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2.6. Effetti anti-apoptotici delle citochinine determinati dalle misurazioni dell'attività della caspasi-3/7

Come mostrato dai saggi di colorazione PI descritti sopra, SAL ha indotto aumenti dei tassi di mortalità delle cellule SH-SY5Y. Poiché il SAL è associato sia all'apoptosi che alla necrosi [51] abbiamo anche studiato l'attivazione della caspasi-3 e 7 (casp-3/7) come marcatore specifico dell'apoptosi (la fase di esecuzione) [52] dopo aver esposto le cellule a CKs. Le attività della caspasi-3/7 registrate dopo il trattamento con ciascuno dei composti in esame sono state normalizzate rispetto a quelle registrate dopo il trattamento con 50{{30}} uM SAL (impostato come 100 per cento ). Come mostrato nella Figura 4, il noto inibitore della caspasi Ac-DEVD-CHO (incluso come controllo specifico correlato all'apoptosi) ha fortemente inibito l'attività della caspasi-3/7 a concentrazioni sub-micromolari (a 36,3 ± 2,66 e 25,2 ± 2,69 percento dei livelli nelle cellule trattate con SAL da solo a 0,05 e 0,5 uM, rispettivamente). Livelli simili di inibizione sono stati precedentemente osservati [53] in diversi modelli di neurodegenerazione basati su cellule SH-SY5Y in vitro. Il controllo positivo NAC ha anche ridotto significativamente l'attività della caspasi-3/7, all'88,7 ± 1,87 percento e al 78,5 ± 2,56 percento dei livelli indotti dal SAL a 100 μM e 1000 μM, rispettivamente. I CK testati hanno avuto un'ampia gamma di effetti sulle attività delle caspasi{50}}/7. È interessante notare che dai ribosidi CK, solo cZR ha avuto effetti significativi sulle attività a 0,1 uM (riducendoli rispettivamente all'83,3 ± 4,33 percento dei livelli indotti da SAL), mentre l'iPR a 1 uM non ha ridotto significativamente il casp-3 ,7. Infine, K3G ha ridotto l'attività della caspasi-3/7 con effetto massimo a 10 uM (a 81,7 ± 4,31 percento del livello indotto da SAL). Complessivamente, SAL ha indotto un aumento di 1.6-volte nell'attività della caspasi-3/7 rispetto alle cellule di controllo sane (CTR, Figura 4), in conformità con i risultati di uno studio precedente, in cui un simile Sono state utilizzate la concentrazione di SAL (400 uM) e la stessa linea cellulare [54]. È noto che NAC influenza l'attività delle caspasi-3/7 in diversi modelli dineuronalemorte [55–58]. Tuttavia, i risultati qui presentati forniscono la prima dimostrazione della loro caspasi-3/7 in un modello di SAL indotto da cellule SH-SY5YneuronaleMorte. Il controllo positivo ha ridotto l'attività della caspasi{0}}/7 indotta da 500 uM SAL in modo simile ai CK, ma cZR e K3G erano efficaci anche a concentrazioni sub-micromolari o micromolari. Altri studi con modelli di stress associati a PD (tossicità indotta da inibitori del proteasoma MG 132- o H2O2- nelle cellule SH-SY5Y [17] e nei fibroblasti [15]) e malattia di Huntington (modello di fame nel siero in Le cellule PC12 [19]) hanno anche dimostrato che le CK K e tZR possono avere attività anti-apoptotiche (caspasi-3) [17] e che sia K che tZR possono avere attività anti-senescenza [17,19] . Inoltre, le associazioni tra la diminuzione del casp-3,7 attivazione eneuroprotettivoattività sono state riportate per i modelli SAL e relativi a SAL [54,59,60].

Figura 4. Attività della caspasi-3/7 nel modello di PD indotto da SAL. Si triplica in almeno quattro giorni indipendenti. * P rispetto al veicolo con 500 uM SAL, # P rispetto al veicolo senza 500 uM SAL.

