ParteⅠMiglioramento dell'azoto ureico nel sangue e della creatinina sierica utilizzando una nuova coltivazione di Cordyceps Militaris

Astratto

La malattia renale cronica (CKD) è un problema critico di salute pubblica con un enorme onere finanziario sia per i pazienti che per la società in tutto il mondo. Sfortunatamente, attualmente non esistono terapie efficaci per prevenire o ritardare la progressione della malattia renale allo stadio terminale (ESRD). Le pratiche della medicina tradizionale cinese hanno dimostrato che i miceli dei militari di Cordyceps (C. militari) hanno una varietà di proprietà farmacologicamente utili, tra cui l'antitumorale, l'immunomodulazione e l'epatoprotezione. Tuttavia, l'effetto delle forze armate di C. micelio sulla CKD rimane poco chiaro. Metodi. Qui, abbiamo studiato gli effetti del micelio di C. militaris sui topi con CKD utilizzando quattro tipi di media: HKS, HKS con vitamina A (HKS più A), CM e CM con vitamina A (CM più A). Risultati. I risultati del giorno 10 hanno rivelato che i livelli di azoto ureico nel sangue (BUN) erano significativamente più bassi nei gruppi HKS (41 percento), HKS più A (41 percento) e CM più A (34 percento) rispetto a quelli del gruppo corrispondenti gruppi di controllo (topi nefrectomia). Il livello di creatinina sierica nel gruppo HKS più A è diminuito del 35 percento il giorno 10, mentre i livelli nei gruppi HKS e CM più A sono diminuiti solo del 14 percento e del 13 percento, rispettivamente, il giorno 30. Nel complesso, questo è il primo rapporto che utilizza quattro nuovi media (HKS, HKS plus A, CM e CM plus A medium) per C. militaris mycelia. Ciascun mezzo di micelio C. militaries su CKD mostra un effetto specifico su BUN, creatinina sierica, peso corporeo, proteine ​​totali e acido urico. Conclusioni. Presi insieme, questo è il primo rapporto che utilizza quattro nuovi media (HKS, HKS plus A, CM e CM plus A medium) per C. militaris mycelia. Ciascun mezzo di micelio C. militaris su CKD mostra effetti specifici su BUN, creatinina sierica, peso corporeo, proteine ​​totali e acido urico. Abbiamo concluso che il trattamento con micelio di C. militaris coltivato in terreno HKS o CM plus A potrebbe potenzialmente prevenire il deterioramento della funzione renale nei topi con CKD.

Parole chiave

Malattia renale cronica (CKD), Cordyceps sinensis, Micelio, Azoto ureico nel sangue (BUN), Creatinina sierica,Benefici Cistanche.

Clicca qui per otteneregli effetti di Cistanche

introduzione

La malattia renale cronica (CKD) è un problema di salute globale prevalente [1]. CKD è un termine generico per i disturbi eterogenei che interessano la struttura e la funzione del rene [2]. I pazienti con CKD hanno un aumentato rischio di malattia renale allo stadio terminale (ESRD) [3, 4]. Gli agenti farmacologici esistenti si concentrano sulle complicanze legate ai trattamenti della CKD, come l'iperlipidemia, il diabete e l'ipertensione piuttosto che sul trattamento specifico della CKD stessa [5-8], rendendo lo studio della protezione renale una scienza medica emergente. Precedenti studi si sono concentrati sulla protein chinasi 2 (HIPK2) che interagisce con l'omeodominio perché è un regolatore trascrizionale dell'espressione genica coinvolto nella lesione tubulare e nella fibrosi [9, 10]; tuttavia, specifici inibitori HIPK2 non sono disponibili in commercio. Inoltre, è stato dimostrato che il blocco del sistema renina-angiotensina-aldosterone riduce sia il rischio di progressione dell'iperkaliemia che il tasso di recidiva [11, 12]. Sebbene il farmaco inibitore della renina aliskiren sia stato precedentemente somministrato insieme agli inibitori dell'enzima di conversione dell'angiotensina o ai bloccanti del recettore dell'angiotensina, ora viene utilizzato in modo più conservativo a causa dei suoi gravi effetti collaterali [13].

