Parte Ⅲ: Gestione renale dell'albumina: dai primi risultati ai concetti attuali

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Parte Ⅲ: Gestione renale dell'albumina: dai primi risultati ai concetti attuali

Jakub Gburek, Bogusława Konopska e Krzysztof Goł˛ab

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Astratto:Albuminaè la principale proteina del plasma sanguigno, della linfa, del liquido cerebrospinale e interstiziale. La proteina partecipa a una varietà di importanti funzioni biologiche, come il mantenimento di una corretta pressione osmotica colloidale, il trasporto di importanti metaboliti e l'azione antiossidante. Sintesi dialbuminaavviene principalmente nel fegato e il suo catabolismo si verifica principalmente nell'endotelio vascolare di muscoli, pelle e fegato, nonché nell'epitelio tubulare renale. Un'indagine di lunga durata in quest'area ha delineato la via principale del suo catabolismo che coinvolge la filtrazione glomerulare, l'assorbimento endocitico tubulare tramite il tandem del recettore scavenger multiligando - complesso meno megalina e cubilina-amnione, nonché la degradazione lisosomiale ad amminoacidi. Tuttavia, la ricerca degli ultimi decenni indica che anche meccanismi aggiuntivi possono operare in questo processo in una certa misura. Assorbimento diretto dialbuminanei podociti glomerulari tramite il recettore per la regione cristallizzabile delle immunoglobuline (recettore neonatale FC). Inoltre, è stato suggerito il riciclaggio luminale di brevi peptidi nel flusso sanguigno e/o di nuovo nel lume tubulare o la transcitosi di molecole intere. L'articolo discute gli aspetti molecolari di questi processi e presenta le principali scoperte e controversie sorte alla luce delle ricerche relative all'ultimo decennio. La loro migliore caratterizzazione è essenziale per ulteriori ricerche sulla fisiopatologia del proteinuricorenalefallimento e sviluppo di strategie terapeutiche efficaci.

Parole chiave:albumina; renalecatabolismo delle proteine; tubulo prossimale renale; proteinuria; megalino;cubilino

manipolazione renale di albumina concistance

4. Trasporto intracellulare e degradazione dell'albumina

4.1.Trasporto ai lisosomi e degradazione

Il flusso intracellulare dialbuminaprocede per trasporto vescicolare. Grazie ai primi esperimenti, si è già scoperto che lo smistamento dialbumina, i suoi recettori e le stesse vescicole è strettamente correlato all'acidificazione del loro ambiente. L'alcalinizzazione delle vescicole con una soluzione di bafilomicina Al o NHACl ha portato a una rapida riduzione dialbuminaassorbimento, anche a basse concentrazioni. Allo stesso tempo, sia la rottura dialbuminanei lisosomi e il riciclaggio dei recettori alla membrana cellulare è stato rallentato [48,49,86].

L'acidificazione delle vescicole è inizialmente accompagnata dalla dissociazione del mantello di clatrina e dalla formazione di primi endosomi. Un'ulteriore acidificazione provoca la dissociazione dialbuminada complessi con megalina e cubilina e dal germogliamento di densi tubuli apicali che riportano i recettori sulla superficie cellulare. La dissociazione dei complessi è già stata osservata al di sotto del pH=6.5 [26,75,81].

Negli ultimi anni sono stati identificati i trasportatori coinvolti nell'acidificazione delle vescicole endocitiche. La V-ATPasi situata nella membrana di questo organello è coinvolta nel processo di trasferimento dei protoni all'interno dell'endosoma [87]. D'altra parte, è necessario introdurre ioni negativi per compensare il potenziale della membrana endosomiale. Nelle cellule dei tubuli prossimali, i canali CLC-5 del cloro svolgono un ruolo importante nel trasporto dello ione opposto. È stato dimostrato che CLC-5 è associato aalbumina-contenenti endosomi. Non può essere trovato negli endosomi contenenti destrano, sebbene V-ATP sia presente anche in entrambi i tipi di endosomi. L'abbassamento dell'espressione CLC-5 inibiscealbuminaendocitosi nel tubulo prossimale, ma non interessa la prima fase dell'endocitosi destrano. Lo studio condotto su topi con knockout del gene CLC-5 ne ha confermato l'importanza nel ricircolo di megalina e cubilina. La partecipazione del CLC-5 al processo di endocitosi è interessante anche per le malattie renali ereditarie. La malattia di Dent, in cui uno dei primi sintomi è la proteinuria, è causata da una mutazione del gene codificante CLC-5 [88,89].