2.7. Identificazione dell'attività neuroprotettiva della citochinina nel modello di morte cellulare indotta dal glutammato

Poiché le cellule SH-SY5Y non esprimono tutte le subunità del recettore NMDA [61], il meccanismo più probabile di tossicità del glutammato (Glu) è il blocco dell'antiporta cistina/glutammato Xc con massiccia induzione dello stress ossidativo [62]. Precedenti autori hanno già dimostrato un'associazione tra morte cellulare indotta dal glutammato e necroptosi nelle cellule SH-SY5Y [63] e l'importanza dell'attivazione della caspasi-3 nella tossicità indotta dal glutammato nei loro confronti [62,64]. Diversi studi hanno anche mostrato il verificarsi di morte cellulare causata dal ferro (ferroptosi) dopo intossicazione da glutammato [62,65,66] e hanno indicato il verificarsi di tre tipi di morte cellulare (necroptosi, apoptosi e ferroptosi) in seguito al blocco dell'Xc -sistema antiporto. Al fine di completare una valutazione completa delneuroprotettivopotenziale del testatocitochinine, il sistema di analisi della morte cellulare indotta dal glutammato è stato incluso in un pannello analitico con il notoneuroprotettivoil chelante del ferro deferoxamina (DFO) e l'inibitore della necroptosi necrostatina-1 (NEC-1) [67] come controlli positivi. Qui, le cellule SH-SY5Y sono state differenziate per 48 ore, quindi trattate con 160 mM Glu o in co-trattamento con variecitochininaconcentrazioni ({{0}}.1–10 uM) per 24 ore e colorate con PI. In questo modello, l'effetto di Glu sulla morte cellulare era del 100% del segnale PI, quindi è stata valutata la riduzione della morte cellulare da parte dei composti del test. Glu ha indotto un aumento di quasi 4- volte la morte cellulare rispetto ai controlli sani SH-SY5Y (26,1 ± 0,42 percento). Screening dei controlli positivi ecitochininehanno rivelato che entrambi i controlli positivi NEC-1 (50 uM, 76,6 ± 2,51 percento) e DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54 percento) hanno ridotto la morte cellulare indotta dal glutammato. Come mostrato in Figura 5A, dal pannello dicitochinine, solo trecitochininehanno saputo proteggereneurone-come le cellule SH-SY5Y in modo simile ai controlli positivi. Il più attivocitochinineerano trans-zeatina (tZ) (0.1 uM, 79,5 ± 2,91 percento; 1 uM, 81,3 ± 2,77 percento) e cis-zeatina (CZ) (0.1 uM, 82,1 ± 3,29 percento ; 1 uM, {{20}}.2 ± 2,89 percento ) e cinetina (K) (1 uM, 88.0 ± 3,76 percento ; 10 uM, 79,9 ± 3,44 percento). Per confermare la loro promettente attività, è stato utilizzato un test ortogonale per chiarire più in dettaglio gli effetti biologici dei CK in questo modello: un test di rilascio della lattato deidrogenasi (LDH) [68], che ha anche mostrato una drammatica ({36}} piega) aumento della tossicità dopo il trattamento con Glu. È interessante notare che la determinazione del rilascio di LDH ci ha permesso di differenziare tra le attività dei CK e i controlli positivi (NEC-1 e DFO). I CK avevano un'attività protettiva moderata ma significativa (tZ ha ridotto i tassi di mortalità a 91,9 ± 1,40 percento a 0,1 uM; cZ li ha ridotti a 92,3 ± 1,15 percento a 0,1 uM e 91,7 percento ± 1,56 percento a 1 uM; K li ha ridotti a 92,2 ± 1,06 percento a 1 uM). I controlli positivi NEC-1 e DFO avevano effetti protettivi più forti ma erano efficaci a concentrazioni molto più elevate (riducendo i tassi a 76,9 ± 2,94 percento e 81,6 ± 3,74 percento a 50 e 10 μM, rispettivamente) (Figura 5B). Il test LDH ha convalidato le indicazioni ottenute con la colorazione PI e gli effetti osservati dei controlli positivi erano coerenti con i dati pubblicati [69,70]. I risultati riguardanti gli effetti di K nel modello di morte cellulare indotta da Glu nelle cellule HT22 [18] e le nostre osservazioni sugli effetti di CK rappresentativi come tZ, cZ e K mostrano che i CK sono candidati promettenti per il trattamento di malattie neurodegenerative associate allo stress ossidativo. 71]. Infine, tZ e cZ sono stati preferiti perché efficaci a concentrazioni più basse e sono stati selezionati, insieme a K, per ulteriori studi sui loro effetti sui livelli di stress ossidativo e sull'attivazione della caspasi-3,7.

