Parte 2 Le mutazioni ERCC1 impediscono la riparazione del danno al DNA e causano disfunzione epatica e renale nei pazienti

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Discussione

Un nuovo caso di bi-allelicoERCC1mutazioni Solo due individui con bi-allelicoERCC1ad oggi sono state segnalate mutazioni, entrambe mostravano caratteristiche simili a CS. L'individuo più gravemente colpito (165TOR) aveva una variante senza senso (Q158X) e una variante missenso F231L nel motivo (HhH)2 di ERCC1 (Fig. S5 F), mostrava ritardo di crescita, fallimento dello sviluppo e contratture, ed è morto dopo il primo anno di vita per polmonite (Jaspers et al., 2007). Il secondo individuo affetto (CS20LO) presentava contratture, microcefalia e ipertonia ed era omozigote per la variante missenso F231L ed è morto nel secondo anno di vita (Kashiyama et al., 2013).

Segnaliamo due fratelli con bi-allelicoERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) e un allele nullo dovuto a una delezione intragenica ereditata dalla madre. Tutta la restante proteina ERCC1 espressa nelle cellule di questi pazienti porta la sostituzione dell'amminoacido R156W, che interrompe un ponte salino tra il residuo R156 caricato positivamente e il residuo D129 caricato negativamente opposto situato appena sotto la tasca di legame dell'XPA nel dominio centrale diERCC1. L'impatto di questa sostituzione è duplice: (1) diminuisce fortemente la stabilità complessiva di ERCC1 e del suo partner di legame XPF e (2) influisce in modo specifico sull'interazione con XPA (Fig. 9).

Livelli ridotti di proteine ​​nucleari di ERCC1 a causa di un parziale ripiegamento errato

Le analisi Western blot e immunofluorescenza hanno rivelato che nel complessoERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>T) nell'endogenoERCC1locus delle cellule RPE1-hTERT. È interessante notare che la completa perdita di ERCC1 nei topi ha portato alla morte entro 4 settimane, mentre l'aumento dei livelli proteici a circa il 15% dei livelli nei topi WT ha aumentato di cinque volte la durata della vita (Weeda et al., 1997), suggerendo che anche bassi livelli di ERCC1 aumentare notevolmente il potenziale di redditività. Coerentemente con i nostri risultati, studi precedenti hanno dimostrato che le mutazioni missenso nel dominio centrale diERCC1generalmente causano destabilizzazione (Sijbers et al., 1996b), indicando che questa regione è importante per la stabilità delle proteine.

La struttura di microscopia elettronica criogenica recentemente segnalata dell'intera lunghezzaERCC1-L'eterodimero XPF (Jones et al., 2020) rivela che ilERCC1R156il residuo si trova sul bordo estremo dell'eterodimero. Ipotizziamo che l'aumento dell'ingombro e l'alterata struttura elettronica della sostituzione di un'arginina con il triptofano non solo disturbi la tasca di legame dell'XPA ma anche l'interfaccia di dimerizzazione tra il dominio centrale di ERCC1 e il dominio nucleasico di XPF, causando una destabilizzazione generale (Fig. S5F). Di interesse, la variante missenso XPFR799W si trova nella stessa interfaccia sul lato XPF (Fig. S5 F) e provoca anche destabilizzazione e livelli di proteine ​​XPF gravemente ridotti (Mori et al., 2018). In un individuo affetto (CALIF1010) che presentava caratteristiche simili a CS e progeroidi segmentali, la variante XPFR799W è stata ereditata insieme a una delezione intergenica nell'altro allele XPF, risultando in un forte difetto NER combinato con un lieve difetto di riparazione dell'ICL (Mori et al., 2018), simili ai fratelli riportati in questo studio.

Espressione ectopica di una versione inducibile diERCC1R156Wfor24 h ci ha permesso di raggiungere i livelli di WT di questa proteina mutante, che ha provocato una localizzazione errata nel citoplasma, una ridotta interazione con XPF e una maggiore interazione con gli chaperone che ripiegano le proteine, come rilevato dalla SM. Tutti questi risultati supportano l'idea cheERCC1R156Wè parzialmente ripiegato in modo errato e degradato nelle cellule dei pazienti, determinando una riduzione del -80 percento dei livelli di proteina nucleare ERCC1. Il KI di ERCC1R156W nelle celle RPE1-hTERT supporta questa conclusione.

Quando si confronta ilERCC1e livelli di proteina XPF nelle cellule PV46LD e PV50LD con quelli nelle cellule di individui più gravemente colpiti (165TOR e CS20LO), abbiamo notato che questi livelli erano comparabili, o forse anche inferiori, nelle cellule dei fratelli descritti in questo studio (Fig. 3 C e Fig. S3, E ed F; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). Si noti che CS20LO è omozigote per ERCC1F231L, mentre 165TOR è eterozigote e comporta un ulteriore arresto prematuro sull'altroERCC1allele (Q158X). Questi risultati suggeriscono che oltre alla riduzione dei livelli proteici, la funzionalità della proteina mutante che è ancora espressa e la combinazione dei due alleli mutati devono essere presi in considerazione come potenziale modulatore della gravità e dell'espressività fenotipica.

ERCC1R156W: Impatto differenziale sui percorsi di riparazione del DNA dipendenti da ERCC1-