Anche gli antiporter Na*/Ht (scambiatori sodio/protone - NHE), che rimuovono gli ioni H dall'interno della cellula con assorbimento simultaneo di ioni Nat, sono coinvolti nell'acidificazione dell'ambiente delle vescicole endosomiche. Stanno trasportando molecole che si trovano nella membrana plasmatica di molte cellule e il loro compito è mantenere il corretto pH all'interno della cellula. Queste proteine ​​sono costituite da due domini funzionali, vale a dire un dominio idrofobico contenente diverse sequenze transmembrana e un dominio idrofilo responsabile della regolazione della loro attività di trasporto [90]. La proteina NHE-3 è espressa nelle cellule epiteliali intestinali e in quella prossimalerenaletubuli, sempre sul lato apicale. È in grado di circolare tra la membrana cellulare e il compartimento endosomiale precoce, contribuendo all'acidificazione del contenuto delle vescicole. L'interiorizzazione del trasportatore NHE-3 avviene tramite vescicole di clatrina [91]. NHE-3 è probabilmente coinvolto nell'assorbimento degli ioni Na in queste cellule. I NHE{3}} endosomiali svolgono un ruolo importante nel processo dialbuminaendocitosi delle molecole. Si suppone che il gradiente di Na più nell'ambiente endosomiale si dissipi lungo il percorso endosomiale, e quindi NHE3 dovrebbe essere importante per le prime fasi dell'endocitosi, possibilmente prima dello stadio o degli stadi in cui H più -ATPasi esercita la sua funzione [91]. Gli inibitori NHE-3 causano disturbi nell'acidificazione delle prime vescicole, che ritarda considerevolmente il processo dialbuminaendocitosi. Questi disturbi sono in parte spiegati dal rallentato ritorno dei recettori alla membrana cellulare a causa di disturbi nel processo della loro dissociazione. Un altro motivo potrebbe essere l'interruzione della formazione e della fusione delle vescicole di trasporto attraverso l'alcalinizzazione. Inoltre, NHE{0}} è risultato essere responsabile solo dell'abbassamento del pH nella primissima fase dell'endocitosi. La sua inibizione farmacologica porta ad una significativa riduzione dell'efficienza di questo processo [92]. Inoltre, l'obesità può sottoregolare l'espressione di NHE-3 e Na*/K più ATPasi a causa dei livelli ridotti del fattore p-Akt e di conseguenza ridurrealbuminariassorbimento ed endocitosi [93]. Inoltre, il pool significativo di NHE-3 esiste come un complesso multimerico con megalina nel bordo del pennello del tubulo prossimale [94]. Esistono diversi meccanismi di regolazione dell'endocitosi. Tuttavia, nel caso dialbuminariassorbimento, sono poco conosciuti.

Gli ioni di calcio non influiscono direttamente su questo processo. Il cambiamento nella concentrazione citoplasmatica di Ca²ioni influisce solo leggermentealbuminaassorbimento. Tuttavia, la loro completa rimozione dallo spazio extracellulare si traduce in una marcata riduzione della capacità di assorbimento delle proteine ​​(Km aumenta da 0.1.{2}}a 2.5.10-6M), senza un effetto sulla velocità massima di assorbimento. È probabile che la presenza di ioni calcio determini l'efficacia del primo stadio dell'endocitosi, cioè il legame dei ligandi da parte dei recettori [95]. È noto che la stimolazione della protein chinasi A (PKA) da parte dell'adenosina monofosfato ciclico (cAMP), della forskolina o dell'ormone paratiroideo provoca una riduzione del totalealbuminacapacità di ricaptazione ma non cambia l'affinità della proteina per il recettore. Questo meccanismo sottostante relativo all'alcalinizzazione degli endosomi precoci dipende dalla presenza di cAMP. L'effetto del fosfatidilinositolo 3-chinasi(PI-3K) sualbuminaè stata anche segnalata endocitosi [92,96]. L'inibizione della sua attività attraverso l'uso di wortmannin indebolisce significativamente questa efficienza del processo. Un'attività della fosfatidilinositolo3-chinasi è correlata alla fase di interiorizzazione dei ligandi. Le proteine ​​G sono anche coinvolte nella cascata di segnalazione associataalbuminainteriorizzazione. L'assorbimento dialbuminaè aumentato nelle cellule epiteliali renali dell'opossum (cellule OK) trasfettate con il gene della subunità G. i3. Questo effetto è stato soppresso dalla tossina della pertosse all'aumentare della concentrazione e del tempo di incubazione. Pertanto, il ruolo delle proteine ​​G sembra essere strettamente correlato alla regolazione dei processi di trasporto vescicolare [56,97,98].

