notevolmente soppresso. Successivamente, abbiamo analizzato la proliferazione di queste cellule tumorali, insieme alle cellule non tumorali L-O2, HEK 293 e NIH / 3T3 mediante un test MTT. I risultati hanno mostrato che l'echinacoside dose-dipendente ha inibito la proliferazione del cancro ma non le cellule non tumorali (Figura 3C). Lo studio a tempo di cellule tumorali trattate con Echinacoside da 60 μM ha mostrato che dopo 5 ore non vi era alcuna differenza significativa tra i gruppi di non trattamento e trattamento, ma dopo 12 ore, la proliferazione delle cellule tumorali era significativamente inibita di 60 μMEchinacoside(Figura 3D).

fasi del ciclo cellulare mediante citometria a flusso hanno rivelato cheEchinacosideil trattamento ha ridotto in modo dose-dipendente la percentuale di cellule in entrambe le fasi S e G2/M, mentre la percentuale di cellule nella fase G1 è aumentata (Figura 4C e D). Dopo 80 μM di trattamento con echinacosidi delle cellule MG-63 per 24 ore, le cellule nella fase G2/M sono diminuite dal 15% a quasi zero e le cellule nella fase S sono diminuite dal 37% al 17%, mentre le cellule nella fase G0/1 sono aumentate dal 43% all'80% (Figura 4E). Questi risultati indicano che il trattamento conEchinacosideindotto l'arresto del ciclo cellulare e bloccato le cellule tumorali nella fase G1.

Apoptosi indotta da echinacoside nelle cellule tumorali

Coerentemente con le osservazioni sulla proliferazione cellulare, l'analisi Western blot ha mostrato che il trattamento con 60 μM e 80 μMEchinacosideper 24 ore ha aumentato i livelli di caspasi-3 attiva e di proteine polimerasi scisse (ADP-ribosio) nelle cellule tumorali (Figura 5A e B), suggerendo l'induzione dell'apoptosi caspasi-dipendente. Abbiamo quindi esaminato diversi marcatori cellulari di apoptosi. In primo luogo, la morfologia nucleare diEchinacoside-le cellule tumorali trattate sono state rivelate mediante colorazione con il colorante DNA DAPI, che ha dimostrato che il trattamento di 24 ore con 60 μM e 80 μMEchinacosideha aumentato il numero di segni distintivi dell'apoptosi, tra cui la pyknosis e la cromatina condensata (nuclei più luminosi) (Figura 5C). In secondo luogo, il DNA estratto da cellule tumorali trattate in modo simile è stato analizzato mediante elettroforesi su gel di agarosio, che ha rivelato un tipico modello di scala apoptotica (Figura S1B). Infine, la caspasi-3 attiva cellulare è stata rilevata mediante colorazione immunofluorescente, che ha rivelato forti segnali di caspasi-3 attivati inEchinacoside-cellule tumorali trattate (Figura S1C).

Successivamente, la percentuale di cellule apoptotiche è stata misurata mediante Annexin V-FITC e PI doppia colorazione e citometria a flusso. Analisi di cellule trattate con 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM o 160 μMEchinacosideper 2 ore, 5 ore, 12 ore o 24 ore hanno mostrato che concentrazioni di 60 μM o superiori diEchinacosideha indotto un'apoptosi significativa nelle cellule tumorali MG-63, SK-HEP-1, MCF-7 e SW480 (Figura 6A), ma non nelle cellule non tumorali L-O2, HEK 293 e NIH/3T3 (Figura S2). Dopo il trattamento di cellule MG-63 con 60 μM, 80 μM o 160 μMEchinacosideper 24 ore, la percentuale di cellule apoptotiche è aumentata rispettivamente dall'8,89% al 33,72%, 39,01% e 48,12% (Figura 6A). Lo studio del corso temporale ha mostrato che dopo 5 ore, non vi era alcuna differenza significativa tra i gruppi di non trattamento e di trattamento, ma è stata osservata un'apoptosi significativa dopo il trattamento con concentrazioni di Echinacoside 60 μM o superiori per 12 ore (Figure 6B e S3).

Infine, la misurazione del potenziale di membrana mitocondriale mediante il colorante fluorescente JC-1 ha mostrato chiaramente una notevole perdita del potenziale di membrana mitocondriale dopo il trattamento con 60 μMEchinacosideper 12 ore (Figura 6C), ma non dopo 5 ore, indicando l'attivazione della via dell'apoptosi intrinseca a seguito dei danni al DNA causati da elevati 8-oxodG.

