Parte Ⅰ: i glicosidi feniletanoidi di Cistanche Tubulosa inducono l'apoptosi delle cellule di carcinoma epatocellulare tramite le vie MAPK dipendenti dai mitocondri e migliorano l'effetto antitumorale attraverso la combinazione con il cisplatino

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Changshuang Fu, Yi Yang, Aipire Adila, Fangfang Zhou, Xianxian Wei, Weilan Zhang, Jie Lv, Yijie Li, Lijie Xia, Jinyao Li

Astratto

Cistanche tubuloseè un tipo di erboristeria cinese ed esercita diverse funzioni biologiche. Studi precedenti lo hanno dimostratoCistanche tubulosa glicosidi feniletanoidi (CTPG)mostrano effetti antitumorali su una varietà di cellule tumorali. Tuttavia, gli effetti antitumorali del CTPG sulle cellule di carcinoma epatocellulare (HCC) HepG2 e BEL-7404 sono ancora elusivi. Il nostro studio ha mostrato che il CTPG ha inibito significativamente la crescita delle cellule HepG2 e BEL-7404 attraverso l'induzione dell'arresto del ciclo cellulare e dell'apoptosi, che era associata all'attivazione delle vie MAPK caratterizzate dalla fosforilazione up-regolata di p38, JNK, e ERK1/2 e via mitocondriale-dipendente caratterizzata dalla riduzione del potenziale della membrana mitocondriale. Il rilascio del citocromo c e la scissione della caspasi-3, -7, -9 e PARP sono stati successivamente aumentati dal trattamento con CTPG. Inoltre, CTPG ha soppresso in modo significativo la migrazione di HepG2 riducendo i livelli di metalloproteinasi della matrice-2 e fattori di crescita endoteliale vascolare. È interessante notare che il CTPG non solo ha migliorato la proliferazione degli splenociti, ma ha anche ridotto l'apoptosi degli splenociti indotta dal cisplatino. Nel modello murino del tumore H22, il CTPG combinato con il cisplatino ha ulteriormente inibito la crescita delle cellule H22 e ridotto gli effetti collaterali del cisplatino. Nel loro insieme, il CTPG ha inibito la crescita dell'HCC attraverso l'effetto antitumorale diretto e l'effetto di potenziamento immunologico indiretto e ha migliorato l'efficacia antitumorale del cisplatino.

Parole chiave

Cistanche tubuloseglicosidi feniletanoidi, apoptosi, via MAPK, via mitocondriale-dipendente, cisplatino, immunoenhancement.

introduzione

Si prevedeva che il cancro al fegato fosse il sesto tumore più comunemente diagnosticato e la quarta causa di morte per cancro nel mondo nel 2018, con circa 841 000 nuovi casi e 782000 decessi ogni anno nel sud-est asiatico (Mongolia, Cambogia e Vietnam) .1 In Cina, il cancro al fegato è stata la terza causa di morte per cancro nel 2015.2 Più del 90% dei tumori primari del fegato sono carcinoma epatocellulare (HCC) in tutto il mondo. Attualmente, l'epatectomia, il trapianto di fegato e l'ablazione percutanea sono i metodi principali per il trattamento dell'HCC. Sfortunatamente, questi trattamenti sono efficaci per il 30% dei pazienti con diagnosi di carcinoma epatico in fase iniziale, mentre i pazienti con diagnosi di carcinoma epatico avanzato (che rappresentano il 40%) devono fare affidamento su cure palliative per prolungare il loro tempo di sopravvivenza.3,4 Sorafenib in combinazione con la chemioembolia arteriosa è un'importante e comune terapia palliativa per la maggior parte dei pazienti con carcinoma epatocellulare avanzato nella regione Asia-Pacifico.5 Sorafenib, approvato dalla FDA nel 2006 per il trattamento del carcinoma epatico avanzato, è un inibitore della chinasi multipla che inibisce la proliferazione delle cellule tumorali e produzione e promuove l'apoptosi delle cellule tumorali. Sorafenib estende significativamente il tempo di sopravvivenza del paziente da 3 a 5 mesi, ma ha gravi effetti collaterali ed è strettamente correlato all'insorgenza di resistenza ai farmaci.6 Pertanto, è urgente sviluppare nuovi farmaci o strategie per l'HCC.