L'espressione di ERCC1R156W-GFP nelle cellule ERCC1-KO a livelli simili a ERCC1WT ci ha consentito di districare l'impatto della sostituzione dell'amminoacido sulla stabilità delle proteine ​​dall'impatto sulla funzionalità delle proteine. Sebbene la proteina mutante ERCC1R156W sia stata gravemente compromessa nella sua interazione indotta dai raggi UV con XPA e pesce e non sia riuscita a localizzarsi in modo efficiente nei siti di lesioni del DNA indotte dai raggi UV, abbiamo comunque rilevato una notevole attività di riparazione (~40 percento) nei test UDS, sopravvivenze clonogeniche, e saggi NER in vitro. Questi risultati suggeriscono che una proteina ERCC1 mutante che interagisce solo molto debolmente con il complesso NER può ancora supportare livelli considerevoli di attività NER (~40 percento) all'interno delle cellule. Insieme, questi risultati suggeriscono che il basso livello di espressione di ERCC1 (~20 percento) combinato con l'attività GGR residua delle proteine ​​mutanti che sono ancora espresse fornisce una protezione sufficiente per impedire a PV46LD e PV50LD di sviluppare XP in piena regola. In effetti, l'attività GGR residua è stata ancora rilevata in condizioni più sensibili nei test UDS rispetto ai fibroblasti di un paziente XP-A gravemente colpito e incline al cancro. Tuttavia, entrambi i pazienti potrebbero essere ancora a rischio di sviluppare il cancro della pelle e pertanto si consiglia di proteggersi dalla luce solare. L'attività residua nelle cellule PV46LD e PV50LD era simile o inferiore all'attività di riparazione che abbiamo rilevato nelle cellule 165TOR o CS20LO (Fig. 6 J; Jaspers et al., 2007; Kashiyama et al., 2013). La gravità clinica, quindi, non è correlata all'attività del NER ma è probabilmente dovuta a un ruolo di ERCC1 al di fuori del NER che è importante durante lo sviluppo.

Nonostante i nostri risultati secondo cui ERCC1R156W ha mostrato un'interazione ridotta con SLX4 ed è stato anche reclutato in modo meno efficiente nei siti di induzione locale di ICL, ulteriori analisi hanno rivelato che la proteina mutante ERCC1R156W era solo leggermente influenzata nel supportare la riparazione di ICL quando espressa ectopicamente in ERCC1- cellule KO. Tuttavia, l'impatto sulla riparazione dell'ICL è stato molto più lieve dell'impatto della sostituzione R156W sul NER, che, combinato con i risultati precedenti secondo cui la riparazione degli ICL richiede molto meno proteina ERCC1 rispetto alla riparazione delle lesioni del DNA specifiche del NER (Jaspers et al. , 2007; Sijbers et al., 1996b), potrebbe benissimo spiegare il lieve impatto sulla riparazione dell'ICL. Nei fibroblasti dei pazienti, che hanno livelli fortemente ridotti di ERCC1, abbiamo rilevato una sensibilità moderata, nonché un'aumentata rottura del cromosoma in seguito all'esposizione al composto MMC che induce l'ICL, anche se molto più lieve delle cellule di un paziente AF che sono state incluse in parallelo. È importante sottolineare che né PV46LD né PV50LD hanno mostrato segni evidenti di caratteristiche cliniche simili a FA, suggerendo che la proteina mutante ERCC1R156W fornisce una protezione sufficiente contro il basso carico endogeno di ICL in questi pazienti.

La carenza di ERCC1 provoca insufficienza epatica e renale

I topi che sono KO per ERCC1 o XPF mostrano una corsa grave (cioè, più piccoli e più deboli dei topi WT) e muoiono prima delle prime 4 settimane di vita a causa di una grave insufficienza epatica (McWhir et al., 1993; Sijbers et al., 1996b; Tian et al., 2004; Weeda et al., 1997). L'espressione epatica di ERCC1 in questi topi ha parzialmente corretto le dimensioni più piccole e ha esteso la durata della vita fino a 12 settimane, ma ha anche smascherato gravidisfunzione renalee insufficienza renale come causa secondaria di morte (Selfridge et al., 2001). I topi KO specifici per XP o FA non mostrano malattie del fegato, suggerendo che questo fenotipo non è causato da un difetto di riparazione NER o ICL. È possibile che la ridondanza parziale tra questi due percorsi, che viene persa nei topi ERCC1-KO carenti in entrambi i percorsi, possa spiegare questo fenotipo. In linea con questa idea, epatociti ecellule dei tubuli prossimali del reneè diventato poliploide nei topi ERCC1-KO e ha accumulato livelli elevati di p53 (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997), suggerendo che l'accumulo di danni al DNA endogeno in questi organi potrebbe capitare. La natura precisa di questa lesione endogena del DNA, tuttavia, rimane poco chiara.

È interessante notare che i topi con inattivazione articolare sia della riparazione di NER che di ICL non mostrano disfunzione epatica, suggerendo che la ridondanza tra questi percorsi di riparazione del DNA non è l'unica spiegazione e che una funzione aggiuntiva di ERCC1-XPF al di fuori di questi percorsi di riparazione del DNA contribuisce alla compromissione epatica (Mulderrig e Garaycoechea, 2020). È possibile che ERCC1-XPF sia coinvolto in ulteriori percorsi di riparazione del DNA che si occupano del danno endogeno del DNA. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato che ERCC1-XPF agisce su strutture di DNA alternative, come lo Z-DNA, durante le quali coopera con proteine ​​di riparazione del disadattamento piuttosto che con fattori di riparazione NER o ICL (McKinney et al., 2020). Inoltre, è stato dimostrato che ERCC1-XPF è coinvolto in un sottopercorso di riparazione dell'escissione della base insieme all'elicasi RECQ1 (Woodrick et al., 2017).

I due fratelli (PV46LD e PV50LD) in questo studio hanno mostrato mancanza di crescita, bassa statura e mancanza di grasso sottocutaneo, che ricordano le piccole dimensioni osservate nei topi ERCC1-KO (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997). Inoltre, i fratelli hanno sviluppato danni epatici con un quadro prevalentemente colestatico che ha portato al trapianto di fegato ortotopico prima dei 9 anni. Questo intervento ha chiaramente impedito la morte prematura, ma non ha migliorato la mancata crescita, come è evidente dalla crescita post-trapianto di peso, altezza e circonferenza cranica ben al di sotto del terzo percentile.

È interessante notare che la malattia epatica colestatica è stata segnalata come una caratteristica comune nei pazienti egiziani con CS, suggerendo che questa dovrebbe essere monitorata più da vicino nei pazienti con CS di altre origini etniche per vedere se questa è una caratteristica più comune di quanto precedentemente riconosciuto (Abdel Ghaffar et al. , 2011). Sebbene non siano state descritte anomalie epatiche nei pazienti con XP, ci sono alcuni casi di citolisi epatica (rottura o scoppio delle cellule) nei pazienti con AF (Masserot-Lureau et al., 2012), che possono essere distinti dalle anomalie epatiche osservate nell'ERCC 1- fratelli carenti. L'esame istologico di una biopsia epatica del fratello maggiore (PV50LD) ha rivelato cambiamenti nella morfologia degli epatociti con ingrossamento e variabilità nucleare, come notato nei topi carenti di ERCC1- (Fig. S1 D; N´uñez et al., 2000 ).

