Parte 3: L'attivazione di un asse ippocampale CREB-pCREB-miRNA MEF2 modula la variazione individuale dell'apprendimento spaziale e della capacità di memoria

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Unicamente, miR-466f-3p sembra essere un regolatore positivo dell'apprendimento spaziale ememoria(Figure 1 e 3). È ormai accertato che la biogenesi, l'attività e la degradazione di specifici miRNA sono coinvolti nella regolazione della plasticità neuronale responsabile dell'apprendimento e della formazione a lungo termine.memoriaformazione (McNeill e Van Vactor, 2012) e l'espressione errata di alcuni di essi sono associati a disturbi neurologici (Issler e Chen, 2015; Salta e De Strooper, 2017). Ad esempio, nell'invertebrato Aplysia California, miR-124 regola la plasticità sinaptica mediata dalla serotonina attraverso la regolazione di CREB (Rajasethupathy et al., 2009). Un ruolo per i miRNA nello stress-associato, dipendente dall'amigdala

Cistanche può migliorare la memoria

Figura 6. Fosforilazione stocastica del CREB ippocampale e attivazione trascrizionale del cluster miR-466-669

(A) Mappe geniche di mSfmbt2 e del cluster miR-466-669. Le sequenze di codifica del miRNA-precursore del cluster miR-466-669 situato nell'introne 10 del gene mSfmbt2 sono mostrate come riquadri grigi. Il primo nucleotide del precursore con più di 50 miRNA (pre-mir-466m) è indicato più 1. Posizioni di diverse parti del trascritto primario del cluster di miR-466-669 (A–H) che esibiscono positivi ( più ) I segnali RT-qPCR sono indicati da barre grigie. La parte I che mostra nessun segnale () RT-qPCR è indicata dalla barra vuota. TSS, sito di inizio trascrizionale putativo del cluster miR-466-669.

(B) Livelli di espressione ippocampale relativa dell'mRNA mSfmbt2 di topi GLN, che mostrano livelli di miR-466f{2}} elevati, rispetto ai topi PLN (n=7 per gruppo). I valori Ct di mSfmbt2 sono ~29–32.

(C) Livelli di espressione ippocampale relativa della trascrizione primaria del cluster miR-466-669 (parti B e G) di topi GLN rispetto ai topi PLN (n=10 per gruppo).

(D) Analisi Western blotting dell'espressione di fosfo-CREB (pCREB), CREB totale (tCREB) e b-actina nell'ippocampo di topi GLN, PLN e HC. Vengono mostrate le macchie rappresentative (a sinistra) e l'istogramma a destra mostra il rapporto pCREB/tCREB relativo dopo la normalizzazione in b-actina (n=16 per gruppo). (E) I grafici a dispersione di correlazione di Pearson mostrano correlazioni tra i livelli di espressione dell'ippocampo del trascritto primario del cluster miR-466-669 e la proteina pCREB/tCREB del GLN individuale (n=18, R=0.52, *p=0.02, punti) e topi PLN (n=9, R=0.71, *p=0.03, quadrati, rispettivamente). Il livello medio per i topi HC (n=9) è stato impostato su 1.

(F) Analisi Western blotting dell'espressione di pCREB, tCREB e b-actina nei neuroni ippocampali primari DIV14 su LTP indotta chimicamente (da forskolina) e fosforilazione CREB inibita chimicamente (da 666-15). I neuroni sono stati trattati con 1 nM o 2 nM di 666-15 per 1 ora e quindi trattati con forskolina per 2 ore. L'istogramma mostra i rapporti pCREB/tCREB relativi.

(G e H) Confronto dei livelli di espressione di miR-466f-3p (G) e miR-466-669 trascrizione primaria del cluster (H) nei neuroni ippocampali primari DIV14 sotto {{4} } e trattamento con forskolina come descritto in (F). Gli mRNA di Nurr1 e homer1a sono controlli positivi. I segnali RT-qPCR delle parti B e G indicati in (A) sopra sono stati utilizzati per rappresentare la trascrizione primaria del cluster miR-466-669.