La medicina tradizionale cinese (MTC) da sola o in combinazione con altre strategie è stata utilizzata per il trattamento dell'HCC e ha mostrato benefici clinici tra cui un tempo di sopravvivenza prolungato, una migliore qualità della vita, una riduzione delle reazioni avverse e così via.7,8Cistancheè una MTC contenente glicosidi feniletanoidi (PhG), iridoidi, lignina e polisaccaridi che ha varie funzioni biologiche, come funzioni antiossidanti, antinfiammatorie, antinvecchiamento, potenziamento della memoria e potenziamento immunitario.9 I PhG sono stati considerati come i principali componenti attivi diCistanche, e hanno molteplici funzioni tra cui antiossidante, antinfiammatoria, anti-apoptosi, epatoprotezione e neuroprotezione.10-12 Il nostro gruppo aveva riferito cheCistanche tubulosa glicosidi feniletanoidi(CTPG) potrebbe inibire la crescita delle cellule del melanoma B16-F10, delle cellule Eca{2}} del carcinoma esofageo e delle cellule HCC H22 attraverso vie di segnalazione estrinseche o intrinseche in vitro o in vivo; inoltre, il CTPG ha avuto un effetto immunostimolante.13-15

In questo studio, abbiamo studiato l'effetto antitumorale e il meccanismo del CTPG sulle cellule HepG2 e BEL-7404 in vitro, analizzato la funzione immunomodulante del CTPG in vitro e in vivo e ulteriormente valutato l'effetto terapeutico del CTPG combinato con la chemioterapia farmaco cisplatino su topi con tumore HCC H22 in vivo. Abbiamo scoperto che CTPG potrebbe inibire la crescita delle cellule HepG2 e BEL-7404 attraverso l'apoptosi dipendente dai mitocondri e la via di segnalazione MAPK. CTPG ha inibito significativamente la migrazione delle cellule HepG2 riducendo i livelli di metalloproteinasi della matrice-2 (MMP-2) ​​e fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF). Inoltre, il CTPG ha promosso la proliferazione e l'attivazione delle cellule immunitarie e ha migliorato l'immunità dei topi. È importante sottolineare che il CTPG combinato con il cisplatino può inibire ulteriormente la crescita delle cellule H22 in vivo e ridurre gli effetti collaterali del cisplatino.

Materiali e metodi

Animali

Circa 6-8 settimane di età maschi BALB/c, topi Kunming e femmine C57BL/6 sono stati acquistati dall'Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Cina) e alloggiati in una struttura per animali dell'Università dello Xinjiang con la temperatura ambiente (RT) di 25±3 gradi e un periodo di luce-buio di 12/12 ore.

Le linee cellulari e colture cellulari

Le cellule H22 murine sono state acquistate da Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Cina) e le cellule umane HCC HepG2 e BEL-7404 sono state ottenute dallo Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering , Xinjiang University (Urumqi, Xinjiang, Cina) e coltivato in terreno RPMI 1640 (Gibco, USA) o Dulbecco's modificato Eagle's medium (DMEM) (Gibco) contenente il 10% di siero bovino fetale inattivato al calore (MRC, Cina), 1% L -glutamina (100 mM), 100 U/mL di penicillina e 100 ug/mL di streptomicina a 37 gradi in un'atmosfera umidificata con il 5 percento di CO2.

Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)

I principali composti di CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, Cina) sono stati qualificati e quantificati mediante HPLC come riportato in precedenza.13 È stata utilizzata una colonna ZORBAX SB-C18 (250×4,6 mm; 5μm) e la fase mobile consisteva in una soluzione di acido formico allo 0,2% e metanolo con un gradiente dal 23% al 31%. Un totale di 10μL di campione è stato iniettato e rilevato a 330 nm. Gli standard di echinacoside e acteoside (Yuanye, Shanghai, Cina) sono stati utilizzati per analizzare i componenti del CTPG.