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4.2. Degradazione lisosomiale

L'idrolisi lisosomiale delle proteine ​​avviene con la partecipazione di una serie di proteasi lisosomiali, denominate collettivamente catepsine. Il ruolo più importante nella degradazione delle proteine ​​è attribuito alle catepsine B, H e L. Queste idrolasi vengono trasportate sotto forma di proenzimi alle prime vescicole endocitiche che coinvolgono il recettore del mannosio{0}}fosfato e vengono attivate man mano che maturano. L'idrolisi parziale delle proteine ​​si verifica già negli endosomi, tuttavia, la massiccia degradazione avviene solo nei lisosomi. Studi di immunocitochimica mostrano che almeno diverse popolazioni di endosomi e lisosomi, in termini di composizione della catepsina, possono essere distinte nelle cellule epiteliali del tubulo prossimale [99]. Studi recenti indicano che la fusione dialbumina-contenere endosomi con lisosomi dipende dai recettori di membrana di questi organelli. La proteinuria si verifica nei topi con knockout SCARB2/Limp-2 lisosomiale, appartenenti alla famiglia dei recettori scavenging di classe B, nonostante la corretta espressione e interiorizzazione dialbuminarecettori. È stato trovato in questi topi etichettati in modo fluorescentealbuminaè stato effettivamente assorbito dopo somministrazione endovenosa ma non si è collocato con la catepsina lisosomiale B e non è stato degradato. Un effetto simile è stato osservato anche nei topi wild-type con massiccia albuminuria indotta da ipalbuminasomministrazione, indicando che, a livello del tubulo prossimale, la limitata capacità di degradazione lisosomiale gioca un ruolo più importante nello sviluppo dell'albuminuria rispetto alla capacità del suo riassorbimento [100,101]. Tuttavia, lo studio di Nielsen et al. [102] hanno rivelato che la capacità lisosomiale è aumentata sotto proteinuria in un modello murino di glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS), supportando i risultati precedenti che la capacità di digestione lisosomiale può essere aumentata sotto proteinuria [99].

Gran parte dei dati sperimentali suggeriscono che le proteine, tra cuialbumina—sono completamente degradati nei lisosomi in amminoacidi liberi, che vengono poi trasportati attraverso la membrana lisosomiale e basolaterale al flusso sanguigno. Negli esperimenti che utilizzano tubuli prossimali isolati e perfusi di coniglio e proteine ​​marcate con 125I, quasi tutta la radioattività del perfusato è associata alla loro catabolite2I-mono tirosina. Risultati simili sono stati ottenuti misurando l'efflusso di radioattività da sezioni renali perfuse con preparazioni proteiche radiomarcate [26,47].

Tuttavia, i risultati degli studi in questo senso non sono coerenti. Alcuni autori suggeriscono che la degradazione lisosomiale dialbuminanon è completo e i suoi prodotti sono prevalentemente catene polipeptidiche di lunghezza variabile, che vengono restituite al lume del tubulo ed escrete nelle urine. Osicka et al.[103,104] hanno dimostrato che quantità significative di peptidi derivano daalbuminasi trovano nelle urine dopo somministrazione endovenosa di 3H-albuminaai topi. Tuttavia, non hanno specificato la dimensione dei frammenti osservati nel loro studio.