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2.8. Effetti delle citochinine sullo stress ossidativo indotto dal Glu nelle cellule SH-SY5Y

A differenza del modello precedente, Glu può indurre stress ossidativo nelle cellule SH-SY5Y attraverso diversi percorsi. Uno si basa sul blocco dell'antiporta cistina/glutammato (Xc-), che porta all'esaurimento del glutatione (GSH) e agli effetti negativi sull'attività della superossido dismutasi (SOD) [62]. La morte cellulare mediata dal glucosi coinvolge anche la formazione di ROS (in particolare il radicale superossido) indotta da Rac-NADPH-ossidasi nelle cellule SH-SY5Y [72]. Questi risultati indicano che la principale causa di morte cellulare nel modello indotto da Glu è la OS. All'interno del modello,neurone-le cellule simili sono state co-trattate con Glu e composti testati, colorate con DHE e osservate mediante microscopia a fluorescenza. Come si può vedere nella Figura 6A, è stato osservato un drammatico aumento della fluorescenza rossa del DHE nelle cellule trattate con Glu, che è stato migliorato dalle sostanze di controllo positive e dai CK testati. Sulla base dell'osservazione al microscopio, la quantificazione dei livelli di superossido è stata eseguita in cellule indotte da Glu in modo simile, mediante il test DHE, a quelle in cellule indotte da SAL. I risultati sono stati normalizzati rispetto ai livelli indotti dal solo Glu (fissati al 100 percento), che ha causato un drammatico aumento di quasi 3- volte i livelli di superossido in sole 4 ore inneurone-come le cellule SH-SY5Y rispetto ai livelli nelle cellule di controllo sane (CTR: 33,79 ± 1,45 percento). Come mostrato nella Figura 6B, CK come tZ, cZ e K hanno ridotto significativamente il livello di superossido nelle cellule intossicate da Glu: 0.1 uM tZ, 0.1 uM cZ, 1 uM e 10 uM K lo ha ridotto a 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 e 83,8 ± 2,32 percento dei livelli nelle cellule trattate con Glu da solo. Questi livelli sono paragonabili a quelli ottenuti con l'inibitore della necroptosi NEC-1 (80,5 ± 3,19 percento a 5 uM e 80,4 ± 2,70 percento a 50 uM) e il ferro chelante DFO (80,2 ± 3,80 percento a 10 uM). I risultati ottenuti con il modello di morte cellulare indotta da Glu, in particolare gli effetti dei controlli positivi, sono coerenti con i rapporti precedenti [70,73]. Le prove precedenti che i CK hanno effetti di riduzione dell'OS in modelli indotti da Glu o simili si limitano a una dimostrazione che K è un potente agente di riduzione dell'OS (a circa 23 uM) nel modello di morte cellulare indotta da Glu basato su cellule HT22 [18 ]. Abbiamo scoperto che K aveva un effetto di riduzione dell'OS a concentrazioni inferiori (1–10 uM) nelle nostre cellule SH-SY5Y. Inoltre, sono stati osservati effetti benefici a lungo termine di tZ sui fibroblasti umani, inclusa l'attività di decomposizione del perossido di idrogeno [15], suggerendo che tZ e cZ possono avere effetti indiretti di riduzione dell'OS nei modelli di morte cellulare indotta da Glu. Inoltre, altri rapporti hanno evidenziato le associazioni tra l'effetto di riduzione della OS mediato da CKs e l'attività protettiva [22,74-76]. Presi insieme, tZ, cZ e K hanno mostrato effetti di riduzione dell'OS sorprendentemente forti, paragonabili a quelli dei controlli positivi, nonostante i diversi punti di forza in generaleneuroprotettivoeffetto.

Figura 5. (A) Tasso di mortalità dineurone-come le cellule SH-SY5Y nel modello di morte cellulare indotto dal glutammato (Glu); (B) Tossicità indotta da glu (rilascio di LDH) dineurone-come le cellule SH-SY5Y. Si triplica in almeno tre giorni indipendenti.* P rispetto al veicolo con 160 uM Glu, # P rispetto al veicolo senza 160 uM Glu.