Analisi della vitalità cellulare

Gli effetti antitumorali del CTPG sulle cellule HepG2 e BEL-7404 sono stati valutati utilizzando MTT (3-(4, 5-dimetil-2-tiazolil)-2, {{7 }}difenile-2-H-tetrazolio bromuro). Le cellule HepG2 e BEL-7404 sono state piastrate in 96-piastre a pozzetti (5 × 104 cellule/pozzetto) e trattate con 0, 200, 400 e 600 ug/mL CTPG rispettivamente per 24 e 48 ore, dopo 24 ore di incubazione a 37 gradi. Come controllo positivo è stato utilizzato circa 35 ug/mL di cisplatino (Yuanye). Quindi sono stati aggiunti 100 μL di MTT (0,5 mg/mL, diluito per mezzo senza mezzo FBS) a ciascun pozzetto e messi in coltura per 3 ore a 37 gradi e 5% di CO2. Dopo l'incubazione, le piastre sono state centrifugate a 1200 rpm per 7 minuti, il mezzo è stato rimosso e 200 ug/mL di DMSO sono stati aggiunti a ciascun pozzetto per sciogliere i cristalli di formazano formati. I valori OD490 sono stati misurati da un 96-lettore per micropiastre (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Per valutare gli effetti del CTPG sugli splenociti, le cellule sono state isolate da topi C57BL/6 e piastrate in 96-piastre a pozzetti a una densità di 1 × 105 cellule/pozzetto. Gli splenociti sono stati trattati con 0, 200, 400 e 600 ug/mL rispettivamente per 24, 48 e 72 ore. La vitalità cellulare è stata calcolata con la formula seguente: vitalità cellulare ( percentuale )=(trattata con OD/non trattata) × 100 percento.

Rilevamento di Ki-67

Il rilevamento di Ki{{0}} è stato effettuato in base al nostro studio precedente.16 In breve, le cellule BEL-7404 sono state trattate con diverse concentrazioni (0, 200, 400 e 600 ug/mL) di CTPG o cisplatino (35 ug/mL). Dopo 24 ore, le cellule sono state raccolte e lavate con PBS, quindi fissate e permeabilizzate con Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience, USA) secondo le istruzioni del produttore. La colorazione intracellulare è stata eseguita utilizzando l'anticorpo Ki{10}} coniugato con FITC (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) per 15 minuti a temperatura ambiente. I campioni sono stati analizzati mediante citometria a flusso (BD FACSCalibur, CA, USA).

Analisi dell'apoptosi cellulare e del ciclo cellulare

Le cellule HepG2 e BEL-7404 sono state seminate a una densità di 2,5 × 105 cellule/piatto e incubate a 37 gradi durante la notte. Le cellule sono state tripsinizzate e raccolte mediante centrifugazione dopo il trattamento con varie concentrazioni di CTPG o pretrattate con inibitore della caspasi (Z-VAD-FMK) o inibitore della caspasi-3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Cina) per 2 ore prima del trattamento CTPG. Dopo 24 ore, l'apoptosi è stata rilevata mediante citometria a flusso. In breve, le cellule raccolte sono state lavate con PBS freddo (Gibco) e risospese in tampone legante l'annessina con 2,5μL di annessina V-FITC e 5μL di soluzione colorante PI-PE (Solarbio, Pechino, Cina), quindi le cellule sono state incubate a temperatura ambiente al buio per 15 minuti. Per l'analisi della distribuzione del ciclo cellulare, le cellule sono state raccolte dopo il trattamento con CTPG e fissate in etanolo freddo al 70% a 4 gradi per 30 minuti. Le cellule sono state colorate con PI (BD Biosciences) al buio per 30 minuti. I campioni sono stati analizzati mediante citometro a flusso (BD FACSCalibur). I livelli di espressione dell'apoptosi cellulare e delle proteine ​​​​correlate al ciclo sono stati rilevati dal Western blot.

