Parte Ⅰ: Possibile rilevanza del recettore dell'ormone luteinizzante solubile durante lo sviluppo e l'età adulta nei ragazzi e negli uomini
Apr 06, 2023
Riepilogo semplice
Gli ormoni riproduttivi ormone luteinizzante (LH) e gonadotropina corionica umana (hCG), entrambi agonisti del recettore dell'ormone luteinizzante (LHCGR), sono essenziali per la riproduzione maschile durante lo sviluppo e l'età adulta. lHCGR è espresso e stimola la produzione di testosterone da parte delle cellule di Leydig testicolari. In questo studio, dimostriamo che l'LHCGR solubile è presente nel sangue, nelle urine e nello sperma di ragazzi e uomini sani, nonché in pazienti con aberrazioni cromosomiche sessuali. Mostriamo come i livelli circolanti di sLHCGR sono correlati allo sviluppo puberale, alla funzione testicolare e alla qualità dello sperma e dimostriamo che LHCGR viene rilasciato dal tessuto non gonadico umano fetale. L'HCG viene rilasciato nel siero attraverso i testicoli e altri organi, suggerendo un possibile ruolo extragonadico dell'LH o dell'hCG nei ragazzi e negli uomini.
Astratto
L'ormone luteinizzante (LH) e la gonadotropina corionica umana (hCG) sono agonisti del recettore dell'ormone luteinizzante (LHCGR), che regola la funzione riproduttiva maschile. lHCGR può essere rilasciato nei fluidi corporei. Volevamo determinare se l'LHCGR solubile è un marker della funzione gonadica. Sono stati condotti studi trasversali, longitudinali e interventistici su 195 ragazzi e uomini sani e 396 uomini con infertilità, carenza o sindrome di Klinefelter (KS) per collegare l'LHCGR misurato nel siero, nello sperma, nelle urine e nelle arterie epatiche/renali alla funzione gonadica . LHCGR è stato misurato in modelli in vitro e in vivo di tessuto testicolare umano e linee cellulari, modelli di topo xenotrapianto e risultati di Western blot umano hanno mostrato che i frammenti di LHCGR sono stati rilevati in tessuti sierici e gonadici di dimensioni simili utilizzando tre diversi anticorpi. Anche dopo xenotrapianti umani, LHCGR-ELISA non ha mostrato reattività crociata interspecie o reazioni non specifiche nel siero di topo. Al contrario, sLHCGR è stato rilasciato nel terreno di coltura dopo la coltura del rene fetale umano e della ghiandola surrenale. Il sLHCGR sierico era significativamente più basso nei ragazzi sani alla pubertà (p=0.0001). Nei maschi sani, la sLHCGR sierica era negativamente correlata con il rapporto inibina B/FSH (-0.004,p=0.027). Negli uomini infertili, la sLHCGR seminale era negativamente correlata con l'FSH sierico (0,006, p=0,009), la concentrazione di spermatozoi (-3,5, p=0,003) e il numero totale di spermatozoi ( -3.2, p=0.007). L'iniezione di hCG ha ridotto sLHCGR nel siero e nelle urine di uomini sani (p <0,01). In conclusione, sLHCGR viene rilasciato nei fluidi corporei ed è associato allo sviluppo puberale e alla funzione gonadica. La sLHCGR circolante nei maschi di orchidea suggerisce che la sLHCGR nel siero può avere origine in tessuti non gonadici e può funzionare in tessuti non gonadici. (Sperimentazioni cliniche: NTC01411527, NCT01304927, NCT03418896).
Parole chiave
recettore LH; pubertà; sviluppo; infertilità;Benefici Cistanche; effetti extragonadici; gonadotropine; rene fetale; ghiandola surrenale fetale; TCAM2; NTera2
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introduzione
L'ormone luteinizzante (LH) e la gonadotropina corionica umana (hCG) sono entrambi agonisti del recettore dell'ormone luteinizzante (LHCGR), che è essenziale per la riproduzione maschile durante lo sviluppo e l'età adulta [1]. L'HCG è un recettore accoppiato a proteine G noto per essere espresso in Leydig, luteina granulare e cellule di membrana ed è un potente regolatore della produzione di steroidi sessuali [1]. L'hCG è un agonista potente e persistente, ma è importante solo dal punto di vista fisiologico durante lo sviluppo fetale [2]. Fatta eccezione per alcuni tumori delle cellule germinali e tumori pancreatici, l'hCG non viene prodotto in età adulta, sebbene uno studio precedente abbia rilevato una bassa secrezione pulsatile di hCG ipofisario nei maschi e nelle femmine adulti. L'hCG è usato per trattare le donne per indurre l'ovulazione durante il trattamento della fertilità, per gli uomini per stimolare la sintesi di testosterone e la potenziale spermatogenesi negli uomini ipogonadici o come test diagnostico per la produzione endogena di testosterone [4]. L'ablazione del recettore LH del topo (LHCGR) porta a una drastica diminuzione del testosterone e della qualità dello sperma [5], e diversi gruppi di ricerca hanno identificato mutazioni e SNP in LHCGR, dimostrando la sua importanza per la funzione riproduttiva umana [6-8].