Figura 6. (A) Stress ossidativo (OS) indotto da glu e attività di riduzione dell'OS dei composti indicati nell'uomoneurone-cellule simili a SH-SY5Y visualizzate mediante microscopia a fluorescenza dopo l'etichettatura del diidroetidio (DHE). Bar=50 ehm. Le immagini mostranoneuronecellule simili a SH-SY5Y trattate con DMSO (controllo), 160 mM di glutammato (Glu) e insieme a: 10 uM di deferoxamina (più DFO), 50 uM di necrostatina{{6} } (più NEC-1), 0,1 uM tZ (più tZ) e 0,1 uM cZ (più cZ) per 4 h, quindi colorati con DHE. (B) Formazione di radicali superossido indotta da Glu inneurone-come le cellule SH-SY5Y dopo 4 h. Il grafico mostra la quantificazione delle cellule colorate con DHE utilizzando il lettore di micropiastre Infinite M200 Pro (Tecan, Austria). Si triplica in cinque giorni indipendenti.

* P rispetto al veicolo con 160 uM Glu, # P rispetto al veicolo senza 160 uM Glu.

2.9. Effetti delle citochinine sull'attività della caspasi-3/7 nel modello di morte cellulare indotta da Glu

Glu ha effetti tossici simili sulle cellule SH-SY5Y agli effetti precedentemente riportati sulle cellule HT22 associati al blocco Xc-antiporter. Pertanto, in entrambi i casi sono coinvolti meccanismi di morte cellulare non apoptotica (ferroptosi, necroptosi, ecc.) [62] sebbene l'espressione della caspasi-3 e, in una certa misura, la subunità NMDA di NR1 possa verificarsi più fortemente in SH -SY5Y cellule [61]. Quindi, le fasi finali della morte cellulare nelle due linee cellulari possono differire. Un ruolo contributivo dell'attività della caspasi-3 è stato osservato in molti studi nel modello di morte cellulare indotto dal Glu delle cellule SH-SY5Y [62,77–79]. In questo saggio,neurone-come le cellule SH-SY5Y sono state trattate qui con 160 mM Glu, che porta all'aumento dell'attività della caspasi-3/7. Nel tentativo di chiarire il ruolo dell'apoptosi nella morte indotta da Glu delle cellule SH-SY5Y, è stato applicato uno specifico inibitore della caspasi-3/7, Ac-DEVD-CHO, che ha dimostrato di avere un forte effetto inibitorio: a 50 nM ha ridotto l'attività della caspasi-3,7 al 23,70 ± 1,01 percento del livello nelle cellule trattate

con Glu da solo e a 0,5 uM ha bloccato quasi completamente l'attività (riducendola a un livello normalizzato di appena 7,22 ± 1,05 percento; paragonabile al livello osservato nelle cellule sane:

7,8 ± 0,39 percento), come mostrato nella Figura 7. L'applicazione di controlli positivi ha comportato una graduale diminuzione dose-dipendente dell'attività della caspasi-3,7. È interessante notare che NEC-1 ha avuto un leggero effetto con effetto massimo a 50 uM e DFO ha avuto un'attività inibitoria più robusta a 10 uM (riducendo l'attività a 80,5 ± 1,85 e 75,8 ± 3 .00 percento, rispettivamente). D'altra parte, solo effetti lievi ma significativi sul casp-3,7 sono stati raggiunti da tZ a 1 uM (89,5 ± 2,50 percento), cZ a 0,1 uM (87,4 ± 1,62 percento) e K a 1 uM ( 91,0 ± 2,06 percento). Presi insieme, i risultati mostrano che entrambi i controlli positivi avevano un'attività di riduzione dell'attività della caspasi-3/7 più forte rispetto ai CK testati, ma i CK avevano effetti a concentrazioni molto più basse. Nel complesso, i risultati indicano che la modulazione dell'attività della caspasi-3/7 svolge un ruolo chiave nel potenteneuroprotettivoattività di agenti come DFO [58] nel modello di morte cellulare indotto da Glu [79,80]. Tuttavia, come mostrato in questa sezione, anche NEC-1 lo avevaneuroprotettivoattività, suggerendo che altri tipi di morte cellulare potrebbero essere coinvolti nella morte indotta da Glu di cellule SH-SY5Y simili a neuroni [63,67,81]. Indicazioni che i meccanismi indipendenti dalla caspasi sono coinvolti nella morte cellulare indotta da Glu sono state ottenute anche nell'analisi degli effetti di NEC-1 [70], DFO [69] e K [18] sulle cellule HT22.