macchia occidentale

Il Western blot è stato eseguito secondo il nostro studio precedente.17 HCC è stato trattato con CTPG per 24 ore. Dopo aver lavato due volte con PBS ghiacciato, tutte le cellule aderenti e galleggianti sono state raccolte e lisate in RIPA Lysis Buffer (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) per 20 minuti su ghiaccio. Dopo centrifugazione a 12000 rpm 4 gradi per 10 minuti, la concentrazione proteica è stata determinata utilizzando un kit di analisi dell'acido bicinconinico (Thermo Fisher Scientific, USA) secondo le istruzioni del produttore. La stessa concentrazione di proteine ​​è stata separata dal 12% di SDS-PAGE e trasferita su membrane PVDF. Dopo il lavaggio con tampone PBST (PBS con 0,05 percento di Tween-20), le membrane sono state bloccate con il 5 percento di latte scremato a 37 gradi per 1 ora e quindi incubate con gli anticorpi primari (Cell Signaling Technology, MA, USA ) a diluizioni adeguate durante la notte a 4 gradi . Dopo aver lavato 3 volte con PBST, la membrana è stata incubata con i corrispondenti anticorpi secondari coniugati con HRP (eBioscience) per 2 ore a 37 gradi. Le proteine ​​target sono state rilevate utilizzando un kit di analisi ECL (Beyotime). I dati di scansione in scala di grigi sono stati ottenuti dall'immagine J.

Analisi del potenziale della membrana mitocondriale (Δψm)

Δψm è stato determinato dal colorante JC-1 permeabile alla membrana (Beyotime). In breve, le cellule HepG2 e BEL-7404 sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG (0, 200, 400 e 600 ug/mL) per 24 ore. Tutte le cellule sono state raccolte e lavate con tampone di lavaggio JC-1. Le cellule sono state colorate con la sonda fluorescente JC-1 secondo le istruzioni del produttore per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con PBS due volte, tutti i campioni sono stati analizzati mediante citometria a flusso (BD FACSCalibur).

Hoechst 33342 colorazione

La colorazione Hoechst 33342 è stata eseguita secondo il nostro studio precedente.16 I cambiamenti morfologici dei nuclei sono stati esaminati utilizzando il colorante Hoechst 33342 (Beyotime) che lega il DNA permeabile alla membrana. In breve, le cellule sono state inoculate in una 6-piastra a pozzetti alla concentrazione di 1 × 105 cellule/pozzetto in un mezzo di 2 ml. Quando hanno raggiunto una confluenza dal 70% all'80%, le cellule sono state trattate con 200, 400 e 600 ug/mL di CTPG o cisplatino per 24 ore. Le cellule sono state lavate con PBS e fissate con paraformaldeide ghiacciata al 4% a 4 gradi per 10 minuti. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state colorate con Hoechst 33342 a 4 gradi per 10 minuti. I campioni sono stati osservati al microscopio invertito a fluorescenza (Nikon Eclipse Ti-E, Giappone).

Saggio di migrazione

La migrazione delle cellule HCC è stata rilevata attraverso il test di guarigione della ferita. In breve, le cellule HepG2 (2×104/pozzetto) sono state seminate in una 24-piastra a pozzetti. Dopo aver raggiunto l'80 percento di confluenza, il centro di ciascun pozzetto è stato graffiato una volta con un puntale da 20μL. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state trattate con cisplatino (35 ug/mL) o diverse concentrazioni (0, 200, 400 e 600 ug/mL) di CTPG a 37 gradi. Dopo 24 ore, le immagini di ciascun campione sono state riprese al microscopio (Nikon Eclipse Ti-E). Le distanze medie della migrazione cellulare sono state analizzate dall'immagine J. La percentuale di guarigione della ferita è stata calcolata dall'equazione: guarigione della ferita ( percentuale )=(1-area di graffio nel punto temporale indicato/area di graffio a 0 ore)×100 per cento . I livelli di espressione delle proteine ​​correlate alla migrazione cellulare MMP-2 e VEGF sono stati rilevati mediante Western blot.

Proliferazione e apoptosi degli splenociti

Per l'analisi della proliferazione, gli splenociti sono stati isolati da 3 topi C57BL/6 e colorati con CFSE (eBioscience). Le cellule marcate con CFSE sono state inoculate in 24-piastre a pozzetti a una densità di 2 × 106 cellule in 1 ml di terreno per pozzetto e trattate con diverse concentrazioni di CTPG (200, 400 e 600 ug/mL) o combinate con 35 ug /mL cisplatino per 72 ore. L'analisi della citometria a flusso è stata eseguita dopo la colorazione con CD3-APC e CD19-PE (BD Biosciences). Per l'analisi dell'apoptosi, gli splenociti sono stati inoculati in 24-piastre a pozzetti a una densità di 2 × 106 cellule in 1 mL di terreno per pozzetto e trattati con diverse concentrazioni di CTPG (200, 400 e 600 ug/mL) o combinati con cisplatino per 24 ore. L'analisi della citometria a flusso è stata eseguita dopo la colorazione con 2,5 μl di annessina V-FITC e 5 μl di soluzione PI-PE.