Il gene LHCGR si trova sul cromosoma 2 ed è costituito da 11 esoni, di cui gli esoni 1-10 codificano domini strutturali extracellulari e l'esone 11 codifica 7 domini strutturali transmembrana e intracellulare [9]. Esistono diverse isoforme di LHCGR, una delle quali si pensa sia secreta perché priva di ancoraggio transmembrana [10]. Un'altra possibilità è che il rilascio di LHCGR nei fluidi corporei dipenda dalla scissione enzimatica delle proteine sulla membrana cellulare, come ADAM, MMP e altre proteine transmembrana note scisse. In effetti, è stato dimostrato che l'hCG sovraregola specificamente MMP-2 e MMP-9 [11,12] e diversi studi hanno mostrato una regolazione post-trascrizionale di LHCGR [13,14]. L'LHCGR solubile (LHC) è stato misurato nel siero femminile e nel fluido follicolare mediante la piattaforma ELISA [15,16]. La specificità degli anticorpi utilizzati nel test ELISA è stata convalidata esprimendo diversi frammenti LHCGR nelle cellule CHO per la localizzazione dell'epitopo e rilevando l'espressione nella placenta umana [15-17]. sLHCGR è stato rilevato nel siero mediante LC-MS/MS [18]. le concentrazioni sieriche di sLHCGR nelle donne erano associate al trattamento della fertilità, alla preeclampsia, alla nascita pretermine e alla gravidanza nei bambini portatori di tassi di impianto della sindrome di Down [15,16], ma fino ad oggi non sono state convalidate da altri gruppi di ricerca. A nostra conoscenza, sLHCGR non è mai stato descritto nei fluidi corporei di maschi sani, ragazzi adolescenti in via di sviluppo o maschi con aberrazioni cromosomiche sessuali. sLHCGR può funzionare nella circolazione maschile come marker della funzione gonadica attraverso il trasporto di legami ad alta affinità o l'alterazione dell'attività di LH o hCG.
Materiali e metodi
1. Coorti
Giovani della popolazione generale
In Danimarca, tutti i giovani sani di età superiore ai 18 anni devono sottoporsi a un esame fisico per determinare la loro idoneità al servizio militare. Dal 1996, circa 300 coscritti, che rappresentano la popolazione generale, sono stati esaminati ogni anno per la qualità del seme. Tutti hanno fornito campioni di sperma, hanno compilato un questionario, hanno eseguito esami ecografici dei loro testicoli e hanno prelevato campioni di sangue. I campioni di siero e seme della biobanca, nonché le valutazioni ecografiche e le informazioni sull'IMC e sull'età di 148 uomini intervistati nel 2013 e 2014, sono stati inclusi nel presente studio (approvazione del comitato etico: H-KF-289428).
Ragazzi sani prima e dopo la pubertà
Il Copenhagen Adolescence Study è uno studio combinato trasversale e longitudinale di bambini danesi sani [20]. Da scuole pubbliche selezionate a caso, 6203 bambini sono stati invitati a partecipare. Il numero totale di partecipanti è stato di 2020 bambini. Il follow-up longitudinale di 209 bambini (101 maschi) è stato condotto ogni 6 mesi e comprendeva esame fisico, valutazione Tanner degli stadi puberali e campioni di sangue e urine. Trentasei ragazzi con follow-up longitudinale sono stati inclusi in questo studio per valutare sLHCGR durante la pubertà (studio clinico: NTC01411527).
Uomini infertili senza gravi comorbidità
Il Copenhagen-Bone-Gonad Study è uno studio di coorte su 307 uomini infertili senza gravi comorbilità che hanno frequentato la nostra clinica maschile dal 2011 al 2015, per un totale di 1427 uomini [21,22]. Tutti gli uomini sono stati indirizzati alla nostra clinica a causa della scarsa qualità del seme e del desiderio di essere genitori. Tutti sono stati sottoposti a un esame fisico, inclusa l'ecografia testicolare, hanno prelevato campioni di sangue e fornito campioni di sperma. Uno specialista ha ottenuto le loro storie mediche dettagliate. Gli uomini sono stati seguiti per 150 giorni dai ricercatori e hanno assunto vitamina D o un placebo come descritto in precedenza. Tutti i dati forniti in questo studio provenivano dalla visita iniziale pre-intervento e tutte le variabili incluse erano predefinite (studio clinico: NCT01304927).
