Parte 3: Un modello murino unico di esercizi di prima infanzia consente la memoria ippocampale e la plasticità sinaptica

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Materiali e metodi

Animali. I topi selvatici erano la progenie di madri C57Bl6J, originariamente ottenute dai Jackson Laboratories e successivamente allevate nelle nostre strutture per animali. I topi avevano libero accesso a cibo e acqua e le luci erano mantenute su un ciclo luce/buio di 12 ore. Dopo lo svezzamento in un giorno postnatale (P) 21, i topi sono stati alloggiati in gabbie standard o in gabbie dotate di una ruota mobile. Sia i topi maschi che quelli femmine sono stati utilizzati per tutti gli esperimenti di esercizio e comportamento. Solo i topi maschi sono stati utilizzati per gli studi elettrofisiologici. Tutti i test comportamentali sono stati eseguiti durante il ciclo della luce. Gli esperimenti sono stati condotti secondo le linee guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali e sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università della California, Irvine.

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Paradigma della ruota da corsa. Dopo lo svezzamento su P21, i topi sono stati alloggiati in coppie in gabbie standard senza ruota o dotati di una ruota mobile o fissa in acciaio inossidabile (diametro 4,5 cm, 112 grammi, Starr Life Sciences). Gli animali alloggiati con ruote funzionanti avevano libero accesso per periodi prestabiliti: una settimana durante il periodo giovanile (P21–27; juv ELE), una settimana durante l'adolescenza (P35–41; Adol ELE) o tre settimane consecutive di accesso (P21– 41; juv-adol ELE). Un ulteriore gruppo di topi è stato alloggiato con una ruota fissa durante P21–41 (sta) per controllare l'arricchimento ambientale dalla presenza di una ruota nella gabbia. Ogni ruota era dotata di una rete in poliuretano leggero per evitare che i piccoli arti dei topi svezzati scivolassero attraverso i pioli delle ruote. L'attività di corsa è stata monitorata tramite sensori monitorati digitalmente collegati a una porta dati e un computer per l'acquisizione dei dati in tempo reale (Sofware Vital View) tramite il rilevamento magnetico dei giri delle ruote. Ogni ruota monitorata digitalmente ha tracciato la distanza di corsa per la gabbia (due topi alloggiati per gabbia, quindi la distanza percorsa per gabbia rappresenta la distanza totale percorsa tra due topi). Le rivoluzioni sono state quantificate al minuto ogni giorno per la durata della corsa e convertite in distanza percorsa per gabbia (km).

Posizione dell'oggettomemoriaprotocollo (OLM). La posizione dell'oggettomemoriail protocollo utilizzato in questo studio è stato adattato e modificato rispetto ai protocolli precedenti44. In un giorno postnatale 36, i topi sono stati portati in una sala prove con una luminosità ridotta della stanza. I topi sono stati maneggiati per circa 2 minuti ciascuno, per un totale di 5 giorni consecutivi prima della sessione di formazione OLM (due volte al giorno per i primi 2 giorni seguiti da una volta al giorno per i successivi 3 giorni). Le sessioni di assuefazione erano di 5 minuti, due volte al giorno per 3 giorni (P38-P40) e si svolgevano all'interno di camere contenenti quattro segnali spaziali unici su ciascuna parete della camera (linee orizzontali, X nera, striscia verticale e parete vuota) . L'abitudine si è sovrapposta agli ultimi 2 giorni di manipolazione. Durante la fase di addestramento (P41), i topi sono stati posti nelle stesse camere con due oggetti identici ed esposti a un periodo di addestramento sottosoglia (3 min) o soglia (10 min); un disegno di studio basato sul lavoro precedente che dimostra che 3 minuti di formazione sono in genere insufficienti per il lungo terminememoriaformazione45. Per i topi nelle gabbie per esercizi, le ruote scorrevoli sono state bloccate immediatamente dopo l'allenamento OLM per eliminare gli effetti acuti dell'eserciziomemoriaconsolidamento. Il giorno del test (P42; 24 ore dopo l'addestramento), uno degli oggetti è stato spostato in una nuova posizione all'interno della camera e i topi sono stati quindi autorizzati a esplorare gli oggetti per 5 minuti. I tempi trascorsi con ciascun oggetto sono stati determinati tramite analisi alla cieca mediante punteggio manuale e i valori ottenuti sia nei giorni di addestramento che in quelli di test sono stati convertiti in un indice di discriminazione (DI), basato sulla nuova posizione dell'oggetto durante il test: [(tempo trascorso esplorare un nuovo oggetto – tempo trascorso esplorando un oggetto familiare)/(tempo totale esplorando entrambi gli oggetti) × 100 percento]. Non ci sono state differenze significative inmemoriaprestazioni tra animali sedentari e quelli alloggiati con una ruota stazionaria, quindi questi gruppi sono stati combinati e rappresentati come "nessun ELE" in tutte le analisi OLM. Le prove di assuefazione sono state analizzate per la distanza percorsa attraverso le sessioni utilizzando il software di analisi comportamentale ANY-maze (Stoelting Co). Sono stati esclusi dall'analisi i topi con tempi di esplorazione irregolari tra i due oggetti durante la fase di addestramento (DI > 20) o che non mostravano una diminuzione della distanza totale percorsa durante le sessioni di assuefazione.