I dati mostrati in (B)–(D) sono presentati come media ± SEM e sono presentati i dati di tre serie indipendenti di esperimenti (n {{0}} per gruppo) mostrati in (F) e (G) come media ± DS. Il significato statistico è stato valutato mediante t-test spaiato (B e C), un ANOVA con il test post hoc di Tukey (D, F e G) o due ANOVA con il test post hoc di Tukey (H). Differenze statistiche: *p < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" e="" ****p=""><>

la paura dell'apprendimento e dell'estinzione è stata chiaramente dimostrata (Ronovsky et al., 2019; Sillivan et al., 2020). Inoltre, il test NOR aumenta l'espressione di miR-183/96/182 nell'ippocampo (Woldemichael et al., 2016). Come miR-124, miR specifico per il cervello-134 regola negativamente la pauramemoriaformazione e induzione di LTP nella regione CA1 dell'ippocampo del roditore attraverso la repressione traslazionale dell'mRNA di LimK1 (Gao et al., 2010). Per quanto riguarda il riconoscimento spaziale e oggettivomemoria, miR-132 è inducibile dalla modulazione di CREB dipendente dall'attività neuronale (Hansen et al., 2016). Simile a miR-132, abbiamo scoperto che l'attività neuronale induce miR-466f-3p attraverso l'attivazione trascrizionale di CREB (Figure 6F-6H). Tuttavia, a differenza di miR-466f-3p, miR-132 è indotto nei topi con prestazioni migliori o scarse in MWMtask (Figure 1BandS1A), probabilmente a causa di miR-132 essendo anche inducibile dallo stress (Shaltiel et al., 2013), come sarebbe il caso durante il compito MWM di lunga durata e stressante. Un'altra possibile ragione per cui i rapporti rilevati sono indistinguibili nei gruppi GLN e PLN è una limitazione del metodo di rilevamento che abbiamo utilizzato, con livelli basali elevati di miR-132, nonché ERK, che impediscono la nostra capacità di rilevare i cambiamenti di piega negli engram sparsi dei lisati dell'ippocampo. Sebbene i miRNA nel cluster miR-466-669 presentino alti gradi di somiglianza di sequenza, solo alcuni membri vengono indotti durante l'allenamento MWM (Figura 1B), probabilmente a causa della regolazione trascrizionale differenziale e/o della regolazione post-trascrizionale durante la biogenesi del miRNA (Michlewski e Ca ´ ceres, 2019; Siomi e Siomi, 2010).

In contrasto con questi altri miRNA, miR-466f-3p è emerso nel nostro studio come un regolatore positivo della plasticità neuronale tramite un CREB-pCREB-miR-466f-3p -Asse MEF2A (Figure 5 e 6). È noto che il compito MWM stimola la fosforilazione di CREB (Porte et al., 2008). pCREB regola positivamente la plasticità neuronale, così comememoriaallocazione e consolidamento, principalmente mediante attivazione trascrizionale di vari loci/geni genomici (Lisman et al., 2018). I nostri dati in vitro mostrano che l'attivazione di CREB tramite fosforilazione è necessaria per l'espressione di miR-466f-3p (Figure 6F e 6G). Significativamente, parallelamente all'aumento dei livelli ippocampali di miR-466f-3p (Figura 1B), abbiamo scoperto che CREB è stato attivato dalla fosforilazione di topi GLN, ma non PLN (Figura 6D; vedi sotto). Inoltre, il nostro approccio combinatorio di utilizzo della sovraespressione mediata da lentivirali e dell'inibizione della spugna dimostra che l'induzione di miR466-3p è una causa primaria di un migliore apprendimento spaziale ememoriacapacità (Figura 3C). In correlazione con i risultati dell'attività MWM, i topi che sovraesprimono miR-466f- 3p nell'ippocampo hanno mostrato un LTP più forte, come evidenziato dall'aumento delle fEPSP rispetto al controllo o al virus della spugna miR topi infetti (Figura 4B).