È stato riportato che i fattori di rischio per la malattia renale cronica erano l'età, la razza, l'obesità, il diabete, il basso peso alla nascita, l'ipertensione e la storia familiare [14]. Il rischio di morbilità e mortalità dell'insufficienza renale cronica rimane considerevolmente elevato, con i pazienti affetti da insufficienza renale cronica che di solito ricevono una terapia renale sostitutiva, come la dialisi e il trapianto di rene. .us, devono essere sviluppati nuovi trattamenti. Negli ultimi anni, le terapie a base di erbe hanno fornito un'opzione terapeutica alternativa per la malattia renale cronica [15, 16]. Inoltre, molti tipi di ricerca hanno dimostrato che le corrette prescrizioni di fitoterapia cinese hanno un effetto positivo sulla CKD, che può ridurre significativamente il rischio di ESRD nei pazienti con CKD e migliorare il tasso di sopravvivenza a lungo termine dei pazienti con CKD [17]. Ad esempio, è stata studiata l'efficacia di diverse erbe, tra cui Radix Astragali, Rheum officinale, Panax ginseng e Lycopus lucidus, sulle malattie renali [18-21]. Alcune erbe hanno mostrato risultati promettenti nella diminuzione della proteinuria o nell'aumento dell'albumina sierica. Altri, tuttavia, contengono ingredienti tossici, come l'acido aristolochico o metalli pesanti, che possono influire negativamente sulla funzione renale e indurre nefropatia [22]. Sebbene siano stati utilizzati frequentemente in alcuni paesi in via di sviluppo, i rapporti sulla loro efficacia rimangono controversi. Pertanto, lo sviluppo di un composto efficace derivato da un prodotto naturale per il trattamento della malattia renale cronica è una preoccupazione urgente.

Cordyceps appartiene alla famiglia dei funghi ed è un tipo di medicina tradizionale cinese in cui le larve di insetti parassiti crescono e si trasformano gradualmente in un corpo fruttifero maturo. Cordyceps sinensis (C. sinensis) e Cordyceps militari (C. militari) sono due specie ben note di Cordyceps. Per molti anni, C. sinensis è stato usato per trattare l'affaticamento, la disfunzione renale e polmonare, l'iperglicemia, l'iperlipidemia e l'aritmia [23], e i suoi effetti nei pazienti con CKD e trapiantati di rene sono stati studiati [24-26]. In generale, C. militaris è relativamente suscettibile alla produzione di massa [27] e mostra proprietà farmacologiche sia diverse che specifiche [28-30]. Inoltre, uno studio precedente condotto dal nostro gruppo ha studiato le funzioni antitumorali di C. militaris e ha dimostrato che la sua fermentazione miceliale potrebbe regolare la via del segnale delle chinasi proteiche attivate dal mitogeno (MAPK) per arrestare il ciclo cellulare, stimolare la disgregazione del DNA cromosomico e infine causare la morte sia apoptotica che autofagica delle cellule di glioblastoma in coltura [31]. .quindi, C. militaris verrebbe impiegato per i suoi effetti renoprotettivi in ​​questo studio.

Il micelio C. militaris è stato recentemente sviluppato come alimento funzionale popolare in Asia. Estratti dal corpo fruttifero di C. militaris potrebbero ritardare significativamente la progressione della disfunzione renale indotta dalla nefrectomia subtotale [32]. Gli studi sull'effetto del micelio di C. militaris sulla malattia renale cronica, tuttavia, sono rari. Questo studio metterà alla prova la nostra ipotesi che il micelio C. militaris possa potenzialmente prevenire il deterioramento della funzione renale nei topi con insufficienza renale cronica. Saranno progettati e impiegati quattro tipi di terreni per incubare i militari miceliali di C.: (i) HKS, (ii) HKS più A, (iii) CM e (iv) CM più A. Per 30 giorni, i topi nei gruppi di trattamento riceveranno la somministrazione giornaliera mediante sonda gastrica del micelio di C. militaris coltivato in uno dei quattro diversi terreni, mentre i topi nei gruppi controllo sham (C) e controllo nefrectomia (Nx) riceveranno acqua distillata. Questi test dovrebbero chiarire la sicurezza del micelio C. militaris come alimento funzionale.