Cistanche standardizzate
Uomini e ragazzi con sindrome di Klinefelter e pazienti con anorchia
Abbiamo identificato 64 ragazzi e uomini con sindrome di Klinefelter (KS), 47 post-puberali e 16 pre-puberali, definiti secondo la stadiazione di Tanner, dalla nostra clinica maschile. Avevamo a disposizione per tutti le aberrazioni cromosomiche esatte, la storia medica, lo stato di insorgenza della pubertà e le informazioni sul siero. 7 ragazzi sono stati sottoposti a follow-up longitudinale con regolare valutazione clinica e prelievo di sangue prima e durante l'inizio della pubertà.
Abbiamo anche incluso 8 maschi con conta cromosomica normale a cui erano stati rimossi i testicoli bilaterali per condizioni precedenti: carcinoma a cellule germinali testicolari (n=4), carcinoma prostatico diffuso (n=1), criptorchidismo bilaterale e orchiectomia pediatrica ( n=1), neoplasia bilaterale delle cellule germinali in situ (n=1) e carcinoma testicolare avanzato dopo la rimozione dei rimanenti testicoli a causa di un trauma (n=1).
Adulti sottoposti a misurazione del flusso di Splanchnicus
Sono stati inclusi tre uomini e tre donne in postmenopausa con funzionalità epatica normale che sono stati ricoverati per sospetta ischemia mesenterica e inviati per la misurazione del flusso sanguigno viscerale ma non hanno mostrato ischemia mesenterica. I campioni di sangue sono stati raccolti simultaneamente dal fegato, dal rene, dalla vena femorale e dall'arteria corrispondente (approvazione del comitato etico: H.18048245)
Studio di intervento: uomini sani esposti alla gonadotropina corion umana
Undici uomini sani sono stati reclutati per partecipare all'intervento clinico attraverso un annuncio del Rigshospitalet danese. I volontari sono stati trattati con 5000 UI di gonadotropina corionica umana e la loro produzione massima di testosterone endogeno è stata misurata confrontando campioni di sangue e urina al basale con campioni di follow-up raccolti 8, 24 e 72 ore dopo l'iniezione di hCG (studio clinico: NCT03418896).
2. Topi, tessuti umani e linee cellulari
Due ceppi di cellule tumorali testicolari umane NTera-2 e TCam-2, che rappresentano rispettivamente il carcinoma embrionale e il seminoma, sono stati utilizzati e coltivati come precedentemente descritto [23].
I sieri sono stati raccolti da topi nudi senza tumore (WT) e topi nudi xenotrapianti TCam-2 trattati rispettivamente con vettore, LH o hCG (Ispettorato per la sperimentazione animale, Copenaghen, Danimarca, numero di licenza: 2012-15-2934-00051) .
I tessuti fetali umani del primo trimestre sono stati raccolti da tessuti di donne donate dopo aborti programmati. Il rene fetale e il tessuto surrenale fetale sono stati coltivati in modelli di gocce di sospensione come descritto in precedenza e il terreno è stato raccolto per l'analisi [24,25] (approvazione del comitato etico: H-1-2012-007).
I campioni testicolari adulti sono stati ottenuti da uomini ovariectomizzati con cancro ai testicoli (approvazione del comitato etico: H{{0}}). Il tessuto peritumorale contenente aree non maligne è stato conservato a - 80◦ C o fissato durante la notte a 4◦ C in formalina o fissativo di Stieve modificato (200 mL di formaldeide al 37%, 40 mL di acido acetico in 1 L 0,05 M di fosfato tampone, pH 7,4).
3. Analisi biochimiche
Il rilevamento di sLHCGR totale nel siero, nello sperma, nelle urine e in vari terreni di coltura è stato eseguito in un processo di convalida utilizzando kit ELISA del New Dutch Biomarker Catalyst Laboratory (NBCL) utilizzando l'anticorpo LHR029 contro LHCGR umano e misurando tutti di questi ripetutamente. il test ELISA aveva un limite di rilevamento di 0,01 pmol/mL e un livello massimo di 15,55 Sei uomini della popolazione generale con livelli di sLHCGR superiori al limite superiore di rilevamento hanno avuto i loro campioni diluiti e rimisurati, mostrando livelli fino a 30 pmol/mL. le prestazioni della piattaforma ELISA sono state descritte in dettaglio in precedenza [15-17].
