Parte Ⅱ La carenza di Smad3 migliora la terapia basata sulle isole per il diabete e il danno renale diabetico promuovendo la proliferazione cellulare tramite il meccanismo E2F3-dipendente

Metodi

1. Animali

I topi Smad3-null (Smad3KO) sono un gentile dono del Prof. Chuxia Deng e sono mantenuti in eterozigoti (Smad3 plus /- ) in background C57BL/6 [20]. I topi Smad3KO sono stati generati dall'incrocio di topi Smad3 plus /-. I topi db/db con mutazione di Lepr (recettore della leptina) in background C57BLKS sono stati acquistati dall'Animal Experimental Center dell'Università cinese di Hong Kong (CUHK). Tutti gli animali sono stati mantenuti in una specifica struttura priva di agenti patogeni (SPF) con libero accesso a cibo e acqua a un ciclo giorno/notte di 12/12 ore. Tutte le manipolazioni sugli animali in questo studio sono state eseguite seguendo i regolamenti e approvati dal Comitato etico degli esperimenti sugli animali di CUHK con il rif. No. 18-177-MIS.

2. Modello murino diabetico indotto da streptozocina (STZ).

Topi maschi C57BL/6 all'età di 8-10 settimane sono stati iniettati per via intraperitoneale con 50 mg/kg/giorno di STZ al giorno per 5 giorni consecutivi. 5 giorni dopo l'iniezione STZ finale, i topi con una glicemia casuale stabile superiore a 16 mM per 2 giorni consecutivi sono stati considerati come l'istituzione riuscita del diabete e utilizzati come topi riceventi per il trapianto di isole.

3. Isolamento delle isole, trapianto e valutazione del fenotipo diabetico

Le isole sono state isolate da topi Smad3 knockout (KO) maschi o femmine o wild-type (WT) all'età di 8-10 settimane come descritto in precedenza [21]. Per eseguire il trapianto di isole, è stato indicato che diverse isole sono state trapiantate sotto la capsula renale di topi maschi db/db all'età della settimana 4 o di topi diabetici indotti da STZ il giorno 7 dopo l'iniezione finale di STZ seguendo il protocollo descritto da Szot et al. 22]. In breve, il topo ricevente è stato anestetizzato dall'anestesia Combo (1,5% di ketamina e 0,15% di xilazina, 6 μL/g di peso corporeo). Dopo la perdita di coscienza, è stata praticata un'incisione di 1 cm sulla pelle che ricopre il rene sinistro. Estrarre delicatamente il rene e mantenerlo umido con soluzione fisiologica sterile durante l'intervento chirurgico. Con un ago da 25G, fai un piccolo graffio sulla capsula per creare un taglio. I numeri indicati di isole sono stati consegnati nella capsula renale da un tubo PE50. Dopotutto, le isole sono state trapiantate, sigillando la tacca mediante cauterizzazione a fuoco basso. Sostituire il rene e chiudere il peritoneo con punti di sutura. Sigilla la pelle con delle graffette. 100 μL di soluzione di penicillina-streptomicina (Gibco, cat # 15140122, USA) sono stati iniettati per via intraperitoneale per prevenire l'infezione. 100 μL di Tegmic sono stati iniettati per via intramuscolare per alleviare il dolore. L'animale è stato posto in un ambiente caldo fino al completo recupero. La stessa procedura operativa è stata eseguita anche nei topi di controllo sham ma senza infusione di isole. Sia i livelli casuali che quelli a digiuno di 6 ore (RBG e FBG) del sangue della punta della coda sono stati controllati settimanalmente con un glucometro portatile (Roche, ACCU-CHEK® Performa). Il test di resistenza all'insulina (IPITT), il test di tolleranza al glucosio (IPGTT), i livelli di HbA1c e l'insulina sierica sono stati misurati come precedentemente descritto [9].

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4. Proteine ​​urinarie totali e creatinina sierica

L'urina delle 24 ore è stata raccolta in una gabbia metabolica. La proteina urinaria totale delle 24 ore è stata calcolata moltiplicando il volume di urina e la concentrazione di proteine ​​urinarie che è stata quantificata dal kit di analisi delle proteine ​​​​di Bradford Quick Start (Bio-Rad, cat # 5000201, USA). La creatinina sierica è stata determinata con il kit di quantificazione della creatinina (Stanbio Laboratory, cat# 0430-120, USA).