Figura 7. Attività della caspasi-3/7 nel modello Glu del danno ossidativo dineurone-come le cellule SH-SY5Y. Si triplica in almeno quattro giorni indipendenti. * P rispetto al veicolo con 160 uM Glu, # P rispetto al veicolo senza 160 uM Glu.

3. Conclusioni

In sintesi, il nostro studio ha rivelato che le CK e i loro metaboliti hannoneuroprotettivoattività nel modello indotto da SAL dimorbo di Parkinsone danno ossidativo indotto da Glu in SH-SY5Y umano differenziatoneuronalecellule. K3G, cZR e iPR sono risultati biologicamente significativineuroprotettivoattività. Inoltre, i CK attivi sono risultati efficaci a concentrazioni inferiori (submicromolari e micromolari) rispetto alla sostanza di controllo positiva NAC. Anche K3G, cZR e iPR hanno avuto effetti positivi su vitalità, citotossicità, stress ossidativo e attività della caspasi-3,7 (tranne iPR). Le dimostrazioni ortogonali indicano fortemente che l'attività di stress antiossidante gioca un ruolo chiave negli effetti protettivi dei CK nel modello di morte cellulare indotta da SAL. Solo tre metaboliti nel pannello testato di CK (tZ, cZ e K) sono protettineurone-come le cellule SH-SY5Y nel modello di danno ossidativo indotto da Glu in modo simile al chelatore del ferro NEC1 e all'inibitore della necroptosi DFO. Per confermare la loro attività promettente, abbiamo testato i loro effetti nel test di rilascio della lattato deidrogenasi (LDH) ortogonale. I CK avevano un'attività protettiva moderata ma significativa. Questo era più debole rispetto alle corrispondenti attività delle sostanze di controllo, ma nonostante le differenze nella modulazione dineuronalesalute, tutti e tre i CK testati hanno stimolato potenti riduzioni della formazione di radicali superossido, in modo simile alle sostanze di controllo positivo. I CK avevano anche effetti comparabili sullo stress ossidativo indotto dal Glu nelle cellule SH-SY5Y a quelli di NEC1 e DFO, ma questi composti avevano effetti inibitori più forti sull'attività della caspasi-3/7 rispetto ai CK. Poiché la morte cellulare indotta da Glu non si basa su un percorso dipendente dalla caspasi, come mostrato negli studi sugli effetti di DFO e NEC-1 sulle cellule HT-22 [70], i CK possono apparentemente modulare sia la caspasi- morte cellulare dipendente e -indipendente riducendo lo stress ossidativo [18,82]. Negli studi in corso, il meccanismo d'azione dettagliato delle CK e/o i loro effetti mitocondriali suneuronaleo verranno studiate le cellule degli astrociti.

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4. Materiali e metodi

4.1. Sostanze chimiche e reagenti

citochininagli standard sono stati ottenuti da OlChemIm (Olomouc, Repubblica Ceca). Calcein AM (soluzione da 1 mg/mL) e kit di rilascio LDH e un kit per la crescita di neurite sono stati acquistati da ThermoFisher. Ioduro di propidio, diidroetidio, componenti della caspasi- 3/7 tampone del test, DMEM/F12 1:1 terreno, siero bovino fetale, tripsina, ATRA, salsolinolo bromidrato, glutammato sale monosodico, deferoxamina, N-acetilcisteina , Ac-DEVD-CHO e DMSO per colture cellulari sono stati acquistati da Sigma Aldrich (Merck). Il substrato Ac-DEVD-AMC è stato fornito da Enzo Life Science.