Cistanche tubulosa

Materiali e metodi

1. Materiali.

C. militaris mycelia (BCRC 32219) sono stati acquistati dal Bioresource Collection and Research Center presso l'Istituto di ricerca e sviluppo dell'industria alimentare (Hsinchu, Taiwan). Il glucosio è stato acquistato da JT Baker (UE). L'estratto di malto, il peptone e l'estratto di lievito sono stati acquistati da Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA). La vitamina A è stata acquistata da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) e l'agar è stato acquistato rispettivamente da High Standard Enterprise Co., Ltd. (Taiwan). I kit di analisi biochimiche per il rilevamento della funzione renale sono stati ottenuti da Arkray (Kyoto, Giappone).

2. Preparazione dei media dei funghi.

Mycelial C. militaris è stato incubato in quattro tipi di terreno, vale a dire CM, CM plus A, HKS e HKS plus A. Il terreno CM conteneva il 2% di estratto di malto, il 2% di agar, 0.1% di peptone, e il 2% di glucosio [33]. Il terreno .e HKS era una modifica di un terreno ideato dal Prof. Huang Keng-Shiang e conteneva il 2% di estratto di malto, il 2% di agar, 0,2% di peptone e 0,2% di estratto di lievito . I media CM e HKS differivano nelle concentrazioni del peptone e dell'estratto di lievito. I terreni HKS plus A e CM plus A contenevano ciascuno un ulteriore 1% di vitamina A nel terreno di base. Un quadrato di 0.5 × 0.5 cm di micelio di C. militaris è stato tagliato e trapiantato su ciascuna piastra e incubato a 25 gradi . Dopo che il C. militaris è stato coltivato nei diversi terreni per 30 giorni, i miceli fungini sono stati accuratamente raschiati via dalla superficie del mezzo solido usando un coltello. Le polveri di micelio fungino raccolte sono state liofilizzate (EYELA FDU-1100) nel vuoto a -54 gradi per 48 ore. Le polveri di micelio di C. militaris liofilizzate sono state conservate a -20 gradi fino all'uso.

3. Costruzione del modello di topi CKD.

La nefrectomia al quinto sesto è stata la procedura cronica più consolidata che imita l'insufficienza renale progressiva dopo la perdita di massa renale. .e topi CKD sono stati stabiliti dopo una nefrectomia in due fasi, cinque sesti come descritto in precedenza [34, 35]. In breve, il rene sinistro è stato esposto e tagliato in corrispondenza del terzo polo superiore e inferiore. .e 2/3 dei rami extrarenali dell'arteria renale del rene sinistro sono stati legati e quindi seguiti da una nefrectomia completamente destra dopo una settimana. Gli animali sono stati restituiti alle loro gabbie dopo l'intervento chirurgico per almeno due settimane prima che l'uremia fosse indotta. Le procedure sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università I-Shou (n. di approvazione: IACUC-ISU- 101025).

4. Procedura sperimentale.

Le polveri liofilizzate di micelio di C. militaris sono state immerse in acqua distillata (10 mg/mL) a temperatura ambiente. Due settimane dopo la seconda nefrectomia, i topi sono stati divisi casualmente in gruppi di trattamento (da n=4 a 6 per gruppo) e trattati con uno dei quattro tipi di soluzioni di C. militaris mycelia, incubate in HKS, HKS più A , CM o terreno CM più A, mediante sonda gastrica per 30 giorni consecutivi. Al gruppo sham e ai topi Nx è stato somministrato il volume equivalente di acqua distillata senza micelio di C. militaris. Il peso corporeo è stato misurato e i campioni di sangue sono stati raccolti rispettivamente nei giorni 1, 10 e 30. Al termine del periodo di trattamento, i topi sono stati sacrificati utilizzando CO2. I reni sono stati sezionati e lavati con soluzione salina tamponata con fosfato e posti in formalina tamponata neutra al 10% per la successiva elaborazione istologica. I campioni di sangue sono stati prelevati dal seno venoso periorbitale. L'azoto ureico nel sangue (BUN), la creatinina sierica, le proteine ​​totali e l'acido urico sono stati misurati utilizzando kit disponibili in commercio utilizzando un analizzatore biochimico automatizzato (SPOTCHEM EZ SP-4430) secondo le istruzioni del produttore (Arkary, Inc., Kyoto, Giappone).