5. Istopatologia

I cambiamenti istopatologici renali sono stati esaminati in sezioni fissate con paraformaldeide e incluse in paraffina (4 µm) con il reagente Periodic Acid-Schiff's (PAS) come precedentemente descritto [23]. L'espansione della matrice mesangiale è stata valutata utilizzando il programma di immagini quantitative (Image-Pro Plus 7.0, Media Cybernetics) come precedentemente descritto [23].

6. Immunoistochimica

Il rene o il pancreas portatori di isole è stato fissato in paraformaldeide al 4%, incorporato in paraffina e sezionato a 4 μm. Dopo la reidratazione, le sezioni sono state trattate con recupero dell'antigene mediato da microonde in 0.01 M citrato (pH 6.0) per 10 minuti e blocco in 5% di BSA per 1 ora . L'incubazione dell'anticorpo primario è stata eseguita durante la notte a 4 gradi. Per la colorazione fluorescente, è stato applicato un anticorpo secondario fluorescente a temperatura ambiente (TA) per 1 ora. Per la termogenesi mediata da DAB, prima del recupero dell'antigene è stata inclusa una fase aggiuntiva di blocco del 3% di H2O2 per 15 minuti. Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, è stato aggiunto il polimero coniugato con HRP (Envision plus System, Dako, USA). Per la colorazione di E2F3, il recupero dell'antigene è stato eseguito in soluzione EDTA-Tris (pH 9,0). Gli anticorpi utilizzati nell'immunoistochimica sono stati dettagliati nella Tabella S2. L'area positiva alla colorazione è stata quantificata con il software Image J (v1.47, NIH, USA).

Estratto di cistanche

7. Misurazione della massa cellulare innestata nel rene portatore di isole

Un indice dell'area cellulare media per sezione è stato utilizzato per quantificare in modo semiquantitativo la massa cellulare nell'innesto di isole. In breve, il rene portatore di isole (incluso in paraffina) è stato sezionato successivamente a 4 μm lungo l'asse sagittale. Le sezioni continue a intervalli di 160 μm sono state immunocolorate in modo fluorescente per l'insulina. Almeno 6 sezioni con colorazione insulino-positiva sono state utilizzate per il calcolo dell'area cellulare per sezione in ciascun topo. L'area cellulare insulino-positiva in ciascuna sezione è stata quantificata con il software Image J (v1.47, NIH, USA). L'indice dell'area cellulare media per sezione in ciascun topo è stato calcolato dividendo l'area totale insulino-positiva in tutte le sezioni per il numero di sezioni insulino-positive.

8. Coltura primaria di cellule insulari

Le isole isolate sono state dissociate in singole cellule e seminate nella 96-pozzetto in 200 μL di RPMI 1640 (Gibco, USA) più il 10% di FBS (Gibco, USA) più l'1% di penicillina-streptomicina (Gibco, USA) integrato con 20 mM di glucosio. Le cellule delle isole sono state coltivate per il tempo indicato in un incubatore impostato a 37 gradi, 5 percento di CO2 e 100 percento di umidità. Per il knockdown di E2F3 mediato da adenovirus, le cellule di isole dissociate sono state coltivate in un terreno contenente adenovirus che sovraesprimeva RNA a forcina corta (shRNA) mirato al topo E2F3 (shE2F3) o shRNA non specifico di controllo (mostrato) a un titolo di 10 pfu per cellula per 2 giorni seguiti dalla sostituzione media. La sequenza radice del duplex shE2F3 era 5'-CATCCATGCTCTATTCTGT-3'. Le cellule disperse da 50 isole sono state seminate per pozzetto per immunocolorazione e RT-PCR e 100 isole per pozzetto per Western blot, che sono state condotte come descritto in precedenza [9].