4.2. Saggi di attività di scavenging radicale ORAC

La capacità dei composti di eliminare i radicali liberi in vitro è stata determinata mediante il test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). Brevemente, fluoresceina (100 ul, 500 mM) e 25 ul della soluzione del composto testato sono stati aggiunti a una 96-micropiastra a pozzetti pre-incubata a 37oC. Successivamente, 25 ul di 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. Coltura cellulare SH-SY5Y

La linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y acquistata da ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) è stata coltivata in Eagle's Medium e Ham's F12 Nutrient Mixture di Dulbecco modificato (DMEM: F-12, 1:1 ), integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina e streptomicina a 37 oC in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2. Le cellule sono state passate fino a 20 volte e i media sono stati cambiati due o tre volte a settimana. La densità cellulare è stata impostata in modo appropriato per il dosaggio pianificato (5000, 7000, 10.000 o 20.000 cellule per pozzetto) in 96-piastre multipozzetti in 100 ul di volumi totali di mezzo per ogni sperimentare. Il giorno dopo la semina, alle cellule è stato aggiunto ATRA in mezzo FBS DMEM/F12 all'1% fino a una concentrazione finale di 10 uM e l'incubazione è stata continuata per altre 48 h per indurre la differenziazione, consentire la formazione di neuriti più lunghi e ridurre proliferazione.

4.4. Microscopia

Micrografie dineuronecellule simili a SH-SY5Y sono state ottenute utilizzando un microscopio a fluorescenza LED DM IL (Leica Microsystems, Mannheim, Germania) con un filtro di eccitazione appropriato per il test, o una configurazione in campo luminoso con una fotocamera digitale DP73 ad alte prestazioni (Olympus, Tokyo, Giappone ). Poiché il rapporto segnale-rumore per la colorazione era moderato, il contrasto è stato leggermente regolato nel software ImageJ (Fiji) senza influire sull'osservazione risultante. Le immagini originali sono incluse nei Materiali Supplementari.

4.5. Colorazione della membrana cellulare (kit per la crescita dei neuriti, Invitrogen™)

Neuronecellule simili a SH-SY5Y (5000 cellule per pozzetto) ottenute con la procedura di differenziazione di 48 ore sono state colorate con un kit di crescita dei neuriti (Invitrogen™) secondo le raccomandazioni del produttore con lievi modifiche. Le cellule sono state lavate con PBS, etichettate con una soluzione del colorante di colorazione della membrana fornito con il kit (seguendo il protocollo per 96 piastre multipozzetti) in PBS per 20 minuti a 37 oC, nuovamente lavate con PBS e osservate al microscopio a fluorescenza ( rispettivamente con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 533 e 585 nm).

4.6. Trattamento cellulare

Dopo la procedura di differenziazione, il mezzo di differenziazione è stato modificato in un mezzo DMEM/F12 all'1% integrato con composti di prova a concentrazioni di 0.1, 1 e 10 uM (con 7000 cellule per pozzetto per i test di citotossicità) o insieme alla tossina SAL a 500 uM (con 7000–10.000 cellule per pozzetto) o 160 mM Glu (con 20.000 cellule per pozzetto) per una durata appropriata per il tipo di dosaggio (vitalità, morte cellulare, ecc.). Le cellule di controllo sono state trattate con un mezzo contenente lo 0,1% di DMSO.

4.7. Vitalità cellulare e morte cellulare

La fattibilità dineuronecellule simili a SH-SY5Y che crescono in 96-micropiastre (con circa 7000 cellule per pozzetto) dopo 24 h di trattamenti sono state valutate mediante il test Calcein AM con modifiche minori [31]. La soluzione di Calcein AM in PBS utilizzata aveva una concentrazione di 0,75 uM e il tempo di incubazione era impostato a 50 min. Il numero di cellule viventi in ciascun pozzetto è stato determinato utilizzando un lettore di micropiastre Infinite M200 Pro (Tecan, Austria), rispettivamente con lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione di 495 e 517 nm.

Morte cellulare dineurone-come cellule (modello SAL: 10,{2}} cellule per pozzetto; modello Glu: 20,{5}} cellule per pozzetto) è stato determinato mediante saggio PI come riportato da Stone et al. 2003 con piccole modifiche [83]. In breve, il mezzo del modello indotto da SAL è stato aspirato e cambiato in una soluzione da 1 ug/mL di PI in PBS, ma le cellule sottoposte a induzione con Glu hanno un'aderenza più debole, quindi è stata aggiunta una soluzione da 1 mg/mL di PI in PBS dare una concentrazione finale di 1 ug/mL. In entrambi i casi, le cellule sono state incubate per altri 15-25 minuti a temperatura ambiente, quindi la fluorescenza PI è stata misurata da un lettore Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Austria) con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 535 e 617. La risultante fluorescenza PI ottenuta con le sole tossine è stata impostata come morte cellulare al 100%.