Cistanche standardizzate

5. Alimentazione degli animali.

I topi maschi dell'Institute of Cancer Research (circa 30 g) sono stati forniti da BioLASCO Taiwan Co., Ltd. e tenuti in gabbie standard a una temperatura costante di 22 ± 1 grado con un ciclo luce-buio di 12- ore. Gli animali sono stati nutriti con cibo per topi regolare e acqua di rubinetto ad libitum. Gli animali utilizzati in questo studio sono stati ospitati e curati dalla Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

6. Analisi biochimica dei campioni di sangue.

I campioni di sangue sono stati prelevati dal seno venoso periorbitale. I campioni di plasma sono stati centrifugati a 12, 000 rpm per 10 minuti a 4 gradi e conservati a -20 gradi prima dell'analisi. L'azoto ureico nel sangue (BUN), la creatinina sierica, le proteine ​​totali e l'acido urico sono stati misurati utilizzando kit disponibili in commercio utilizzando un analizzatore biochimico automatizzato (SPOTCHEM EZ SP-4430) secondo le istruzioni del produttore (Arkary, Inc., Kyoto, Giappone).

7. Analisi istologica renale.

I reni dei topi sono stati incorporati in blocchi di paraffina, sezionati in sezioni spesse 3-μm ed elaborati con la colorazione di ematossilina-eosina (HE) di Harry seguendo la procedura standard. I glomeruli e i tubuli renali sono stati esaminati e fotografati per analisi future. Le immagini sono state catturate utilizzando una videocamera a colori (VKC150, Hitachi, Tokyo, Giappone) collegata a un microscopio (DP72, Olympus, Center Valley, PA, USA) e analizzate alla cieca da un patologo esperto. .e significa che l'area della sezione trasversale glomerulare è stata ottenuta calcolando l'area media di circa 8-15 singoli glomeruli utilizzando il programma Immagine J.

8. Analisi statistica.

Tutti i dati sono presentati come media ± errore standard della media (n=4 a 6 per gruppo). I dati sono stati analizzati utilizzando un'analisi della varianza a due vie seguita da test post hoc di Bonferroni (SigmaPlot versione 10.0, San Jose, CA, USA). p <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

Estratto di cistanche

Riferimenti

[1] K. Kalantar-Zadeh e D. Fouque, "Gestione nutrizionale della malattia renale cronica", New England Journal of Medicine, vol. 377, n. 18, pp. 1765–1776, 2017.

[2] TK Chen, DH Knicely e ME Grams, "Diagnosi e gestione della malattia renale cronica", JAMA, vol. 322, n. 13, pp. 1294–1304, 2019.

[3] P. Cockwell e L.‑A. Fisher, ".e carico globale della malattia renale cronica",: e Lancet, vol. 395, n. 10225, pp. 662–664, 2020.

[4] P. Rossignol, ZA Massy, ​​M. Azizi, et al., ".e doppia sfida di ipertensione resistente e malattia renale cronica",: e Lancet, vol. 386, n. 10003, pp. 1588–1598, 2015.

[5] AS Levey e J. Coresh, "Malattia renale cronica": e Lancet, vol. 379, n. 9811, pp. 165–180, 2012.

[6] RJ Johnson, C. Wesseling e LS Newman, "Malattia renale cronica di causa sconosciuta nelle comunità agricole", New England Journal of Medicine, vol. 380, n. 19, pp. 1843–1852, 2019.

[7] T. Yang, EM Richards, CJ Pepine e MK Raizada, ".e microbiota intestinale e asse cervello-intestino-rene nell'ipertensione e nella malattia renale cronica", Nature Reviews Nephrology, vol. 14, n. 7, pp. 442–456, 2018.

[8] S. Joshi, M. McMacken e K. Kalantar-Zadeh, "Diete a base vegetale per le malattie renali: una guida per i medici", American Journal of Kidney Diseases, vol. 77, n. 2, pp. 287–296, 2021.

[9] A. Pisciottani, L. Biancolillo, M. Ferrara et al., "HIPK2 fosforila l'enzima spastina che taglia i microtubuli a S268 per l'abscissione", Cells, vol. 8, n. 7, pag. 684, 2019.