La seconda causa di morte nei topi ERCC1-KO con espressione specifica del fegato di ERCC1 era graveinsufficienza renale(Selfridge et al., 2001). Entrambi i fratelli presentano anche disfunzione renale, con caratteristiche suggestive di disfunzione tubulare prossimale che porta a progressionerenemenomazione. Tuttavia, la funzione tubulare si è stabilizzata dopo il trapianto di fegato, marenefunzionerichiede un monitoraggio continuo. Il fenotipo renale dei topi KO ERCC1-, con tubuli dilatati contenenti materiale proteico fuoriuscito coerente con una tubulopatia (McWhir et al., 1993; Selfridge et al., 2001; Weeda et al., 1997)—è simile a quello dei pazienti descritti nel nostro studio. Inoltre, sono stati segnalati insufficienza renale e, in alcuni casi, insufficienza in XP/CS combinati (Ben Chehida et al., 2017; Kondo et al., 2016; Kralund et al., 2013) così come CS (Funaki et al. ., 2006; Reiss et al., 1996; Sato et al., 1988), mentre un'associazione tra FA e anomalie strutturali delrenehas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>A) morto all'età di 37 anni (Gregg et al., 2011; Imoto, K., et al. 2007. I pazienti con difetti nelle proteine ​​di riparazione dell'escissione nucleotidica interagenti ERCC1 o XPF mostrano xeroderma pigmentoso con grave degenerazione neurologica a esordio tardivo . [Abstract] J. Invest.Dermatol. 127:S92). Sebbene non sia stata segnalata alcuna compromissione epatica, questo paziente ha sviluppato una grave atrofia cerebrale all'età di 15 anni, che si è sviluppata in una neurodegenerazione progressiva con demenza. È stata notata anche una lieve atrofia cerebrale in entrambi i fratelli all'età di 13 e 11 anni, indicando che lo sviluppo neurologico di entrambi i fratelli dovrebbe essere monitorato attentamente.

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>C; Jaspers et al., 2007; Niedernhofer et al., 2006) presentava un fenotipo con qualche sovrapposizione con i fratelli qui riportati, tra cui fotosensibilità senza cancro della pelle, bassa statura, mancanza di grasso sottocutaneo, ritardo dello sviluppo e insufficienza renale (Niedernhofer et al., 2006). Distinto dai fratelli qui riportati, questo ragazzo mostrava caratteristiche progeroidi segmentali pronunciate, ma un'immagine del fegato molto più mite senza colestasi. I fratelli qui riportati dimostrano che le mutazioni bi-alleliche ERCC1 possono causare uno spettro di fenotipi, da quello tipicamente visto in CS fino a un fenotipo comprendente bassa statura più lieve, fotosensibilità e fegato grave erenemenomazione, potenzialmente a causa di un forte impatto combinato su NER e un impatto simultaneo sulla riparazione dell'ICL, che può interessare particolarmente questi organi.

Materiali e metodi

Tutte le procedure eseguite in questo studio sono conformi agli standard etici e sono state approvate dal Comitato etico umano del Royal Children's Hospital, Melbourne, Victoria, Australia (HREC36291C) e dal Comitato del servizio di etica della ricerca nazionale del Regno Unito North East–Newcastle e North Tyneside 2. I pazienti sono stati reclutati nei programmi per malattie non diagnosticate per pazienti pediatrici con presunti disturbi mendeliani "orfani". Sono stati raccolti campioni di saliva o di sangue dai pazienti e dai loro familiari per l'estrazione del DNA genomico dopo il consenso informato scritto. I genitori hanno concesso il permesso di mostrare fotografie non redatte dei fratelli colpiti in Fig. 1 A.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>T è stato identificato in entrambi gli individui affetti nell'esone 4 di 8 del gene ERCC1. All'interrogazione iniziale dei dati sull'esoma in entrambi gli individui affetti, questa variante sembrava essere in uno stato omozigote ma era presente in uno stato eterozigote nel padre e assente nella madre, suggerendo una possibile delezione sull'allele materno. La variante missenso è presente nel database gnomAD con una frequenza del 0,01 percento (22 eterozigoti, nessun omozigote) e non è stata precedentemente segnalata negli individui affetti. La variante missenso è stata depositata nel database LOVD (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 e http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) e nel database ClinVar ( ID variazione: 978472).

Rilevamento della cancellazione mediante qPCR

Per rilevare la delezione, il DNA genomico è stato estratto dai linfociti/cellule epiteliali e la regione pertinente del gene ERCC1 è stata amplificata in una qPCR. qPCR è stato eseguito utilizzando sonde e primer specifici (elencati nella Tabella S1) progettati utilizzando l'Universal ProbeLibrary Assay Design Center (Roche) e sintetizzati da Sigma-Aldrich. I primer sono stati progettati per includere la regione deleta nell'esone 4 e una regione all'interno del gene che non è deleta come controllo (esone 5). È stata eseguita una qPCR multiplex utilizzando la miscela di reazione LightCycler R 480 Probes Master (Roche) secondo il protocollo del produttore per amplificare e quantificare la regione del gene ERCC1, utilizzando il gene CFTR (esone 27) come standard interno (Tabella S1). La qPCR è stata eseguita sullo strumento LightCycler R 480 (Roche) e l'analisi dei dati è stata eseguita utilizzando il software LightCycler R 480 versione 1.5.0 (Roche). Le linee guida dell'American College of Medical Genetics sono state seguite per l'interpretazione della variazione di sequenza.

Rilevamento della variante missenso mediante sequenziamento di Sanger

Il DNA genomico è stato isolato risospendendo i pellet cellulari in un tampone lisato di cellule intere (50 mM KCL, 10 mM Tris, pH 8.0, 25 mM MgCl2, {{12} },1 mg/ml di gelatina, 0,45 percento di Tween-20 e 0,45 percento di NP-40) contenente 0,1 mg/ml di proteinasi K (EO0491; ThermoFisher Scientific) e incubazione per 1 h a 56 gradi seguito da 10-inattivazione termica minima della proteinasi K a 96 gradi . Frammenti di ~ 1 kb che coprono le mutazioni missenso sono stati amplificati mediante PCR (i primer di sequenziamento sono elencati nella Tabella S1) seguiti dal sequenziamento di Sanger utilizzando il primer forward o reverse.