Integratori di cistanche
Abbiamo anche allestito due diversi ELISA interni, allestiti dai nostri tecnici di laboratorio, e tutti gli altri reagenti sono stati forniti da Origin Biomarkers Ltd, Regno Unito, in base alla configurazione suggerita [26]. In primo luogo, l'sLHCGR circolante legato all'hCG è stato rilevato utilizzando kit ELISA sandwich con anticorpi 5A10C9 (ProMab) e am0{{20}}904pun ( OriGene) diretti rispettivamente contro LHCGR e hCG. In secondo luogo, abbiamo utilizzato in modo simile ELISA interno per determinare campioni totali di fegato, reni e arteriosi e venosi degli arti inferiori da sei adulti sLHCGR, dove abbiamo utilizzato lo stesso anticorpo LHR029 (NBCL Holland) contro sLHCGR. Sono stati testati due diversi protocolli. Tutte le misurazioni sLHCGR descritte in questo documento sono state eseguite utilizzando NBCL ELISA, ad eccezione del complesso hCG-sLHCGR e dei campioni arteriosi/venosi dagli organi sopra descritti. Nei ragazzi sani, il testosterone è stato analizzato utilizzando il kit RIA rivestito con DPC (Diagnostic Products, Los Angeles, CA) con un limite di rilevamento (LOD) di 0,23 nmol/L e un CV dell'8,6% utilizzando l'immunofluorescenza risolta nel tempo (Delfia; Wallac, Turku, Finlandia), il limite di rilevazione era di 0,20 nmol/l con un CV del 6,4%. Negli adulti, il testosterone e la globulina legante gli ormoni sessuali (SHBG) sono stati analizzati mediante immunodosaggio in chemiluminescenza (Access, Beckman Coulter, USA) con LOD rispettivamente di 0,35 nmol/L e 0,33 nmol/L. I livelli sierici e urinari di FSH e LH sono stati misurati mediante immunofluorescenza risolta nel tempo (Delfia; Wallac, Turku, Finlandia) con limiti di rilevamento di 0,06 e 0,05 IU/L, rispettivamente, e CV e lt; entrambi al 5%. Il test dell'inibina B è stato eseguito utilizzando uno specifico dosaggio immunoenzimatico bilaterale (inhibin B genII, Beckman Coulter, USA) CV <11%. Per l'AMH, abbiamo utilizzato il saggio immunoenzimatico Beckman Coulter (Immunotech, Beckman Coulter, Marsiglia, Francia) e un CV <8%. Infine, IGF1 e IGF-BP3 sono stati determinati utilizzando il test di chemiluminescenza del sistema immunodiagnostico IDS-iSYS con CV rispettivamente del 10% e del 9%. L'estradiolo libero è stato calcolato utilizzando la costante di Mazer e il testosterone libero (FT) è stato calcolato utilizzando la formula di Vermeulen [27,28].
Analisi del seme
Giovani uomini sani e partecipanti adulti infertili hanno fornito campioni di sperma e ottenuto informazioni autodichiarate sulla durata dell'astinenza eiaculatoria. L'analisi del seme è stata eseguita da tecnici qualificati come descritto in precedenza [19]. Il volume del seme è stato stimato mediante pesatura. Per la valutazione della vitalità degli spermatozoi, 10 μL di replicati di seme ben miscelati sono stati posti su vetrini ed esaminati al microscopio × 400x in una sezione riscaldata a 37◦ C. Gli spermatozoi sono stati classificati come avanzato vitale (WHO classe a plus B), non progressivo vitale (classe C) o inattivo (classe D). È stata utilizzata la media delle due valutazioni di fattibilità. Per valutare la concentrazione di spermatozoi, i campioni sono stati diluiti in una soluzione di acqua distillata di 0,6 moL/L di NaHCO3 e 0,4% (v/v) di formaldeide e quindi valutati utilizzando un emocitometro Bürker-Türk ed è stata utilizzata la media delle valutazioni. Sono stati contati solo gli spermatozoi con la coda. Infine, gli strisci sono stati preparati e colorati con Pap color e la morfologia degli spermatozoi è stata valutata rigorosamente secondo i criteri di [29].