Leanti-cancroe gli effetti antinfiammatori dicistanche echinacoside

Discussione

Echinacosideè un composto naturale isolato dalle piante medicinali Cistanche ed echinacea.51,52 È stato dimostrato che possiede versatili proprietà promozionali per la salute e preventive della malattia, tra cui protezione neurale, epatoprotezione, anti-infiammazione, antifatica, antisenescenza, antidiabete e attività antitumorali.53-58 La bioattività più conosciuta e accettata diEchinacosideè la sua azione antiossidante e ROS-scavenging;44,45 tuttavia, è stato anche dimostrato che causa danni ossidativi al DNA nelle cellule tumorali, con i meccanismi sottostanti che rimangono poco chiari.58 Nel presente studio, utilizzando un test di screening in vitro ad alto rendimento, abbiamo scoperto cheEchinacosideha efficacemente inibito la reazione enzimatica catalizzata da MTH1. L'aumento della quantità dell'enzima MTH1 ha diminuito il grado di inibizione mentre l'aumento della quantità di pirofosfatasi inorganica non ha influenzato l'inibizione, indicando che l'echinacoside ha specificamente inibito l'attività di MTH1 nel test in vitro. Il trattamento di diverse linee cellulari tumorali umane con Echinacoside ha causato un aumento significativo del livello cellulare di 8-oxoG senza modificare il livello di ROS cellulare. Dato che l'echinacoside stesso è un potente antiossidante, questi risultati hanno suggerito che l'aumento del livello intracellulare di 8-oxoG era probabilmente il risultato dell'inibizione dell'MTH1 cellulare da parte dell'echinacoside.

Trattamento conEchinacosideha causato estesi danni al DNA e una significativa sovraregolazione del bloccante G1/S-CDK p21, che sono stati seguiti da marcata morte cellulare apoptotica e soppressione della proliferazione cellulare specificamente nel cancro ma non nelle cellule non tumorali. Inoltre, una notevole perdita di potenziale di membrana mitocondriale dopo

Echinacosideil trattamento ha indicato l'attivazione della via dell'apoptosi intrinseca.Echinacoside-danni al DNA indotti e sovraregolazione di p21 sono stati osservati entro 5 ore dal trattamento, mentre l'apoptosi delle cellule tumorali, l'interruzione del potenziale di membrana mitocondriale e l'inibizione della crescita sono state osservate 12 ore dopo l'inizio del trattamento. Questi dati supportano che l'apoptosi delle cellule tumorali e l'inibizione della crescita erano i risultati degli estesi danni al DNA causati dall'inibizione di MTH1. Studi recenti hanno dimostrato che una riduzione delle dimensioni del pool cellulare di dNTP potrebbe anche indurre stress di replicazione del DNA e danni al DNA.59,60 Tuttavia, l'aumento del 200% del livello di 8-oxoG nelle cellule tumorali trattate con echinacoside argomenta contro la possibilità di una riduzione delle dimensioni del pool dNTP e Bcl2, una proteina che riduce le dimensioni del pool dNTP,60 è stato significativamente ridotto nelle cellule tumorali SW480 trattate con echinacoside;58 inoltre, i nostri dati hanno mostrato chiaramente che l'echinacoside ha inibito direttamente l'MTH1, che potrebbe essere almeno parzialmente responsabile dei danni al DNA e degli effetti cellulari causati dall'echinacoside.

Il pool dNTP è un bersaglio critico dei ROS e i dNTP ossidati sono importanti fonti di danni al DNA ossidativo.3,10 Gli SSB e i DSB del DNA associati alla riparazione possono portare a senescenza cellulare e apoptosi, che sono implicati nell'invecchiamento e in un alto grado di eterogeneità intratumorale e alti tassi di mutazione nelle cellule tumorali. Al contrario, l'inibizione di MTH1 prende di mira un fenotipo che distingue la maggior parte delle cellule tumorali dalle cellule normali e quindi rappresenta una nuova strategia antitumorale che non è limitata da adattamenti genetici. È interessante notare che sono stati sviluppati antagonisti di piccole molecole della proteina antiapoptosi Bcl266,67 e agonisti della proapoptosi Bax68 e hanno dimostrato di essere promettenti nuovi agenti antitumorali. Dati i loro meccanismi d'azione complementari, la combinazione di inibitori MTH1 e sostanze chimiche che promuovono l'apoptosi creerebbe una nuova entusiasmante generazione di farmaci antitumorali.

Per la prima volta, abbiamo dimostrato una nuova funzione per l'echinacoside come composto naturale antitumorale. Nel test in vitro, Echinacoside ha inibito MTH1 con un IC50 di 7,01 μM. Questo valore IC50 è superiore a quello degli inibitori MTH1 riportati finora.32,33,69 Usando (S)-crizotinib come controllo positivo, abbiamo dimostrato che il nostro test è sette volte meno sensibile di quello utilizzato da Huber et al.33 Pertanto, l'IC50 effettivo di Echinacoside è probabilmente inferiore. Tuttavia, per svilupparlo come agente terapeutico, l'efficacia della molecola naturale di echinacoside dovrà probabilmente essere migliorata. Come prodotto naturale che è stato usato come medicina a base di erbe per molto tempo, l'echinacoside potrebbe servire come una buona impalcatura chimica per lo sviluppo di inibitori MTH1 efficienti e probabilmente sicuri.37,70 Dato che i prodotti naturali sono stati una ricca fonte di nuovi scaffold chimici per una progettazione razionale di farmaci basata sulla struttura,70 approcci simili a quelli che abbiamo usato qui,

insieme ai vasti interessi nei prodotti naturali per la scoperta di farmaci, sarà utile per trovare nuovi farmaci basati su bersagli, efficaci e sicuri.

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