Risultati simili sono stati ottenuti da Gudehithlu et al. [105] mediante somministrazione endovenosa di 125I marcatoalbuminaai topi. Le proteine ​​urinarie sono state precipitate con acido tricloroacetico e sottoposte a filtrazione su gel consentendo la determinazione sia dei frammenti che dell'interoalbuminamolecole. Piccole quantità di autoctonialbumina(2 percento) e quantità significative dei suoi frammenti (98 percento) con un peso molecolare di 5-14 kDa sono state trovate nelle urine. Questi risultati hanno anche confermato esperimenti in vitro su cellule del tubulo prossimale HK-2 umano ed ex vivo utilizzando reni di ratto perfusi. La quantità dialbuminaescreto sotto forma di molecole intere e polipeptidi era circa 70- volte superiore ai valori determinati finora: frammenti a basso peso molecolare dialbuminanelle urine sono stati trovati anche negli studi sui ratti con diabete causato dalla somministrazione di streptozotocina [35].

Queste discrepanze possono essere correlate all'uso di metodi radioimmunologici in studi precedenti che non rilevano frammenti polipeptidici privi di epitopi specifici per gli anticorpi applicati, cosa che potrebbe verificarsi nel caso dialbuminaprodotti di degradazione. Vale la pena notare che tali importi dialbuminaescreto nelle urine corrisponderebbe alle quantità di filtratoalbuminacon l'ipotesi di un GSC relativamente grande, come discusso sopra.

Studi recenti suggeriscono che ilalbuminai frammenti osservati nelle urine non lo sonorenalecataboliti, ma sono l'effetto della filtrazione glomerulare libera, sfuggendo al riassorbimento tubulare in un modo fino ad ora sconosciuto. Sia nei topi di controllo che nei topi con knockout di cubilina o megalina, principalmente a basso peso molecolarealbuminametaboliti sono stati trovati nelle urine dopo 125Ialbuminaamministrazione. L'inibizione dell'endocitosi tubulare non ha influenzato la forma dialbuminapresente nelle urine. Generazione di basso molecolarealbuminaframmenti sono stati osservati anche nel plasma [106].

4.3. Transcitosi

Il ruolo della transcitosi come modalità alternativa di interiorizzazionealbuminail targeting è stato proposto da Russo et al. nel 2009[33]. Nel loro studio, utilizzando la microscopia elettronica e l'etichetta con oro colloidalealbumina, gli autori hanno osservato la presenza dialbuminanon solo nei lisosomi ma anche nelle grandi vescicole con un diametro di circa 500 nm. Queste strutture si sono verificate in tutta la cellula e sono state spesso fuse all'invaginazione della membrana basolaterale, rilasciando il suo contenuto nella rete peri-tubulare dei vasi capillari. L'integrità delle molecole è stata verificata per mezzo di anticorpi diretti contro varialbuminaframmenti. Gli autori suggeriscono la coesistenza di due meccanismi intracellularialbuminasmistamento in base all'integrità delle molecole. Le molecole proteiche intatte ritornano in circolo attraverso una veloce ed efficiente transcitosi, mentre una piccola parte delle molecole che presentano alterazioni strutturali vengono trasportate ai lisosomi, dove, secondo il modello classico, vengono scomposte in residui di amminoacidi e in questa forma ritornano alla circolazione [33,38]. Il modello ha suscitato numerose polemiche. Gli oppositori di questa teoria, tenendo conto di molti anni di esame microscopico delle cellule dei tubuli prossimali, minano l'esistenza di questi tipi di vescicole e la possibilità della loro fusione con la membrana basolaterale. Suggeriscono che le strutture osservate siano il risultato di artefatti legati alla fissazione dei tessuti per immersione. Finora sono stati utilizzati metodi basati sulla perfusione, considerati ottimali [41,107l. D'altra parte, studi recenti su topi nefrosici con knockout di podocina, megalina e cubilina indicano che l'endocitosi, dipendente da questi recettori, non è significativa per il mantenimentoalbuminaomeostasi. Nonostante la totale inibizione del riassorbimento a seconda di questi recettori, plasmaalbuminai livelli sono rimasti gli stessi [108].