Linee cellulari

Linee cellulari di fibroblasti sono state stabilite da biopsie cutanee sia di individui affetti che di genitori. Tutte le linee cellulari (elencate nella tabella S2) sono state coltivate a 37 gradi in un'atmosfera al 5% di CO2 indio (Thermo Fisher Scientific) integrata con penicillina/streptomicina (Sigma-Aldrich) e 10% FBS (Bodinco BV). Tutte le linee cellulari sono state regolarmente testate per l'infezione da micoplasma.

Immortalizzazione dei fibroblasti con hTERT

I fibroblasti WT (48BR) e PV50LD sono stati immortalati mediante nucleofezione di p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid n. 1774) utilizzando Amaxa Nucleofector (programma U23). Ciascuna elettroporazione conteneva 400,000 fibroblasti e 2,5 µg di DNA plasmidico. Dopo l'elettroporazione, le cellule sono state seminate in flaconi di coltura tissutale di 25-cm2 contenenti 5 ml di DMEM e il 10% di FBS. Dopo 2 giorni, il mezzo di coltura è stato sostituito con un mezzo contenente 20 µg/ml di neomicina.

/streptomicina (Sigma-Aldrich) e 10 percento FBS (Bodinco BV). Tutte le linee cellulari sono state regolarmente testate per l'infezione da micoplasma.

Costrutti plasmidi

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>Mutazioni T in ERCC1. Il prodotto della PCR sovrapposta è stato inserito come frammento NheI e AgeI per generare un CW abbondante57-TO-ERCC1R156W-mVenus. ERCC1WT e ERCC1R156W sono stati inseriti come frammenti NheI e AgeI in pcDNA5-FRT-TO Puro-EGFP-N1 per generare pcDNA5-FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFP e pcDNA5-FRT-TO -Puro-ERCC1R156W-EGFP. La mutagenesi sito-diretta è stata utilizzata per introdurre mutazioni puntiformi in pMacro Bac-XPF-ERCC1WT utilizzando il kit di mutagenesi KOD-plus (Toyobo) come descritto nel protocollo del produttore, utilizzando i primer elencati nella Tabella S1. Tutte le sequenze sono state verificate mediante sequenziamento di Sanger.

Generazione di cellule KO

linee per generare singoli KO, cellule U2OS(FRT) e RPE1-hTERT (PuroR/TP53-dKO) sono state cotrasfettate con pLV-U6g-PPB che codifica per un RNA guida del Leiden University Medical Center/Sigma -Libreria Aldrich di RNA a guida singola (sgRNA) (vedere la tabella S3 per i plasmidi e la tabella S4 per le sequenze di sgRNA) mirata al gene ERCC1 insieme a un vettore di espressione che codifica per Cas9-2A-GFP (pX458; Addgene n. 48138) utilizzando Lipofectamine 2000 (Invitrogeno). Le cellule U2OS (FRT) trasfettate sono state selezionate su puromicina (1 µ g/ml) per 3 giorni e piastrate a bassa densità, dopo di che sono stati isolati i singoli cloni. Le cellule RPE{19}}hTERT trasfettate sono state ordinate FACS su BFP/GFP e piastrate a bassa densità, dopodiché i singoli cloni sono stati isolati. I cloni KO sono stati verificati mediante analisi Western blot. L'assenza di integrazione Cas9/espressione stabile è stata confermata da Western blot.

Generazione di linee cellulari stabili

Un singolo clone ERCC1 KO in background U2OS(FRT) (vedi tabella S2) è stato utilizzato per esprimere stabilmente ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP o GFP-NLS mediante cotrasfezione di pcDNA5-FRT-TO-Puroplasmide codificante questi cDNA (2 µg), insieme al plasmide pOG44 che codifica per la ricombinasi Flp (0.5 µg). Una popolazione di cellule policlonali è stata ottenuta dopo la selezione su 1 μg/ml di puromicina e 4 μg/ml di blasticidina S. L'espressione delle proteine ​​ERCC1 marcate con GFP o GFP-NLS è stata indotta dall'aggiunta di 2 μg/ml di doxiciclina per 24 ore.

Generazione di linee cellulari KI

Per generare KI omozigoti, le cellule RPE{0}}hTERT sono state prima trattate per 30 minuti con 1 µM di inibitore DNA-PK (NU7441) per sopprimere la riparazione DSB soggetta a errori e aumentare l'uso della riparazione dipendente dall'omologia. Successivamente, 350,{8}} cellule sono state risospese in 20 µl di tampone nucleofector (V4XP-3032; Lonza) in presenza di 4,5 µg di plasmide contenente Cas9 e sgRNA mirato al gene ERCC1 (vedi Tabella S3 per plasmidi e Tabella Sequenze di forsgRNA S4) e 100 µM di DNA donatore a filamento singolo contenente la mutazione del paziente, nonché mutazioni silenziose per distruggere il sito PAM per prevenire il recuting da parte di Cas9 e mutazioni silenziose per introdurre un sito di restrizione HindIII per facilitare lo screening dei cloni KI. Le cellule sono state elettroporate utilizzando anAmaxa 4D-X Nucleofector Unit (Lonza) utilizzando il programma EA-104. Dopo l'elettroporazione, le cellule sono state placcate a bassa densità in mezzo McCoy con FBS al 10%. Il giorno successivo, il mezzo è stato sostituito con DMEM (10% FBS e 1% di penicillina/streptomicina) e le cellule sono state lasciate formare colonie. Circa 400 colonie furono isolate e ampliate. Il DNA genomico è stato isolato e un frammento che includeva la mutazione introdotta e il sito di restrizione introdotto (HindIII) è stato amplificato mediante PCR nidificata (vedere la tabella S1 per i primer). I frammenti di PCR sono stati digeriti con HindIII (NEB) per 3 ore a 37 gradi e quindi separati mediante elettroforesi su gel. I cloni che avevano il sito di restrizione HindIII introdotto sono stati analizzati mediante sequenziamento di Sanger (vedere la tabella S1 per i primer). Abbiamo ottenuto due cloni KI omozigoti tra 400 cloni isolati, che corrispondono a un'efficienza KI di ~ 0,5 percento.