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studi di elettrofisiologia. Gli esperimenti di elettrofisiologia sono stati eseguiti come descritto in precedenza e la fonte di questi metodi è stata pubblicata altrove66. Solo topi maschi sono stati utilizzati per esperimenti elettrofisiologici. In breve, i topi maschi di tutti i gruppi ELE sono stati sacrificati tra P42-51 e sono state raccolte fette dall'ippocampo rostrale. Le fette coronali sono state sezionate (Leica VT1000 S) a uno spessore di 320 um e collocate in una camera di registrazione dell'interfaccia con liquido cerebrospinale artificiale preriscaldato (31 ± 1 grado) (124 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 1,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 e 10 mM d-glucosio). Le fette sono state continuamente perfuse a una velocità di 1,75–2 ml al minuto mentre la superficie delle fette è stata esposta a 95% di O2/5% di CO2 caldo e umidificato. Le registrazioni sono iniziate dopo almeno 2 h di incubazione. I potenziali postsinaptici eccitatori di campo (fEPSP) sono stati registrati dallo strato radiatum CA1b utilizzando una singola pipetta di vetro (2-3 MΩ) riempita con NaCl 2 M. Gli impulsi di stimolazione (0,05 Hz) sono stati forniti alle proiezioni collaterale-commissurali di Schafer utilizzando un elettrodo stimolante bipolare (filo di nicromo ritorto, 65 μm) posizionato in CA1c. L'intensità di corrente è stata regolata per ottenere il 50 percento della massima risposta fEPSP. Dopo aver stabilito una linea di base stabile, l'LTP è stato indotto con un singolo treno di cinque burst theta, in cui ogni burst (quattro impulsi a 100 Hz) è stato erogato a 200 ms di distanza (cioè, alla frequenza theta). L'intensità della stimolazione non è stata aumentata durante TBS. I dati sono stati raccolti e digitalizzati da NAC 2.0 Neurodata Acquisition System (Teta Burst). I dati nella cifra LTP sono stati normalizzati agli ultimi 10 minuti del basale e presentati come media ± SE. Le misure di base sulle curve I/O, la facilitazione degli impulsi accoppiati e l'LTP sono state analizzate utilizzando un'analisi ANOVA a due vie e un'analisi di regressione lineare (software Graphpad Prism 8).Cistanche può aiutare a migliorare la memoria.

Analisi statistiche. Gli ANOVA unidirezionali sono stati utilizzati per analizzare l'effetto dei tempi dell'esercizio nella prima infanzia sui DI di acquisizione OLM (Fig. 2d, g), sui DI test OLM (Fig. 2e, h) e sui tempi di esplorazione totali del test OLM (Fig. 2f , i) all'interno di ciascun sesso. I confronti multipli post-hoc di Dunnett sono stati utilizzati per effettuare confronti specifici con il gruppo "no ELE" (sedentario) quando sono stati osservati risultati ANOVA significativi. L'ANOVA a due vie è stata utilizzata per analizzare il peso del topo guadagnato durante il periodo ELE (Fig. 1b, fattori del gruppo ELE e del sesso). Le misure ripetute a due vie (RM) -ANOVA sono state utilizzate per analizzare la distanza di corsa giornaliera (Fig. 1c-e, fattori del giorno e del sesso postnatale), le sessioni di assuefazione (Fig. 2b, c) e per confrontare l'acquisizione OLM DI rispetto al test DI per ogni mouse per i confronti all'interno del gruppo. I test post hoc di Sidak sono stati utilizzati per effettuare confronti specifici quando sono state osservate interazioni significative o effetti principali di un gruppo di corsa o di una sessione OLM. Inoltre, è stata eseguita un'ANOVA a tre vie per i DI di test OLM per determinare eventuali interazioni significative tra tre variabili nominali (durata dell'allenamento OLM, gruppo ELE e sesso). Per i rari casi in cui non sono stati registrati i dati di 24 ore di corsa per un determinato giorno, i valori sono stati imputati sulla base della distanza media di corsa dei tre giorni precedenti, per eseguire analisi statistiche. I test t di Student non accoppiato sono stati utilizzati per analizzare le distanze totali di corsa per ciascun gruppo ELE (Fig. 1f-h), nonché per confrontare i DI dei test OLM tra 3-min e 10-min topi sedentari addestrati. Le distanze di corsa cumulative sono espresse come medie ± SD. Gli effetti e le interazioni principali per tutti gli ANOVA sono descritti nel testo e nelle legende delle figure, insieme al numero specifico di animali di ciascun sesso utilizzati in ciascun esperimento. Tutte le analisi erano a due code e richiedevano un valore di 0.05 per la significatività. Le barre di errore in tutte le figure rappresentano SEM. Per tutti gli esperimenti, i valori ±2 deviazioni standard dalla media del gruppo sono stati considerati valori anomali e sono stati rimossi dalle analisi. Tutte le statistiche sono state eseguite con il software GraphPad Prism 8. Numero totale di topi utilizzati negli esperimenti comportamentali=152.

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Ricevuto: 16 gennaio 2020; Accettato: 13 maggio 2020;

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Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata dal National Institute of Neurological Disorders and Stroke of the National Institutes of Health, con il numero di premio K12NS098482 (assegnato all'ASI) e dalla UC Irvine School of Medicine, Dipartimento di Pediatria. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Marcelo Wood per le discussioni scientifiche e il contributo critico al progetto.

Contributi dell'autore

ASI, TY, SP, FS e TV hanno eseguito esercizi e esperimenti comportamentali e analizzato i dati; EK ha eseguito tutti gli esperimenti di elettrofisiologia, analizzato i dati e modificato il manoscritto; L'ASI ha progettato lo studio, analizzato i dati, interpretato i risultati e scritto il manoscritto.

interessi conflittuali

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Informazioni aggiuntive

La corrispondenza e le richieste di materiale vanno indirizzate all'ASI

Le informazioni sulle ristampe e sulle autorizzazioni sono disponibili all'indirizzo www.nature.com/reprints.

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