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5. Conclusioni

Il rene è responsabile di circa il 10 per cento delalbuminapiscina catabolizzata giornalmente. Questa frazione è significativa per l'omeostasi. Eventuali anomalie della funzionalità renale, inizialmente causate da un danno continuo ai glomeruli, possono eventualmente portare a un grave insufficienza di questo organo e di conseguenza a un danno tubulare irreversibile. La tossicità secondaria è attribuita alla disregolazione delle funzioni delle cellule epiteliali dovuta al sovraccarico proteico in condizioni di eccessiva endocitosi nei tubuli prossimali [10].Renaleil catabolismo delle proteine ​​include la filtrazione nel glomerulo, l'adsorbimento e l'endocitosi nei tubuli prossimali e l'idrolisi intracellulare o la transcitosi delle molecole assorbite.

Il modello comunemente accettato presuppone un livello relativamente basso di glomerularealbuminafiltrazione grazie alle sue dimensioni relativamente grandi e al basso punto isoelettrico, al riassorbimento efficiente per endocitosi, che coinvolge i recettori megalina e cubilina, al trasporto vescicolare ai lisosomi e all'idrolisi ai residui di singoli amminoacidi. In questo modello, solo una quantità trascurabile dialbuminaviene escreto nelle urine e i prodotti di degradazione tornano per lo più in circolazione.

Gli studi che sono stati condotti nell'ultimo decennio hanno prodotto molte osservazioni inaspettate che possono cambiare radicalmente le opinioni sull'argomentorenalealbuminacatabolismo. Da essi emergono meccanismi alternativi che incidono sia sull'immagine quantitativa che qualitativa di questo processo. Nuovi studi indicano, tra l'altro, chealbuminala permeazione può verificarsi con una resa {{0}} volte superiore rispetto a quanto suggerito da studi precedenti. Il valore proposto dell'SGC sarebbe quindi 0.04, non inferiore a 0,001 come nel modello attualmente accettato [33]. Altre controversie riguardano il grado di degradazione lisosomiale dialbuminae la direzione dell'escrezione dei metaboliti. Alcune osservazioni supportano l'opinione che la proteolisi lisosomiale dialbuminaproduce principalmente polipeptidi con un peso molecolare di 5-14 kDa, che vengono in gran parte riciclati nel lume del tubulo ed escreti nelle urine. Rapporti sul fenomeno delalbuminaanche la transcitosi sono sorprendenti. Questo meccanismo spiegherebbe l'efficiente assorbimento e trasporto di maggiori quantità di filtratoalbumina. Allo stesso tempo, questi rapporti suggeriscono che le disfunzioni del tubulo prossimale contribuiscono principalmente all'albuminuria nel corso di varie malattie e non, come si pensava, alle glomerulopatie. I concetti attuali e le nuove scoperte riguardanti il ​​renealbuminala gestione sono riassunti nella Figura 2.

Nuovi rapporti hanno acceso un acceso dibattito nel mondo della scienza. Se confermati in ulteriori studi, possono cambiare le opinioni sul meccanismo dialbuminaomeostasi e patomeccanismi delle malattie associate all'albuminuria, come la sindrome nefrosica,renalefallimento contro ipertensione, nefropatia diabetica e malattie cardiovascolari.

Vale la pena ricordare che una varietà di dati nel campo del riassorbimento tubulare prossimale, del metabolismo lisosomiale e dell'elaborazione intracellulare sono stati raccolti durante gli studi di base sulla struttura delle cellule epiteliali renali. I risultati sono stati riassunti in diverse eccellenti recensioni [109-112].

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6. Prospettive

Tenendo conto dei dati disponibili, riteniamo che i modelli alternativi non siano finora ben documentati e lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche dovrebbe basarsi sul concetto attualmente accettato.

Per verificare il significato dei concetti attualmente accettati e alternativi, sono necessarie ulteriori indagini. Sono giustificati lo sviluppo di nuovi modelli animali e studi clinici più dettagliati, che coinvolgono molecole rilevanti, come proteine ​​glomerulari, recettori endocitici, trasportatori vescicolari e altre proteine ​​endosomiche/lisosomiali.

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