Trasduzione lentivirale

per la trasduzione lentivirale, mVenus-ERCC1WT o mVenus ERCC1R156W è stato inserito nel vettore lentivirale pLenti-CW57-TO. HEK293T è stato trasfettato con vettori che codificano per queste fusioni ERCC1, VSV-G, RRE e REV utilizzando JetPEI (Sigma Aldrich) per produrre il virus. Il supernatante contenente il virus è stato raccolto dopo 24 ore e filtrato con un filtro 0.{12}}µm. I fibroblasti primari PV46LD e PV50LD sono stati trasdotti lentiviralmente in presenza di polibrene (Sigma-Aldrich). Le cellule sono state selezionate con 15 µg/ml di puromicina. L'espressione delle proteine ​​ERCC1 marcate con mVenus è stata indotta dall'aggiunta di 2 µ g/ml di doxiciclina per 24 ore.

Saggi di sopravvivenza clonogenica

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >Sono state valutate 20 celle. Gli esperimenti di sopravvivenza sono stati eseguiti in duplicato e ripetuti almeno due volte.

Immunoprecipitazione per Co-IP

Le cellule sono state trattate in modo simulato o irradiate con UV-C (20 J/m2) e raccolte dopo 1 ora. I pellet cellulari sono stati lisati per 20 min su ghiaccio in tampone EBC-150 (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NP-40 0,5%, MgCl2 2 mM e inibitore della proteasi cocktail [Roche]) addizionato con 500 U/ml di Benzonasi Nucleasi (Novagen). I lisati cellulari sono stati incubati per 1,5 ore a 4 gradi con perline GFP-Trap A (Chromotek). Le perline sono state quindi lavate sei volte con tampone EBC-150 (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NP-40 0,5%, EDTA 1 mM e cocktail di inibitore della proteasi) e bollite inLaemmli-SDS tampone campione.

Macchia occidentale

Le cellule sono state centrifugate, lavate con PBS e fatte bollire per 10 min in tampone Laemmli (40 mM Tris, pH 6,8, 3,35% di SDS, 16,5% di glicerolo, 0,0005% di blu di bromofenolo e 0,05 M ditiotreitolo). Le proteine ​​sono state separate dal 4% al 12% su gel Criterion XT Bis-Tris (#3450124; Bio-Rad) in NuPAGE MOPSrunning buffer (NP0001-02; Thermo Fisher Scientific) e asciugate su membrane di fluoruro di polivinilidene (IPFL00010; EMD Millipore ). La membrana è stata bloccata con tampone bloccante (MB-070-003; Rock Land) per 1 ora a temperatura ambiente. La membrana è stata quindi sondata con anticorpi (elencati nella Tabella S5) come indicato. Per il rilevamento è stato utilizzato un sistema Odyssey CLx (LI-COR Biosciences).

Saggio di recupero dell'RNA (RRS)

30,{1}} cellule sono state seminate su vetrini coprioggetto in vetro di 12-mm in 24-piastre a pozzetti in DMEM con FBS all'1%. Dopo 24 ore, le cellule sono state irradiate con UV-C a una dose di 6 J/m2 e incubate in un mezzo condizionato per periodi di tempo diversi ({{20}}} h, 3 h e 18 h). Dopo l'incubazione, le trascrizioni nascenti sono state etichettate incubando le cellule con 400 µM di 5-etinil-uridina (CLK-N002-10; Jena Bioscience), che è stata quindi visualizzata con una miscela Click-iT composta da 50 Tampone Tris mM, pH 8,0, Atto Azide 60 µM (647N-101; ATTO-TEC), CuSO4•5H2O 4 mM, acido L-ascorbico 10 mM (A0278; Sigma-Aldrich) e DAPI 0,1 µg/ml (D1306; Thermo Fisher Scientific) per 1 ora. Le cellule sono state lavate tre volte per 5 minuti con PBS e montate su vetrini da microscopio (Thermo Fisher Scientific) utilizzando Aqua Polymount (Brunschwig).

Immunofluorescenza

Per la colorazione immunofluorescente, 250,{1}} cellule sono state seminate su vetrini coprioggetti di vetro di 18-mm. Il giorno successivo, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4%, seguita da permeabilizzazione con {{10}},5% Triton X-100 per 10 min. Le cellule sono state trattate con 100 glicine in PBS per 10 minuti per bloccare i gruppi aldeidici non reagiti, risciacquate con PBS ed equilibrate in tampone di lavaggio (PBS contenente lo 0,5% di BSA e lo 0,05% di Tween-20; Sigma-Aldrich) per 10 minuti. I passaggi e i lavaggi dell'anticorpo erano nel tampone di lavaggio. Gli anticorpi primari sono stati incubati per 2 ore a temperatura ambiente, seguiti da anticorpi secondari per 1 ora e DAPI per 5 minuti. Gli anticorpi primari e secondari sono elencati nella Tabella S5. Le cellule sono state incubate con 0,1 µg/ml di DAPI e montate utilizzando Aqua Polymount.

Colorazione H2AX

200,000 cellule sono state seminate su vetrini coprioggetto in vetro di 18-mm in 24-piastre a pozzetti con DMEM (10% FBS e 1% P/S). Il giorno successivo, le cellule sono state esposte a IR dal generatore di raggi X YXlon International (200 KV, 4 mA; velocità di dose 2 Gy/min). Nei punti temporali indicati, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 3% in PBS per 10 minuti e colorate per H2AX per 1 ora (vedi sopra). Le immagini sono state quantificate utilizzando una macro personalizzata in ImageJ che ha consentito l'analisi automatica e obiettiva del numero di fuochi per cella, come descritto in precedenza (Typas et al., 2015).