Valutazione della Sicurezza e Attività Immunostimolanti del CTPG In Vivo

Per valutare le attività immunostimolanti in vivo del CTPG, i topi maschi Kunming da 6 a 8 settimane sono stati divisi casualmente in 7 gruppi (5 topi/gruppo). L'iniezione sottocutanea (sc, 200, 400 mg/kg), l'iniezione intraperitoneale (ip, 200, 400 mg/kg) e la somministrazione intragastrica (ig, 200, 400 mg/kg) sono state applicate ogni 2 giorni per un totale di 7 volte , mentre il gruppo di controllo non ha ricevuto alcun trattamento. I topi hanno pesato a giorni alterni e lo stato dei topi è stato osservato ogni giorno. Dopo il trattamento con CTPG, gli organi dei topi sono stati separati e pesati. Gli indici degli organi sono stati calcolati secondo la formula: indice degli organi=peso dell'organo (mg)/peso corporeo (g). Gli splenociti sono stati raccolti, contati e colorati con anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC o anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). I campioni sono stati rilevati mediante citometria a flusso (BD FACSCalibur).

Efficacia antitumorale del CTPG combinato con cisplatino nei topi portatori di tumore H22

A topi BALB/c maschi di circa 6-8 settimane sono stati iniettati per via sottocutanea cellule H22 (1.{5}} × 106 per topo in 100 μL di PBS). Quando i volumi del tumore hanno raggiunto circa 60 mm3, i topi portatori di tumore sono stati divisi casualmente in 4 gruppi (6 topi/gruppo) e trattati con cisplatino (4 mg/kg), CTPG (400 mg/kg), cisplatino (4 mg/kg) più CTPG ( 400 mg/kg) o senza trattamento (gruppo di controllo), rispettivamente. I topi tumorali sono stati iniettati per via intraperitoneale con CTPG rispettivamente il 5°, 7°, 9°, 11° e 13° giorno. Il cisplatino è stato iniettato per via endovenosa il 7° e l'11° giorno. Il volume del tumore e il peso corporeo sono stati misurati a giorni alterni. Il volume del tumore è stato calcolato come segue: volume del tumore (V)=a × b2 /2, in cui a e b rappresentano rispettivamente il diametro più lungo e quello più corto di un tumore misurati con un calibro a corsoio. Il 20° giorno, organi e tumori sono stati isolati e pesati. Gli splenociti sono stati raccolti, contati e colorati con anti-CD3-APC e anti-CD19-PE o anti-CD4-FITC e anti-CD8-APC o anti-CD11b-PE e anti-Gr-1-APC o anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC e anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Successivamente, le frequenze e il numero delle cellule sono stati analizzati mediante citometria a flusso (BD FACSCalibur).

Analisi statistica

Tutti i dati sono stati espressi come media ± errore standard della media (SEM). L'analisi statistica è stata condotta utilizzando l'analisi della varianza a una/due vie (ANOVA) utilizzando il software Prism5.{2}}. P<.05 was="" considered="" statistically="">

Risultati

CTPG ha inibito la proliferazione delle cellule HCC in vitro

I componenti del CTPG sono stati qualificati e quantificati mediante HPLC utilizzando standard di echinacoside e acteoside (Figura supplementare 1A), che erano i componenti principali dei glicosidi feniletanoidi di Cistanche. 18 Secondo i tempi di ritenzione di picco e le aree di picco, il CTPG conteneva il 28% di echinacoside e il 9,9% di acteoside. Inoltre, il contenuto di polisaccaridi nel CTPG era del 34,8% con il metodo dell'acido fenolo-solforico.19 Il test MTT ha mostrato che il CTPG ha ridotto significativamente la vitalità delle cellule BEL-7404 e HepG2 in modo dose e tempo dipendente ( Figura 1A). Coerentemente, la proliferazione delle cellule BEL-7404 è stata significativamente inibita dal trattamento CTPG, che è stato analizzato mediante colorazione Ki-67 (Figura 1B). L'effetto del CTPG sulla proliferazione degli splenociti in vitro è stato anche analizzato mediante saggio MTT. Abbiamo osservato che il CTPG ha migliorato la proliferazione degli splenociti in modo dose-dipendente (Figura 1C).