Meccanicamente, miR-466f-3p reprime la traduzione dell'mRNA di Mef2a, riducendo così i livelli di proteina MEF2A, un regolatore negativo della crescita della colonna vertebrale dendritica indotta dall'apprendimento ememoriaformazione (Cole et al., 2012; Flavell et al., 2006), nell'ippocampo dei topi GLN (Figure 5D, 5F e 5G). È stato riportato che MEF2A/2D inibisce l'induzione delle sinapsi dendritiche eccitatorie (Flavell et al., 2006). Sebbene entrambi questi studi precedenti, rispecchiando il nostro studio qui presente utilizzando la sovraespressione di miR-466f-3p o gli approcci di inibizione basati su spugna miR (Figura 2A), hanno esaminato l'arborizzazione dendritica e non hanno riportato differenze tra wild- tipo e soggetti con sovraespressione o knockdown MEF2, nessuno dei due studi ha analizzato l'effetto sulla lunghezza dendritica. Va menzionato qui che sebbene i 30 UTR di Mef2d mRNA ospitano anche un sito di legame predittivo per miR-466f-3p, la sovraespressione miR-466-f-3p non influenzare l'attività di reporter di un plasmide trasportato da Mef2d 30 UTR (dati non mostrati). In particolare, Cole et al. (2012) hanno mostrato che i livelli di proteine ​​MEF2A/D sono sottoregolati nell'ippocampo di topi addestrati nel labirinto d'acqua. Inoltre, poiché i loro topi addestrati con successiva sovraespressione di MEF2 presentavano uno spazio normalememoria, hanno concluso che la sovraespressione di MEF2 ha interrotto in modo specifico la formazione della memoria spaziale, ma non esistente. Tuttavia, la loro manipolazione della memoria era temporalmente limitata, perché il vettore del virus dell'herpes simplex (HSV) utilizzato per l'espressione del transgene raggiungeva tipicamente il picco a 2-4 giorni dopo la microiniezione e si dissipava 8-12 giorni dopo la microiniezione (Cole et al., 2012). D'altra parte, abbiamo utilizzato il lentivirus, il cui DNA sarebbe integrato nei cromosomi dell'ospite, conferendo un'infezione permanente consentendo una manipolazione duratura dell'apprendimento/memoria(Figura 3). Infine, una piccola percentuale (25%) di topi GLN non ha mostrato induzione di miR-466f-3p durante l'attività MWM (Figura 1C), suggerendo che altri fattori e/o percorsi possono contribuire al apprendimento spaziale ememoriacapacità di questi topi GLN. Abbiamo valutato miR-335-5p e Sgk mRNA, entrambi espressi in modo differenziale durante l'apprendimento spaziale e la formazione della memoria (Capitano et al., 2017; Tsai et al., 2002). Tuttavia, a differenza dei ratti o dei topi di razza CD1, non abbiamo osservato alcuna differenza nei livelli ippocampali di miR-335-5p o Sgk mRNA di topi GLN rispetto ai topi PLN (Figure S1A e S5). Pertanto, l'attivazione stocastica dell'asse CREB- pCREB-miR-466f-3p-MEF2A sembra essere la causa principale alla base della variazione individuale dell'apprendimento spaziale ememoriacapacità dei nostri topi consanguinei C57BL/6J.

L'espressione genica stocastica tra cellule geneticamente identiche, operanti a livello di trascrizione, traduzione o modifica post-traduzionale, è stata studiata intensamente (Eling et al., 2019; Reinius e Sandberg, 2015). Questa stocasticità è alla base della variabilità da cellula a cellula nelle funzioni cellulari e della conseguente diversità delle caratteristiche fenotipiche manifestate nello stesso microambiente in risposta a stimoli ambientali durante la differenziazione/sviluppo (Eling et al., 2019). Due esempi ben studiati di tale stocasticità nell'espressione genica a livello cellulare, sono la scelta del promotore del recettore olfattivo e del promotore Pcdh specifico nel cluster genico olfattivo dei singoli neuroni sensoriali olfattivi dei mammiferi, che sono entrambi attivati ​​su interruttore epigenetico (Magklara e Lomvardas, 2013 ). La decisione stocastica e irreversibile sull'uso del promotore Pcdh risulta da una combinazione di variazione del numero di copie, cambiamenti nella metilazione del DNA e trascrizione dell'RNA non codificante (Canzio et al., 2019). Parallelamente, sono state osservate in precedenza la stocasticità nell'espressione genica e il rimodellamento della trasduzione del segnale in tessuti specifici, incluso l'ippocampo, tra roditori geneticamente identici (Alfonso et al., 2002; I GH et al., 2014V). Il nostro studio presenta una prova che mostra quella variazione fenotipica di individui diversi, in particolare la variazione nel loro apprendimento spaziale ememoriacapacità, è modulata dalla stocasticità dell'attivazione di CREB nell'ippocampo e dalla conseguente attivazione trascrizionale del cluster miR- 466-669, che porta a livelli elevati di uno specifico miRNA (miR-466f-3p) inibendo l'espressione di un regolatore negativo di memoria (MEF2A). Tuttavia, non è ancora chiaro se anche altri miRNA codificati dal cluster miR-466-669 contribuiscano a un migliore apprendimento ememoriacapacità. Questa eterogeneità fenotipica potrebbe essere dovuta all'eterogeneità cellulare nell'ippocampo, che può portare a variazioni nell'espressione genica dell'engram indotta dall'attività (Jaeger et al., 2018; Rao-Ruiz et al., 2019).