Analisi microscopica di cellule fisse

Le immagini di campioni fissi sono state acquisite su un microscopio a fluorescenza ad ampio campo Zeiss AxioImagerM2 o D2 dotato di obiettivi a immersione in olio 63 × PLAN APO (apertura numerica 1,4 [NA]) (Zeiss) e una lampada ad alogenuri metallici HXP 120 utilizzata per l'eccitazione. Le sonde fluorescenti sono state rilevate utilizzando i seguenti filtri per DAPI (filtro di eccitazione: 350/50 nm; specchio dicroico: 400 nm; filtro di emissione: 460/50 nm), Alexa 555 (filtro di eccitazione: 545/25 nm; specchio dicroico: 565 nm ; filtro di emissione: 605/70 nm) o Alexa 647 (filtro di eccitazione: 640/30 nm; specchio dicroico: 660 nm; filtro di emissione: 690/50 nm). Le immagini sono state registrate utilizzando il software ZEN 2012 e analizzate in ImageJ.

Microirraggiamento laser UV

Le cellule sono state coltivate su vetrini coprioggetto di 18-mm di quarzo (UV-C) o di vetro (UV-A) e collocate in una camera magnetica Chamlide CMB in cui il mezzo di crescita è stato sostituito da Leibovitz L2-indipendente dal CO {4}} medio (Thermo Fisher Scientific). Le tracce laser UV-C sono state realizzate utilizzando un laser a granato di alluminio e ittrio a stato solido pompato a diodo 266- mm (potenza media 5 mW, frequenza di ripetizione fino a 10 kHz e lunghezza dell'impulso 1 ns). Prima dell'irradiazione UV-Amicro, le cellule sono state sensibilizzate con 6 µM di trioxsalen per 1 ora per generare ICL o con 15 µM di BrdU per 24 ore per generare DSB. Le tracce laser UV-A sono state realizzate da un laser a granato di alluminio e ittrio pompato a diodo 355-nm (potenza media 14 mW e frequenza di ripetizione fino a 200 Hz). Entrambi i laser sono stati integrati in un sistema di illuminazione spot UGA-42-Caliburn/2L (Rapp OptoElectronic).

La micro-irradiazione è stata combinata con l'imaging di cellule vive in una camera ambientale impostata a 37 gradi su un microscopio Zeiss Axio Observer 7 a fluorescenza a campo largo tutto il quarzo, utilizzando un obiettivo a immersione di glicerolo con ultrafiltro 100 × (1,2 NA) (UV-C ) o un obiettivo a immersione in olio Plan-Neofluar 63× (1,25 NA) (UV-A). Il sistema laser è accoppiato al microscopio tramite un TriggerBox e un filtro a densità neutra (ND-1) blocca il 90 percento della luce laser. AnHXP 120-Una lampada ad alogenuri metallici a V è stata utilizzata per l'eccitazione. Le immagini sono state acquisite in Zeiss ZEN e quantificate in ImageJ.

Saggio di rottura cromosomica

2 × 1{{20}}6 fibroblasti sono stati seminati in flaconi di coltura tissutale di 175-cm2 con DMEM (10% FBS) e coltivati ​​a 37 gradi in presenza o assenza di 50 nM MMC. Dopo 48 ore, 600 µl di demecolcina (10 µg/µl) sono stati aggiunti a ciascun pallone di coltura e le cellule sono state incubate per altri 30 minuti a 37 gradi per arricchirsi per le metafasi. Le cellule sono state quindi tripsinizzate e risospese in KCL 75 mM e incubate per 20 minuti a temperatura ambiente. Le cellule sono state centrifugate, risospese in 10 ml di fissativo (75% di metanolo e 25% di acido acetico), incubate per 30 minuti a temperatura ambiente e centrifugate. I pellet sono stati risospesi in 10 ml di fissativo e incubati per 5 minuti a temperatura ambiente. Questo passaggio è stato ripetuto e, infine, il pellet è stato risospeso in 0,5–1,0 ml di fissativo. La sospensione cellulare è stata fatta cadere su un vetrino e lasciata asciugare. I vetrini sono stati colorati per 5 minuti in una soluzione Giemsa al 3%, sciacquati in acqua di rubinetto e lasciati asciugare. I vetrini sono stati codificati e da ciascuna coltura codificata sono state esaminate 50 metafasi per il danno cromosomico. Dopo il punteggio, le diapositive sono state decodificate e i risultati sono stati analizzati come presentato (Stoepker et al., 2011).

UDS

180,{1}} cellule sono state seminate su vetrini coprioggetto in vetro di 18-mm in 12-piastre a pozzetti in DMEM con FBS all'1%. Dopo 24 ore, le cellule sono state irradiate localmente attraverso un filtro 5-µm con 30 J/m2 UV-C. Le cellule sono state successivamente etichettate a impulsi con 20 µM EdU (VWR) e 1 µM5-fluoro-deossiuridina (Sigma-Aldrich) per 1 ora o 4 ore. Dopo l'etichettatura, le cellule sono state inseguite con 10 µM di timidina in DMEM senza supplementi per 30 minuti e fissate per 15 minuti con il 3,7% di formaldeide in PBS. Le cellule sono state permeabilizzate per 20 minuti in PBS con 0,5 percento di Triton-X100 e bloccate in 3 percento di BSA (Thermo Fisher Scientific) in PBS. L'EdU incorporato è stato accoppiato ad Attoazide Alexa Fluor 647 utilizzando la chimica Click-iT secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen). Dopo l'accoppiamento, le cellule sono state fissate con formaldeide al 2% per 10 minuti e successivamente bloccate con glicina 100 mM. Il DNA è stato denaturato con NaOH 0,5 M per 5 minuti, seguito da blocco con BSA al 10% per 15 minuti. Successivamente, le cellule sono state incubate con un anticorpo contro i dimeri di ciclobutano pirimidina (vedi Tabella S5) per 2 ore, seguito da anticorpi secondari per 1 ora e DAPI per 5 minuti. Le cellule sono state montate a Polymount (Brunschwig).