La via di segnalazione della protein chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) svolge un ruolo fondamentale nella sopravvivenza, differenziazione e resistenza ai farmaci delle cellule tumorali umane.20 Al fine di indagare se la via di segnalazione MAPK fosse coinvolta nell'effetto inibitorio del CTPG sulla proliferazione delle cellule HCC, i livelli di fosforilazione di varie proteine ​​​​dalla via del segnale MAPK sono stati analizzati nelle cellule HepG2 dopo il trattamento con CTPG a diverse concentrazioni e diversi punti temporali. La fosforilazione di JNK (P-JNK) e p38 (P-p38) è stata potenziata in modo dose-dipendente dal trattamento CTPG. La fosforilazione di ERK (P-ERK) è stata sottoregolata dal trattamento CTPG da 200 e 400 ug/mL, mentre P-ERK è stata sovraregolata dal trattamento CTPG da 600 ug/mL (Figura 1D). Inoltre, i livelli di P-JNK, P-p38 e P-ERK sono stati sovraregolati in modo dipendente dal tempo (Figura 1D). Questi risultati hanno suggerito che il CTPG potrebbe inibire la proliferazione delle cellule HCC attraverso la via di segnalazione MAPK

Arresto del ciclo cellulare indotto da CTPG in fase S

Abbiamo ulteriormente analizzato se il CTPG ha inibito la proliferazione cellulare dell'HCC attraverso l'induzione dell'arresto del ciclo cellulare. Dopo il trattamento con CTPG, è stato osservato un accumulo di cellule BEL-7404 nella fase S in modo dose-dipendente. Allo stesso modo, il CTPG ha anche indotto l'arresto del ciclo cellulare HepG2 in fase S e le frequenze sono aumentate dal 40,66% nel gruppo di controllo al 61,90% nel gruppo trattato con CTPG da 600 ug/mL (Figura 2A). Le cicline e le chinasi ciclina-dipendenti (CDK) svolgono ruoli importanti nel controllo e nello sviluppo della divisione cellulare,21 dei quali sono stati associati alla fase G2/M.22 Il livello di espressione della ciclina D1 è stato diminuito in modo dose-dipendente dal trattamento con CTPG ma ha promosso G1 a Progressione della fase S. Anche i livelli di espressione di Cyclin B1, CDK1 e CDK2 sono stati ridotti; queste proteine ​​erano associate alla fase G2/M (Figura 2B). Questi risultati hanno suggerito che il CTPG ha soppresso la proliferazione cellulare dell'HCC inducendo l'arresto del ciclo cellulare.

Via di apoptosi dipendente dai mitocondri attivata da CTPG nelle cellule HCC

Abbiamo anche rilevato se CTPG ha attivato l'apoptosi nelle cellule HCC e abbiamo scoperto che l'apoptosi indotta da CTPG nelle cellule HepG2 e BEL-7404 in modo dose-dipendente (Figura 3A). Inoltre, i livelli di espressione di Bax e Bcl-2 sono stati aumentati e ridotti rispettivamente dal trattamento con CTPG in modo dose-dipendente (Figura 3B). L'apoptosi delle cellule HepG2 è stata ulteriormente determinata mediante colorazione Hoechst 33342 dopo trattamento con CTPG per 24 ore. La morfologia nucleare è stata osservata da un microscopio a fluorescenza invertita. Come mostrato nella Figura 3C, le cellule HepG2 di controllo sono state colorate in modo omogeneo mentre le cellule HepG2 trattate con CTPG hanno mostrato condensazione e frammentazione della cromatina in modo dose-dipendente, che era simile alle cellule HepG2 trattate con cisplatino. Questi risultati hanno indicato che l'apoptosi indotta da CTPG delle cellule HCC.