In questo momento, non è noto quando e come venga determinata la stocasticità dell'attivazione del CREB ippocampale su specifici stimoli neuronali. È probabile che esista un meccanismo locus-specifico che consente al CREB stocasticamente fosforilato di attivare il promotore del cluster miR-466-669. Tuttavia, al momento, non esiste un database pubblico disponibile sul sito di inizio trascrizionale (TSS) di questo cluster di miRNA e c'è solo un potenziale motivo di legame CREB situato a 5 kb a monte del presunto TSS del cluster miR-466-669 . Al momento non è noto se pCREB attivi questo cluster di miRNA direttamente o indirettamente, così come i meccanismi sottostanti. In particolare, il cluster miR-466-669 esiste solo nei roditori. Tuttavia, i miRNA umani has-miR-466 e hsa-miR-3941 hanno sequenze di semi simili a quelle del topo mmu-miR-466f-3p e sono in grado di eseguire il paring di base con il 30 UTR dell'mRNA MEF2A umano, come previsto da miRWalk 2.0 (Sticht et al., 2018). Inoltre, è stato anche dimostrato che un altro noto miRNA umano (hsa-miR-1) regola negativamente l'espressione di MEF2A (Ikeda et al., 2009). Pertanto, l'attivazione stocastica di CREB-pCREB-miR-466f-3p-MEF2Aaxis scoperta in questo studio rappresenta un meccanismo generale per la generazione di variazioni all'interno delle specie dell'apprendimento spaziale ememoriacapacità tra individui diversi che potrebbero essere evolutivamente benefici per la selezione naturale.

STAR più METODI

I metodi dettagliati sono forniti nella versione online di questo documento e includono quanto segue:

d TABELLA RISORSE CHIAVE

d DISPONIBILITA' DELLE RISORSE

B Contatto di piombo

B Disponibilità dei materiali

B Disponibilità di dati e codici

d MODELLO SPERIMENTALE E DETTAGLI OGGETTO

B Animali

Colture di cellule B

d DETTAGLI DEL METODO

B Morris labirinto d'acqua compito

B Test di riconoscimento di nuovi oggetti (NOR)

B Attività del labirinto di Barnes (BM).

Ibridazione di microarray B miRNA e analisi RT-qPCR

B Costruzione del plasmide

Trasfezione delle cellule B e trattamento chimico Ibridazione in situ del miRNA B (ISH)

B Preparazione del lisato proteico, western blotting, colorazione con immunofluorescenza e analisi dell'imaging

B Colorazione Golgi

B Infezione da lentivirus ricombinante dei neuroni ippocampali primari del topo

B Iniezione di lentivirus ricombinante nell'ippocampo di topo

B Registrazione patch-clamp a celle intere

B Elettrofisiologia

B Saggio reporter della luciferasi d QUANTIFICAZIONE E ANALISI STATISTICA

INFORMAZIONI SUPPLEMENTARI

Ulteriori informazioni possono essere trovate online su https://doi.org/10.1016/j. celrep.2021.109477.

RINGRAZIAMENTI

Ringraziamo la National RNAi Core Facility dell'Academia Sinica per la preparazione di lentivirus ricombinanti, la Neuroscience Core Facility dell'Academia Sinica (AS-CFII-108-106) per le tecniche di registrazione fEPSP e la registrazione di cellule intere nei neuroni in coltura e l'Istituto di Molecular Biology Imaging Core e Bioinformatics Core per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche il Dr. Hsien-Sung Huang (Università Nazionale di Taiwan) per aver fornito il vettore lentivirale pFUGW-dsRed. Questa ricerca è stata supportata dalla Taipei Medical University, il Frontier of Science Award (MOST 107-2321-B-001-016); sovvenzioni del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST), Taipei, Taiwan (MOST 108- 2320-B-038-066 e MOST 109-2320-B-038-071); e un Senior Investigator Award dall'Academia Sinica, Taipei, Taiwan.

CONTRIBUTI D'AUTORE

I.-FW, K.-JT e C.-KJS hanno progettato gli esperimenti. G.-JH ha fatto la colorazione del Golgi. I.-FW, con l'aiuto di YW e Y.-HY, ha eseguito tutti gli altri esperimenti. I.-FW ha eseguito l'analisi dei dati. I.-FW e C.-KJS hanno scritto il manoscritto.

DICHIARAZIONE DI INTERESSI

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

INCLUSIONE E DIVERSITÀ

Abbiamo lavorato per garantire l'equilibrio sessuale nella selezione dei soggetti non umani. Abbiamo lavorato per garantire la diversità nei campioni sperimentali attraverso la selezione delle linee cellulari. Pur citando riferimenti scientificamente rilevanti per questo lavoro, abbiamo anche lavorato attivamente per promuovere l'equilibrio di genere nella nostra lista di riferimento.

Ricevuto: 27 aprile 2020

Revisionato: 7 giugno 2021

Accettato: 13 luglio 2021

Pubblicato: 3 agosto 2021

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