4.8. Misurazione dello stress ossidativo mediante il dosaggio del diidroetidio (DHE).

Le cellule sono state differenziate e trattate come descritto nella sezione precedente per l'induzione di SAL (10,{2}} cellule per pozzetto, 24 ore o induzione di Glu (20,000 cellule per pozzetto, 4 ore). i trattamenti, le cellule sono state centrifugate a 500 xg per 330 s, quindi i terreni di coltura sono stati sostituiti (dopo l'aspirazione) con una soluzione di DHE 10 uM in PBS. 96-piastre multipozzetto con cellule sono state incubate al buio per 30 minuti in camera temperatura, quindi la fluorescenza DHE è stata misurata da un lettore di micropiastre Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Austria) con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 500 e 580 nm. La fluorescenza DHE risultante ottenuta con SAL o Glu da solo è stata impostata come radicale superossido al 100%. Microfotografie illustrative in fluorescenza di cellule colorate con DHE sono state ottenute dopo la misurazione del DHE con il lettore di micropiastre.

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4.9. Misurazione dell'attività delle caspasi-3/7

I saggi in una fase della caspasi-3/7 sono stati eseguiti secondo una procedura pubblicata in precedenza [84]. Per le colture sottoposte a induzione di SAL e induzione di Glu, le miscele di reazione (caspasi-3,7 tampone e componenti con cellule in 96-piastre multipozzetto) sono state incubate per 2 ore e 3 ore a 37 oC, rispettivamente. L'attività della caspasi-3/7 è stata quindi misurata da un lettore di micropiastre Infinite M200 Pro (Tecan, Austria) con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 346 e 438 nm.

4.10. Analisi statistica

Gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato e ripetuti in tre o cinque (n {0}}–5) giorni indipendenti. Tutti i dati sono espressi come media ± SEM. I valori per tutte le variabili misurate sono espressi come medie ± SEM, che sono state calcolate utilizzando Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA), che è stato utilizzato anche per generare le figure. L'analisi statistica è stata effettuata dal pacchetto software PAST (ver. 1.97) [85]. Per l'esperimento di differenziazione è stato utilizzato il test t di Student. Il resto degli esperimenti è stato valutato mediante test di Kruskal–Wallis non parametrico con test post hoc di Mann–Whitney con correzione sequenziale di Bonferroni. Un valore di p < 0,05="" è="" stato="" considerato="">

Materiali supplementari: le immagini originali sono disponibili online.

Contributi dell'autore: I contributi degli autori sono stati i seguenti: indagine, metodologia, convalida, analisi dei dati, GG, CWD e JG; scrittura: preparazione della bozza originale GG, CWD e MS; cura dei dati, acquisizione di finanziamenti, supervisione, scrittura, revisione e modifica, CWD, MS e PK Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento: questo lavoro è stato finanziato in parte da sovvenzioni dell'Agenzia di sovvenzioni interne dell'Università Palacky di Olomouc, Repubblica Ceca (IGA{{0}}PrF_2020_021), dell'Agenzia di sovvenzioni ceca ({{ 2}}S) e il Fondo europeo di sviluppo regionale—Progetto ENOCH (n. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) e una borsa di studio del Fondo di dotazione della Palacky University.

Dichiarazione del Comitato di revisione istituzionale: Non applicabile.

Dichiarazione di consenso informato: Non applicabile.

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati: i dati sono contenuti nell'articolo o nel materiale supplementare.

Ringraziamenti: gli autori ringraziano Dita Jordovd, Jana Hrubešovd e Lucie Koplikovd per l'eccellente assistenza tecnica. Inoltre, gli autori ringraziano Sees-editing Ltd., Regno Unito, per la modifica in inglese del manoscritto.

Conflitti di interesse: Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Disponibilità dei campioni: i campioni dei composti non sono disponibili presso gli autori.