[10] MM Nugent, K. Lee e JC He, "HIPK2 è un nuovo bersaglio farmacologico per la terapia antifibrotica nelle malattie renali", Frontiers in Physiology, vol. 6, pag. 132, 2015.

[11] PE Drawz e ME Rosenberg, "Rallentare la progressione della malattia renale cronica," Kidney International Supplements, vol. 3, n. 4, pp. 372–376, 2013.

[12] MR Weir, GL Bakris, DA Bushinsky, et al., "Patiromer in pazienti con malattia renale e iperkaliemia che ricevono inibitori di raas", New England Journal of Medicine, vol. 372, n. 3, pp. 211–221, 2015.

[13] M. Azizi e J. M´enard, "Inibitori della renina e protezione cardiovascolare e renale: una ricerca senza fine?" Cardiovascolari Farmaci e: terapia, vol. 27, n. 2, pp. 145–153, 2013.

[14] K. Al-Jewari, R. Baban e J. Manuti, "Livelli sierici e solubili urinari -Klotho in pazienti con malattia renale cronica", Baghdad Journal of Biochemistry and Applied Biological Sciences, vol. 2, n. 01, pp. 29–38, 2021.

[15] S. Prakash, GT Hernandez, I. Dujaili e V. Bhalla, "Avvelenamento da piombo da una medicina a base di erbe ayurvediche in un paziente con malattia renale cronica", Nature Reviews Nephrology, vol. 5, n. 5, pp. 297–300, 2009.

[16] AA Razmaria, "Malattia renale cronica", JAMA, vol. 315, n. 20, pag. 2248, 2016.

[17] M.-Y. Lin, Y.-W. Chiu, J.‑S. Chang et al., "Associazione dell'uso prescritto di fitoterapia cinese con rischio di malattia renale allo stadio terminale in pazienti con malattia renale cronica", Kidney International, vol. 88, n. 6, pp. 1365–1373, 2015.

[18] A. Zuk e JV Bonventre, "Danno renale acuto", Annual Review of Medicine, vol. 67, n. 1, pp. 293–307, 2016.

[19] Y. Zhong, MC Menon, Y. Deng, Y. Chen e JC He, "Recenti progressi nella medicina tradizionale cinese per le malattie renali", American Journal of Kidney Diseases, vol. 66, n. 3, pp. 513–522, 2015.

[20] SW Lim, KC Doh, L. Jin, et al., "Il trattamento con ginseng attenua la morte cellulare autofagica nella nefropatia cronica da ciclosporina", Nephrology, vol. 19, n. 8, pp. 490–499, 2014.

[21] Y. Yao, J. Yang, D. Wang, et al., ".e estratto acquoso di Lycopus lucidus Turcz migliora il danno renale diabetico indotto da streptozotocina attraverso l'inibizione della via di segnalazione del TGF- 1", Phytomedicine, vol. . 20, n. 13, pp. 1160–1167, 2013.

[22] L. Wu, W. Sun, B. Wang, et al., "Un sistema integrato per identificare gli assassini nascosti nelle medicine tradizionali contenenti acidi aristolochici", Scientific Reports, vol. 5, n. 1, articolo ID 11318, 2015.

[23] GM Shashidhar, P. Giridhar e B. Manohar, "Polisaccaridi funzionali del fungo medicinale Cordyceps sinensis come potente integratore alimentare: estrazione, caratterizzazione e potenzialità terapeutiche: una revisione sistematica", RSC Advances, vol. 5, n. 21, pp. 16050–16066, 2015.

[24] T. Hong, M. Zhang e J. Fan, "Cordyceps sinensis (una medicina tradizionale cinese) per i destinatari di trapianto di rene", Cochrane Database of Systematic Reviews, vol. 10, articolo ID CD009698, 2015.

[25] HW Zhang, ZX Lin, YS Tung, et al., "Cordyceps sinensis (una medicina tradizionale cinese) per il trattamento della malattia renale cronica", Cochrane Database of Systematic Reviews, vol. 18, articolo ID CD008353, 2014.

[26] G. Shao, S. Zhu e B. Yang, "Applicazioni della fitoterapia per il trattamento della malattia renale policistica autosomica dominante", Frontiers in Pharmacology. vol. 12, articolo ID 629848, 2021.

[27] C.-T. Lee, K.‑S. Huang, J.‑F. Shaw, et al., "Tendenze negli effetti immunomodulatori del Cordyceps militaris: estratti totali, polisaccaridi e cordicepina", Frontiers in Pharmacology. vol. 11, articolo ID 575704, 2020.

[28] B.-L. Lui, Q.-W. Zheng, L.-Q. Guo et al., "Caratterizzazione strutturale e attività di potenziamento immunitario di un nuovo polisaccaride ad alto peso molecolare da Cordyceps militaris", International Journal of Biological Macromolecules, vol. 145, pp. 11–20, 2020.

[29] X.-C. Liu, Z-Y. Zhu, Y.‑L. Tang et al., "Proprietà strutturali dei polisaccaridi da corpi fruttiferi coltivati ​​e micelio di Cordyceps militaris", Carbohydrate Polymers. vol. 142, pp. 63–72, 2016.

[30] H.-J. Park, "L'estratto di etanolo di Cordyceps military coltivato su semi di soia germinati inibisce la dermatite allergica da contatto indotta da 2, 4-dinitrofenolo-fluorobenzene", Journal of Functional Foods, vol. 17, pp. 938–947, 2015.

[31] C.‑H. Yang, Y.‑H. Kao, K.-S. Huang, C.Y. Wang, e L.‑W. Lin, "Cordyceps militaris e fermentazione miceliale hanno indotto l'apoptosi e l'autofagia delle cellule di glioblastoma umano", Cell Death & Disease. vol. 3, n. 11, pag. e431, 2012.

[32] SK Das, M. Masuda, A. Sakurai e M. Sakakibara, "Usi medicinali dei militari del fungo Cordyceps: stato attuale e prospettive", Fitoterapia, vol. 81, n. 8, pp. 961–968, 2010.

[33] LS Wang, CY Wang, CH Yang, et al., "Sintesi ed effetto antimicotico delle particelle composite di nanoparticelle-chitosano d'argento", International Journal of Nanomedicine, vol. 10, pp. 2685–2696, 2015.

[34] R. Poesen, K. Windey, E. Neven, et al., ".e influence of CKD on colonic microbial metabolic", Journal of the American Society of Nephrology, vol. 27, n. 5, pp. 1389–1399, 2016.

[35] S.‑C. Wang, C.‑H. Yang, AM Grumezescu, et al., "Effetti renoprotettivi del fungo medicinale della canfora gridata (Taiwanofungus camphorates, Basidiomycetes) Micelia su diversi terreni nei topi con malattia renale cronica", International Journal of Medicinal Mushrooms, vol. 18, n. 12, pp. 1105–1114, 2016.

Chih-Hui Yang, 1,2,3Wen-Shuo Kuo, 4 Jun-ShengWang, 2Yi-Ping Hsiang, 3,5Yu-Mei Lin, 1,6 Yi-Ting Wang, 1,6 Fan-Hsuan Tsai, 6 Chun- Ting Lee,6,7 Jiun-Hua Chou,1 Huei-Ya Chang,1 Lung-Shuo Wang, 6,8 Shu-Chi Wang, 6,9 e Keng-Shiang Huang 6

1 Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biologiche, I-Shou University, Kaohsiung, Taiwan

2 Istituto di ricerca strumentale di Taiwan, laboratori nazionali di ricerca applicata, Hsinchu, Taiwan

3 Dipartimento di farmacia dell'ospedale E-Da, Kaohsiung, Taiwan

4 Scuola di Chimica e Scienza dei Materiali, Università di Scienze e Tecnologie dell'Informazione di Nanjing, Nanjing, Cina

5 Dipartimento di biotecnologia e ingegneria chimica, I-Shou University, Kaohsiung, Taiwan

6 Scuola di Medicina Cinese per Post-Baccalaureato, I-Shou University, Kaohsiung, Taiwan

7 Clinica di medicina cinese Amulette, Taipei, Taiwan

8 Dipartimento di Medicina Cinese, Ospedale Sin-Lau, Tainan, Taiwan

9 Scuola di Medicina per Studenti Internazionali, I-Shou University, Kaohsiung, Taiwan