L'integrità della membrana mitocondriale esterna è strettamente regolata dalla famiglia Bcl-2 e la riduzione di Δψm promuove il rilascio del citocromo c che attiva la cascata di caspasi per indurre l'apoptosi.23,24 Quando Δψm diminuisce, il JC{{ 3}} il polimero (fluorescenza rossa) si decompone in monomeri (fluorescenza verde).25 Pertanto, il Δψm delle cellule HCC è stato rilevato dalla colorazione JC-1 dopo il trattamento con CTPG per 24 ore. Come mostrato nella Figura 4A, l'intensità della fluorescenza verde del canale FL-1 è stata aumentata in modo dose-dipendente dal trattamento CTPG mentre l'intensità della fluorescenza rossa del canale FL-2 è stata ridotta in modo dose-dipendente in entrambi Cellule BEL-7404 e HepG2. L'osservazione al microscopio a fluorescenza invertita ha mostrato un risultato simile (Figura 4B), indicando che CTPG riduce il Δψm delle cellule HCC. Successivamente, abbiamo osservato che i livelli di citocromo c erano aumentati sia nelle cellule BEL-7404 che nelle cellule HepG2 dopo il trattamento con CTPG (Figura 4C), il che ha ulteriormente confermato la riduzione di Δψm nelle cellule HCC trattate con CTPG.

Il rilascio del citocromo c può attivare l'iniziatore della caspasi-9 per indurre l'apoptosi.26 I risultati del test Western blot hanno suggerito che i livelli di caspasi scissa-3, -7 e{{4} } sono stati aumentati mentre il livello di caspasi scissa-8 non è stato modificato (Figura 5). La caspasi attivata-3 può scindere l'enzima di riparazione del DNA della poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) per prevenire la riparazione del DNA e accumulare danni al DNA.27 Abbiamo anche osservato livelli sovraregolati di PARP scisso. Il ruolo della cascata della caspasi nell'apoptosi delle cellule HCC indotta dal CTPG è stato ulteriormente determinato utilizzando rispettivamente l'inibitore della caspasi (Z-VAD-FMK) e l'inibitore della caspasi-3 (Ac-DEVD-CHO). Z-VAD-FMK ha invertito significativamente l'apoptosi delle cellule BEL-7404 e HepG2 indotte da CTPG (Figura 1B supplementare). Allo stesso modo, Ac-DEVD-CHO ha anche invertito significativamente l'apoptosi delle cellule HepG2 indotte da CTPG (Figura 1C supplementare). I risultati hanno dimostrato che il CTPG ha indotto l'apoptosi delle cellule HCC da una via mitocondriale-dipendente.

CTPG ha soppresso la migrazione cellulare HCC in vitro

La migrazione delle cellule tumorali è considerata uno dei processi critici nelle metastasi tumorali. Per determinare se il CTPG influisce sulla migrazione delle cellule HCC, la motilità delle cellule HepG2 è stata valutata mediante il test di guarigione delle ferite. Come mostrato nelle Figure 6A e B, la migrazione delle cellule HepG2 è stata significativamente inibita dal trattamento con CTPG in modo dose-dipendente. La famiglia MMP e il VEGF svolgono ruoli critici nella migrazione delle cellule tumorali.28 Dopo il trattamento con CTPG per 24 ore, i livelli di MMP-2 e VEGF erano significativamente ridotti (Figura 6C), suggerendo che il CTPG potrebbe sopprimere l'invasione e la metastasi di HCC.

CTPG ha migliorato l'immunità dei topi

È stato riportato che i polisaccaridi di Cistanche deserticola hanno funzioni immunomodulatorie tra cui la promozione della proliferazione dei linfociti e l'attivazione dei macrofagi.29 I linfociti T e B sono i principali linfociti, che mediano rispettivamente le risposte immunitarie cellulari e umorali. Il CTPG conteneva il 34,8% di contenuto di polisaccaridi. Pertanto, abbiamo esaminato gli effetti del CTPG sulla proliferazione dei linfociti T e B. Come mostrato nella Figura 2A supplementare, CTPG ha aumentato significativamente la proliferazione delle cellule T e delle cellule B in modo dose-dipendente, anche in presenza di cisplatino. È interessante notare che il CTPG ha inibito significativamente l'apoptosi degli splenociti indotta dal cisplatino (Figura 2B supplementare), indicando che il CTPG potrebbe migliorare gli effetti collaterali del cisplatino sul sistema immunitario dei topi.

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