Blotting occidentale
Il tessuto testicolare umano è stato omogeneizzato in tampone di lisi, diluito in tampone di caricamento SDS e quindi riscaldato a 95◦ C per 5 minuti. I campioni sono stati caricati su gel di poliacrilammide prefabbricati al 4-20 percento (BioRad, cat# 456-8096) e fatti funzionare a 100 V per 1 ora per separare le proteine. Per rilevare sLHCGR nel siero, l'albumina e le IgG sono state rimosse utilizzando il kit di rimozione albumina/IgG Pierce (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA, cat# 89875) prima di caricare i campioni sul gel. dopo l'elettroforesi su gel, le proteine sono state trasferite su membrane di difluoruro di polivinilidene utilizzando un assorbente umido (BioRad). Le membrane sono state chiuse in soluzione salina tamponata con tris e latte in polvere scremato al 5% per 1 ora, quindi incubate per una notte a 4°C con anticorpi primari e per 1 ora a temperatura ambiente con anticorpi secondari. Le membrane sono state lavate con chemiluminescenza potenziata (Thermo Scientific Super Signal West Femto Maximum Sensitive Substrate, Cat# 34095) e fotorilevatore con un sistema di imaging chemiDoc MP (BioRad, Cat# 17001402). Sono stati utilizzati tre diversi anticorpi per rilevare LHCGR nel tessuto e nel siero: Aviva System Biology (OASG04237); NBCL Holland, lo stesso anticorpo del kit ELISA siero (LHR029) e Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA, SC- 26341). La -2 microglobulina è stata utilizzata come controllo del caricamento.
Immunoistochimica
L'immunoistochimica è stata eseguita come precedentemente descritto [25]. In breve, le sezioni sono state fissate con fissativo Stiff modificato, decerate e reidratate. L'estrazione dell'antigene è stata eseguita in un'autoclave contenente tampone di estrazione citrato (10 mM, pH 6.0). La perossidasi endogena è stata bloccata con H2O2 al 3% (v/v) in metanolo per 30 min. Tra ogni passaggio, le sezioni sono state lavate in TBS. Le sezioni sono state incubate con siero di cavallo BSA allo 0,5% per 30 minuti, seguite da un'incubazione notturna con due diversi anticorpi primari per 1 ora a temperatura ambiente (LHR029 per WB/ELISA, Santa Cruz Biotechnology SC- 25828). Le sezioni sono state incubate con anticorpi secondari per 30 minuti. Le immagini sono state visualizzate con aminoetil carbazolo (AEC, Invitrogen, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). I controlli negativi erano senza anticorpi primari. Nessuno dei controlli negativi è stato colorato. La colorazione di contrasto è stata eseguita con ematossilina di Mayer e il montaggio è stato eseguito con Aquatex. Le sezioni sono state valutate su un microscopio Nikon Microphot-FXA (Nikon Corporation, Melville, NY, USA). L'analisi finale è stata eseguita utilizzando il software NDPview versione 1.2.36 (Hamamatsu Photonics, Iwata City, Japan.
Benefici dell'estratto di cistanche per il rene
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Li Juel Mortensen1, Mette Lorenzo1, Anne Jørgensen2, Jakob Albrethsen2, Niels Jørgensen2,Søren Møller3,4, Anna Maria Andersson2, Anders Juul2,4e Martin Blomberg Jensen1,5
1. Gruppo di endocrinologia scheletrica, minerale e gonadica, Dipartimento universitario di crescita e riproduzione, Rigshospitalet, 2100 Copenhagen, Danimarca; li.juel.mortensen@regionh.dk (LJM); mette.lorenzen.01@regionh.dk (ML)
2. Department of Growth and Reproduction and International Center for Research and Research Training in Endocrine Disruption of Male Reproduction and Child Health (EDMaRC), Rigshospitalet, University of Copenhagen, Blegdamsvej 9, 2100 Copenhagen, Danimarca; Anne.Joergensen.02@regionh.dk (AJ); Jakob.Christian.Albrethsen@regionh.dk (JA); Niels.Joergensen@regionh.dk (NJ); Anna-Maria.Andersson@regionh.dk (A.-MA); Anders.Juul@regionh.dk (AA)
3. Centro per l'imaging e la ricerca funzionale e diagnostica, Dipartimento di fisiologia clinica e medicina nucleare 260, Hvidovre Hospital, 2650 Copenhagen, Danimarca; Soeren.Moeller@regionh.dk
4. Dipartimento di Medicina Clinica, Facoltà di Scienze della Salute, Università di Copenaghen, 2200 Copenaghen, Danimarca
5. Divisione di ricerca su ossa e minerali, Harvard School of Dental Medicine/Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA