PARTE II.: Precondizionamento e postcondizionamento della metformina per ridurre il danno da riperfusione da Lschemia in un modello di perfusione normotermica di ratto ex vivo e rene suino lsolato
Mar 26, 2022
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Tobias M.Huink, Leonie H.Venemal, Rene A.Posma, Nynke J.de Vries, Andrie C.Westerkampl, & et al.
INTRODUZIONE
Il trapianto di rene è il trattamento di scelta per i pazienti con malattia renale allo stadio terminale. Sfortunatamente, la domanda è superiore alla disponibilità di organi.2 Questa carenza ha comportato un aumento dell'uso di organi di qualità non ottimale da donatori di donazione dopo morte circolatoria (DCD).5 I reni da donatori di DCD sono più suscettibili al danno da ischemia-riperfusione (IRl), che è legato a un'incidenza significativamente più elevata di ritardo della funzione dell'innesto, che influisce sia sull'esito a breve che a lungo termine.45 L'IRI è causata dalla compromissione del flusso sanguigno e dalla successiva riossigenazione, che si traduce nella generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), avviando una cascata di risposte cellulari dannose.67 La gravità dell'ischemia è fortemente correlata all'insufficienza renale precoce dell'innesto dopo trapianto di rene e contribuisce ad aumentare la morbilità. Pertanto, l'ischemia calda (W) durante il prelievo e l'impianto degli organi e il tempo ischemico freddo durante la conservazione, rispettivamente, dovrebbero essere ridotti al minimo. Le strategie di perfusione della macchina possono svolgere un ruolo fondamentale nella riduzione dell'IRI fornendo ossigeno durante le fasi ischemiche nella donazione di organi. Inoltre, fornisce una piattaforma per aggiungere possibili agenti protettivi prima della riperfusione (precondizionamento) o durante la riperfusione (post-condizionamento) ed è un metodo adatto per valutare la funzionalità renale a breve termine e le lesioni.9-11
Le biguanidemetforminaè il farmaco antiiperglicemico orale più utilizzato per il trattamento di pazienti con diabete di tipo 2. Il meccanismo d'azione e gli effetti pleiotropici dimetforminaderivano principalmente dall'inibizione del complesso 1 all'interno della catena respiratoria mitocondriale.12-14 Pertanto,metforminapuò attenuare l'IRI al di là delle sue azioni ipoglicemizzanti ed è stato proposto come agente protettivo degli organi durante le circostanze in cui si verifica l'IRI, come il trapianto.15,16
Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare i potenziali effetti benefici del precondizionamento e del postcondizionamento conmetforminasu IRI in due diversi modelli isolati di perfusione macchina normotermica ex vivo (NMP) utilizzando reni di ratto e suini.
NUTRIRE IL RENE:ERBA DRAGO CISTANCHE
METODI
Studio sui ratti
Animali.Sono stati utilizzati ratti Lewis maschi del peso di 270-300 g (Harlan Laboratories, Boxmeer, Paesi Bassi). Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Groningen ha approvato il protocollo di studio (DEC6708C). Gli animali hanno ricevuto cure secondo la legge olandese sugli esperimenti sugli animali, seguendo i principi di cura degli animali da laboratorio dell'Istituto nazionale di salute.
Progettazione sperimentale, recupero di organi e conservazione.Un totale di 31 ratti sono stati divisi in 6 gruppi (n = 5-6 per gruppo; Figura 1). In tutti i gruppi, 15 minuti di W e 24 ore di conservazione a freddo sono stati utilizzati per indurre lesioni ischemiche. Il precondizionamento è stato eseguito somministrando 300 mg/kgmetformina(1,1-dimetilbiguanide cloridrato; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) disciolto in soluzione salina (0,9% NaCl) o soluzione salina da sola attraverso gavage orale 12 e 2 ore prima della nefrectomia. Soluzione salina, 30 mg/Lmetforminao 300 mg/Lmetforminaè stato aggiunto al perfusate come agente post-condizionamento. È stata scelta la concentrazione di 300 mg/kg di peso corporeo, poiché questa dose ha determinato il sierometforminaconcentrazioni che corrispondono a quelle riscontrate nell'uomo durante il mantenimentometforminaterapia.17
L'approvvigionamento di reni è stato eseguito con piccole modifiche alla procedura DCD, come descritto in precedenza.18 In breve, i ratti sono stati anestetizzati con il 2-5% di isoflurano e la laparotomia è stata eseguita tramite un'incisione della linea mediana. L'anticoagulazione, utilizzando eparina da 500 UI (Leo Pharma, Ballerup, Danimarca), è stata somministrata attraverso la vena dorsale del pene. Dopo 15 minuti di WI, è stata eseguita la nefrectomia del rene sinistro. L'arteria renale e l'uretere erano cannulati. Il rene è stato lavato in situ con 10 mL di soluzione salina (37 °C) e 5 ml di 4 °C dell'Università del Wisconsin (UW) Cold Storage Solution (Bridge to Life, Columbia, SC). Una volta rimossi, i reni sono stati nuovamente lavati con 5 ml di UW e conservati in UW per 24 ore a 4 ° C.
Perfusione macchina normotermica.Il metodo NMP per ratti è stato ampiamente descritto in precedenza.18 In breve, NMP è stato eseguito per 90 minuti utilizzando una pompa a rulli (Ismatec ISM404, Zurigo, Svizzera). La pressione di perfusione è stata impostata a 102 mmHg, controllata all'arteria renale. Nel gruppo di controllo, il fluido di perfusione consisteva in 100 mL William's Medium E integrati con 30 mmol / L HEPES, 50 g / L albumina e 7 mmol / L creatinina (tutti Sigma-Aldrich). Nei gruppi sperimentali, 30 o 300 mg/Lmetforminaè stato aggiunto al perfusato. Il fluido di perfusione è stato ossigenato con il 95% di ossigeno e il 5% di anidride carbonica con un flusso di 0,5 L / min. La temperatura del fluido di perfusione è stata mantenuta a 37°C utilizzando un bagno d'acqua e uno scambiatore di calore (Julabo, Seelbach, Germania). Il flusso è stato registrato ogni 10 minuti, utilizzando un sensore di flusso calibrato (ME1PXN Inline, Transonic Systems, Ithaca, NY). Dopo NMP, le biopsie dei reni sono state immediatamente immerse in formaldeide al 4% o congelate in azoto liquido e successivamente conservate a -80 ° C.
Figura 1Rappresentazione schematica dei gruppi sperimentali. I gruppi contengono 5-7 reni. HMP, perfusione di macchine ipotermiche; NMP, perfusione normotermica della macchina; WIT, tempo caldo di ischemia.
Studio suino
Animali.I reni delle femmine di maiale olandese Landrace sono stati raccolti da un mattatoio. Gli animali sono stati storditi ed dissanguati secondo le procedure standard locali. Durante il dissanguamento, circa 1 L di sangue è stato raccolto in un contenitore contenente 25.000 UI di eparina non frazionata (Leo Pharma). Poiché è stato utilizzato materiale di scarto del macello, non è stata richiesta l'approvazione del comitato etico degli animali.
Progettazione sperimentale, recupero di organi e conservazione.Per indurre lesioni ischemiche, sono stati utilizzati 30 minuti di WI. Dopo questo periodo, il rene è stato lavato con 180 ml di soluzione salina a 4 ° C. Subito dopo il lavaggio, è stata eseguita una biopsia corticale (Invivo, Best, Paesi Bassi) e conservata in formaldeide tamponata al 4%. Per accogliere il trasporto dal macello al laboratorio e come tecnica di conservazione, l'arteria renale è stata cannulata e i reni sono stati attaccati a una configurazione di perfusione della macchina ipotermica controllata dalla pressione pulsatile (HMP) (Kidney Assist Transport; Organ Assist, Groningen, Paesi Bassi). I reni sono stati perfusi a 4°C utilizzando 500 mL UW Machine Perfusion Solution per 3 ore (Bridge to Life, Londra, Regno Unito) con o senza l'aggiunta di 2 mgmetformina, con una pressione arteriosa media di 25 mmHg. L'ossigeno (100%) è stato fornito all'ossigenatore (Hilite LT1000; Medos Medizintechnik AG, Stolberg, Germania)con una portata fissa di 0,1 L/min.
Perfusione macchina normotermica.I reni sono stati riperfusi utilizzando una configurazione NMP ex vivo per 4 ore descritta in precedenza. Nel nostro studio, aumentando le dosi dimetforminao soluzione salina sono stati aggiunti utilizzando una pompa per infusione. In breve, dopo HMP, l'arteria renale è stata scansionata e lavata. L'uretere è stato cannulato per la raccolta delle urine. Successivamente, il rene è stato pesato e una biopsia è stata presa e conservata in formaldeide tamponata al 4% per ulteriori analisi. Successivamente, i reni sono stati collocati in un circuito NMP controllato dalla pressione ex vivo. NMP è stato eseguito con 500 ml di leucociti impoveriti, (BioR 02 plus; Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germania) sangue autologo, ossigenato (carbogeno, flusso 0,5L/min) per 4 ore ad una pressione arteriosa media di 80 mmHg. Altri composti aggiunti al fluido di perfusione sono forniti nella Tabella S1. Nel gruppo sperimentale,metforminadisciolto nella soluzione di lattato di Ringer (20 mg/ml; Baxter, Utrecht, Paesi Bassi) è stato infuso utilizzando una pompa per infusione controllata da un software personalizzato in cui è stato possibile definire i profili di infusione (Alaris; CareFusion, Rolle, Svizzera). Ogni 30 minuti durante NMP, la velocità di infusione è stata aumentata secondo uno schema prespecificato (Tabella S2). Questo schema si basava su dati di farmacocinetica umana che indicavano chemetforminala clearance è quattro volte superiore alla clearance della creatinina.19 Nel gruppo di controllo, i reni sono stati perfusi senza l'aggiunta dimetformina. Per ogni esperimento, il flusso è stato registrato utilizzando la sonda di flusso a clampon (ME7PXL; Transonic Systems), che era attaccato al tubo vicino all'arteria renale. Questa sonda di flusso è stata calibrata per il tubo utilizzato. Ogni 15 minuti durante NMP, l'urina è stata raccolta e sostituita con un volume corrispondente di soluzione di lattato di Ringer, che è stato anche registrato. La temperatura del fluido di perfusione è stata mantenuta a 37°C utilizzando uno scambiatore di calore integrato, collegato ad un bagno d'acqua (Julabo). Campioni di sangue e urina sono stati prelevati dopo 15 e 60 minuti e ogni ora successiva per analisi biochimiche. Quando NMP è stato terminato, le biopsie sono state prese e conservate in formaldeide tamponata al 4%, o congelate a scatto e conservate a-80 ° C per ulteriori analisi.
MIGLIORARE LA FUNZIONE RENALE CISTANCHE SUPPLEMENTO
Entrambi gli studi
Analisi biochimiche.I campioni di perfusato e di urina sono stati centrifugati (1.300 g per 10 minuti nel modello di ratto e 1.000 g per 12 minuti nel modello suino, rispettivamente, entrambi a 4 ° C) e il surnatante è stato conservato a -80 ° C. La lattato deidrogenasi (LDH), l'aspartato aminotransferasi (ASAT) e la creatinina sono stati determinati rispettivamente in perfusato e creatinina nelle urine dal Centro di laboratorio del Centro medico universitario di Groningen utilizzando analisi biochimiche standard. La quantità di proteine escrete nelle urine di ratto è stata misurata utilizzando un Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), mentre la concentrazione totale di proteine nelle urine suino è stata misurata utilizzando analisi biochimiche standard presso il Laboratory Center.
Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale.La reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) è stata effettuata secondo le procedure standard sul sistema Tagman Applied Biosystems 7900HT RealTime PCR, come descritto in precedenza.20Amplificazione di frammenti genici coinvolti nella regolazione del tono vascolare (endotelina 1 (EDN-1, codifica per ET-1); ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS); e fattore 2 simile a Krüppel (KLF-2), attivazione endoteliale (fattore di Von Willebrand (wWF);molecola di adesione delle cellule vascolari 1 (VCAM-1) e IL-6), e la proteina da shock termico 70 (HSP-70) è stata eseguita con set di primer elencati nella Tabella S3.In breve, l'RNA totale è stato estratto dalle sezioni renali usando TRlzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Il cDNA ottenuto dai ratti è stato utilizzato come riferimento interno durante la PCR per testare l'efficienza del primer. L'espressione genica è stata normalizzata con la media del contenuto di mRNA β-actina. I risultati sono stati espressi come 2-△ACT, dove il valore CT rappresenta la differenza tra i valori di soglia del ciclo.
Figura 2Parametri di perfusione e funzionalità renale valutati durante e dopo perfusione normotermica di reni di ratto e suini. Clearance totale della creatinina dei reni di ratto (a) e suino (b). Produzione totale di urina (c, d) e proteine totali escrete nelle urine (e, f) dei reni di ratto e suini, rispettivamente. I dati sono presentati come ± errore standard della media. I gruppi contengono 5-7 reni. *P< 0.05="" and="" **p=""><>
Punteggio morfologico.Le biopsie conservate nel 4% di formaldeide sono state incorporate nella paraffina e sono state tagliate in fette da 4 μm. I coupé sono stati successivamente colorati con acido periodico Schiff e valutati sulla necrosi delle cellule tubulari prossimali (che vanno da lieve a grave: 1-5), edema (che va da lieve a grave: 1-4) e vacuolazione delle cellule tubulari prossimali (che vanno da lieve a grave: 1-4).21 La valutazione istopatologica è stata effettuata in cieco da due ricercatori. Un patologo clinico indipendente con una vasta esperienza nella valutazione dei segni istopatologici di lesioni dopo la perfusione della macchina di organi di ratto e suino ha convalidato i punteggi.
Calcoli.La resistenza vascolare intrarenale (IVR) è stata calcolata dividendo la pressione arteriosa media per flusso (espressa in mmHg/mL min). La clearance della creatinina è stata calcolata per stimare la velocità di filtrazione glomerulare utilizzando la seguente equazione:[creatinina nelle urine]* flusso di urina/[creatinina in perfusato].
Analisi statistica.Tutti i dati sono espressi come media± errore standard della media. Quando si confrontano due gruppi in un singolo punto temporale, le differenze sono state valutate utilizzando un t-test di studente spaiato. Le differenze per la produzione totale di urina, i punteggi morfologici e l'espressione genica sono stati testati utilizzando l'analisi della varianza. Tutti i test statistici sono a due code e P≤ 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. SPSS Statistics versione 23 (IBM, Armonk, NY) è stato utilizzato per tutte le analisi. L'area sotto la curva (AUC) è stata calcolata secondo la regola trapezoidale ed è stata utilizzata per approssimare la clearance totale della creatinina, la quantità totale di proteine escrete nelle urine e i livelli totali di ASAT e LDH nel perfusato.
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