Acquisizione dati MS

La SM è stata eseguita essenzialmente come descritto in precedenza (Salas Lloret et al., 2019). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti su un sistema EASY-nLC 1000 (Proxeon) collegato a un Orbitrap Q-Exactive (Thermo Fisher Scientific) tramite una sorgente ionica nano-elettrospray. Il Q-Exactive è stato accoppiato a un emettitore di silice di 25-cm (FS360-75-15-N-5-C25; NewObjective) confezionato internamente con sfere AQ da 1,9 µm C18- (Reprospher -DE; Pur; Dr. Manish, Ammerbuch-Entringen, Germania). I campioni sono stati analizzati in un gradiente cromatografico 40-min dallo 0% al 30% di acetonitrile e quindi aumentati al 95% di acetonitrile prima del riequilibrio della colonna con una velocità di flusso di 200 NL/min. Lo spettrometro di massa è stato utilizzato in una modalità di acquisizione dipendente dai dati con un metodo top-seven e un range di scansione di 300–1.600 m/z. Gli spettri MS a scansione completa sono stati acquisiti con un valore target di 3 × 106 e una risoluzione di 70,000, e gli spettri di massa tandem a dissociazione collisionale più elevati (MS/MS) sono stati registrati con un valore target di 105 e con una risoluzione di 35.000, una finestra di isolamento di 2,2 m/z e un'energia di collisione normalizzata del 25 percento. L'obiettivo di controllo del guadagno automatico minimo era 104. I tempi di iniezione massimi di MS1 e MS2 erano rispettivamente di 250 e 120 ms. Le masse di ioni precursori degli ioni scansionati sono state escluse dinamicamente dall'analisi MS/MS per 30 s. Gli ioni con carica 1 e superiore a 6 sono stati esclusi dall'attivazione dell'analisi MS2.

Analisi dei dati MS Tutti i dati grezzi sono stati analizzati utilizzando MaxQuant (versione 1.6.6.0) come descritto in precedenza (Tyanova et al., 2016a). Abbiamo eseguito la ricerca contro un proteoma di riferimento UniProt digerito in silico per l'Homo sapiens, comprese le sequenze canoniche e isoforme (27, 2019 maggio). Le ricerche nel database sono state eseguite secondo le impostazioni standard con le seguenti modifiche. È stata utilizzata la digestione con tripsina/P, consentendo quattro scissioni mancate. L'ossidazione (M) e l'acetile (proteina N-term) sono state consentite come modificazioni variabili con un numero massimo di tre. Il carbammido-metile (C) è stato disabilitato come modifica fissa. La quantificazione senza etichetta (LFQ) è stata abilitata, non consentendo Fast LFQ. I dati di output di Max-Quant sono stati ulteriormente elaborati utilizzando la piattaforma computazionale Perseus (v 1.6.6.0; Tyanova et al., 2016b). I valori di intensità LFQ sono stati trasformati in log2 e sono stati rimossi potenziali contaminanti e proteine ​​​​identificati dal solo sito o peptidi inversi. I campioni sono stati raggruppati in categorie sperimentali e sono state rimosse anche le proteine ​​non identificate in quattro repliche su quattro in almeno un gruppo. I valori mancanti sono stati imputati utilizzando valori normalmente distribuiti con un downshift di 1,8 (log2) e una larghezza randomizzata di 0,3 (log2) considerando i valori dell'intera matrice. L'analisi statistica (t-test) è stata eseguita per determinare quali proteine ​​erano significativamente arricchite. Sono stati generati grafici del vulcano e le tabelle di output dell'analisi statistica sono state ulteriormente elaborate in Microsoft Excel. I dati di proteomica MS sono stati depositati presso il Consorzio ProteomeXchange tramite il repository partner PRIDE (Perez-Riverol et al., 2019) con l'identificatore del set di dati PXD017940.

Purificazione dell'ERCC ricombinante1-XPF

La produzione di baculovirus è stata eseguita come descritto utilizzando i costrutti pMacroBac-His-ERCC1/XPF-HA (Enzlin e Sch¨ arer, 2002). ERCC1WT ed ERCC1R156W sono stati coespressi con XPFWT da un singolo baculovirus in cellule di insetti Sf9. Gli eterodimeri sono stati purificati su affinità del nichel, esclusione dimensionale e cromatografia con eparina come descritto (Enzlin e Sch¨ arer, 2002). L'ERCC{10}}XPF è stato eluito dalla colonna di eparina a circa 600 mM di NaCl. Le concentrazioni proteiche variavano da 0,1 a 0,2 mg/ml.

Saggio di nucleasi

Un substrato ad anello stelo (GCCAGCGCTCGG(T)22CCGAGCGCTGGC) contenente il colorante fluorescente Cy5 (50 pmol) a 39 termini (IDT) è stato ricotto in un tampone di ricottura 100-µl (10 mM Tris, pH 7,5 e 50 mM NaCl) riscaldando a 95 gradi per 5 min e raffreddando lentamente per un periodo di 2 h. 200 fmol di substrato ricotto sono state utilizzate in 20- µl di reazioni contenenti HEPES 25 mM, pH8,0, MgCl2 2 mM, glicerolo 10%, -mercaptoetanolo 0,5 mM, BSA 0,1 mg/ml, 40 mM NaCl e 0–40 nM di proteine. Le reazioni sono state incubate a 30 gradi per 30 minuti e interrotte aggiungendo 10 µl di formammide al 90 percento/EDTA 10 mM. Dopo il riscaldamento a 95 gradi per 5 minuti e il raffreddamento su ghiaccio, 15 µl di ciascun campione sono stati caricati su un gel di poliacrilammide denaturante al 15%. I gel sono stati eseguiti a 30 mA per 30 minuti e le bande sono state visualizzate mediante fluorescenza da Typhoon RGB (Amersham Biosciences).

Saggio NER in vitro

Gli estratti cellulari carenti di XPF (XP2YO) e il plasmide contenente la lesione dG-AAF sito-specifica sono stati generati come descritto in precedenza (Gillet et al., 2005; Shivji et al., 1999) . Per ogni reazione, 2 µl di tampone di riparazione (2{{40}}0 mM Hepes-KOH, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP, 110 mM fosfocreatina e 1,8 mg / ml BSA, pH finale 7,8), 0,2 µl di tampone di creatinfosfochinasi (2,5 mg/ml di creatinfosfochinasi da muscolo di coniglio [Sigma Aldrich], glicina 10 mM, pH 9,0 e glicerolo al 50%), 3 µl di cellule carenti di XPF estratto, NaCl (a una concentrazione finale di 70 mM) e proteine ​​ERCC{30}}XPF purificate in un volume totale di 9 µl sono state preriscaldate a 30 gradi per 10 min. Ad ogni reazione è stato aggiunto 1 µl di plasmide contenente dG-AAF (50 ng/µl) e le reazioni sono state incubate a 30 gradi per 45 minuti. La miscela di reazione è stata quindi raffreddata su ghiaccio per 5 minuti, seguita dall'aggiunta di 0,5 µl di 1 µM di filamento complementare d(GGGGCATGTGGCGCCGGTAATAGC TACGTAGCTC) e la miscela di reazione è stata denaturata mediante riscaldamento a 95 gradi per 5 minuti. Dopo 15 minuti di ricottura a temperatura ambiente, è stato aggiunto 1 µl di mix di sequenza (contenente 0,13 U di sequenza e 2,0 µCi [{51}}P] dCTP per ciascuna reazione). Dopo la preincubazione a 37 gradi per 3 minuti, sono stati aggiunti 1,2 µl di miscela di desossiribonucleotide trifosfato (50 µM dCTP, 100 µM dTTP, 100 µM dATP e 100 µM dGTP). La miscela di reazione è stata incubata a 37 gradi per 12 minuti e la reazione è stata interrotta aggiungendo 8 µl di colorante di caricamento (80 percento di formammide e 10 mM di EDTA). I campioni sono stati riscaldati a 95 gradi per 5 minuti, raffreddati su ghiaccio e caricati su un gel di poliacrilammide denaturante al 14%. I gel sono stati eseguiti a 45 W per 2,5 ore e le bande sono state visualizzate utilizzando un PhosphorImager (Typhoon RGB).

Materiale supplementare in linea

La Fig. S1 mostra i valori di laboratorio delle funzioni epatiche e renali nel fratello 1 e nel fratello 2. La Fig. S2 mostra i dati di sequenziamento genomico che confermano la mutazione missenso e la delezione intragenica nel gene ERCC1. La Fig. S3 mostra l'espressione proteica di ERCC1 e XPF nei fibroblasti dei pazienti. La Fig. S4 mostra le proteine ​​ricombinanti purificate ERCC1 e XPF e il Co-IP di ERCC1WT e ERCC1R156W. La Fig. S5 mostra le immagini al microscopio di UDS, i fuochi H2AX e la posizione delle mutazioni del paziente nell'ERCC1-XPF. La tabella S1 contiene le sequenze di tutti i primer e le sonde utilizzate in questo studio. La tabella S2 elenca tutte le linee cellulari testate in questo studio. La tabella S3 elenca tutti i plasmidi coinvolti in questo studio. La tabella S4 fornisce le sequenze di sgRNA dello studio e la tabella S5 mostra gli anticorpi. La tabella S6 fornisce il numero di celle utilizzate per la quantificazione nelle figure. Data S1 mostra tutti i file Western blot non ritagliati.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano sia i fratelli che i genitori per aver contribuito a questo articolo, Sylvie Noordermeer (Leiden University Medical Center [LUMC], Leiden, Paesi Bassi) per il vettore di espressione lentivirale thepLenti-CW{1}}TO-GFP e consigli sulla generazione di KI cellule, Joachim Goedhart (Università di Amsterdam, Amsterdam, Paesi Bassi) per il cDNA mVenus, Bert van derKooij (LUMC, Leiden, Paesi Bassi) per l'inibitore DNA-PK, Wim Vermeulen e Anja Rams (Erasmus MC, Rotterdam, Paesi Bassi) per la fornitura Celle 165TOR, Tomoo Ogi (Università di Nagoya, Giappone) per la fornitura di celle CS20LO, Alan Lehman (Università del Sussex, Regno Unito) per la fornitura di celle CSL16NG e CSL16NG hTERT e Joost Schimmel (LUMC, Leiden, Paesi Bassi) per consigli sulla generazione di celle KI .

Questo lavoro è stato finanziato da un Leiden University Medical CenterResearch Fellowship e da una Nederlandse Organisatie voor We tenschappelijk Onderzoek VIDI grant (ALW.016.161.320) a MSLuijsterburg, una sovvenzione iniziale del Consiglio europeo della ricerca (310913) a ACO Vertegaal, una sovvenzione KWF Kankerbestrijding YoungInvestigator ( 11367) a R. Gonz´alez-Prieto, una sovvenzione KWF Kan kerbestrijding (VU 2013-5983) a MA Rooimans e sovvenzioni dal Korean Institute for Basic Science (IBS-R022-A1) e dal National Cancer Institute (P01CA092584) a ODSch arer.

Contributi dell'autore: K. Apelt ha generato cellule KO, cellule KI e linee cellulari stabili; ha eseguito Western blot e immunocolorazioni per l'espressione di ERCC1 e XPF, trasduzioni lentivirali, sopravvivenze clonogeniche (UV, MMC, IR), esperimenti Co-IP per analisi Western blot, esperimenti UDS, esperimenti Co-IP per MS e colorazioni H2AX; e ha scritto il giornale. A. Kragten ha eseguito UDS, RRS e immunocolorazioni dopo UV locale. AP Wonder gem ha generato cellule KO e KI ed ha eseguito esperimenti UDS, Western blot e sequenziamento di Sanger per confermare la mutazione missenso. SM White ha fornito consulenza ai pazienti, analizzato i dati sull'esoma, eseguito biopsie, generato fibroblasti primari e scritto la descrizione clinica del paziente. S. Lunke e BT Wilson hanno generato dati NGS. S. Pantaleo e D. Flanagan hanno eseguito qPCR per convalidare l'eliminazione. C.Quinlan ha scritto la descrizione clinica del rene. W. Hardikar ha scritto la descrizione clinica del fegato. MA Rooimans e R.MF Wolthuis hanno generato fibroblasti 48BR e PV50LD immortalati con hTERT ed hanno eseguito i saggi di rottura cromosomica indotti da MMC. R. Gonzalez-Prieto e ACO Vertegaal hanno analizzato tutti gli esperimenti sulla SM. WW Wiegant e H. vanadium hanno eseguito sopravvivenze clonogeniche nelle cellule U2OS (IR). J.-E.Yeo e HS Kim hanno purificato le proteine ​​ricombinanti ed eseguito il test della nucleasi e il test NER in vitro. Il lavoro in vitro NER supervisionato da OD Sch¨arer ha contribuito all'interpretazione strutturale dell'allele R156W e ha curato il documento. Il sig. Luij sterburg ha supervisionato il progetto e ha scritto il documento.

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