9. Marcatura di BrdU in vivo e in vitro

Per eseguire l'etichettatura BrdU in vivo, i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con 50 mg/kg/giorno di BrdU (in PBS) per 7 giorni dal 2° giorno dopo il trapianto di isole e sacrificati 2 ore dopo l'ultima iniezione. Per l'etichettatura in vitro di BrdU, le cellule delle isole disperse sono state coltivate per 48 ore seguite dalla sostituzione con terreno fresco contenente 10 μM di BrdU e coltivate per ulteriori 24 ore. L'immunocolorazione fluorescente contro BrdU nel tessuto e nelle cellule in coltura è stata eseguita come precedentemente descritto [9].

Polvere di cistanche

10. RNA-Seq

Le isole sono state isolate dai topi Smad3WT-db/db, Smad3KO-db/db, Smad3WT-db/m e Smad3KO-db/m. Per ogni genotipo, le isole di più di 5 topi sono state raggruppate per l'isolamento dell'RNA. L'RNA è stato preparato con il miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Germania). L'RNA-seq e l'analisi dei dati a valle sono stati descritti in precedenza [9]. Il livello di espressione di un dato gene è stato presentato come frammenti per kilobase di trascrizione per milione di letture mappate (FPKM). Il gene espresso in modo differenziale (DEG) è stato definito come maggiore o uguale a 2 volte la varianza di FPKM tra due gruppi. I DEG sovraregolati e sottoregolati sono stati combinati e utilizzati per l'analisi dell'arricchimento del percorso Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) con le risorse bioinformatiche DAVID online (v6.8) con impostazioni predefinite. La sottocategoria GOTERM_BP_DIRECT è stata utilizzata per l'analisi GO.

11. Immunoprecipitazione

Per eseguire l'immunoprecipitazione nelle isole del topo, circa 500 isole appena isolate sono state lisate in 500 mL di tampone RIPA. Un anticorpo anti-Smad3 di coniglio (2 ug) o un isotipo IgG di coniglio è stato aggiunto e incubato a 4 gradi durante la notte con rotazione delicata. Quindi, sono stati aggiunti 20 μL di perle di agarosio di proteina A (Beyotime, cat # P2051, Cina) e incubate per 2 ore a 4 gradi . Dopo il lavaggio robusto con tampone RIPA fresco, la proteina legata è stata rilasciata mediante denaturazione nel tampone di caricamento 1xSDS e sottoposta ad analisi Western blot. Per evitare l'influenza della catena pesante IgG, è stata utilizzata una IgG anti-coniglio di topo specifica per catena leggera (HRP coniugato, Abmart, cat # M21006, Cina) per riconoscere la proteina Smad3 precipitata.

12. Immunoprecipitazione della cromatina-ChIP

Per eseguire il ChIP nelle isole del topo, sono state raccolte circa 2000 isole da topi C57BL/6 di 8-10 settimane e utilizzate come una preparazione ChIP. Le isole appena isolate sono state stimolate con 10 ng/mL di TGF- 1 (Gibco, USA) per 15 minuti in RPMI 1640 più l'1% di FBS più l'1% di penicillina-streptomicina. ChIP è stato eseguito con il SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (CST, USA) seguendo le istruzioni raccomandate. Gli anticorpi e i primer utilizzati nel saggio ChIP sono descritti in dettaglio nelle tabelle S1 e S2.

Cistanche standardizzate

13. Saggio reporter a doppia luciferasi

Il promotore E2F3 del mouse (da -1000 a più 451 bp) è stato clonato nel vettore di base pGL3- (pGL3-E2F3.Pro). Contemporaneamente, è stata condotta la mutazione puntiforme del sito di legame Smad3 per generare il pGL3- E2F3.Pro. Mut. Per eseguire il test del reporter della doppia luciferasi, le cellule HEK293T sono state seminate nella 24-pozzetto a una densità di 5 x 104 cellule/pozzetto. Il giorno successivo, le cellule sono state trasfettate con 500 ng di pGL3-Basic o pGL3-E2F3.pro o pGL3-E2F3.pro.mut combinato con pcDNA3.1-Smad3, che sovraesprime il topo Smad3, o meno (come indicato nella Figura 10F) con il metodo del fosfato di calcio. Il vettore pEGFP-C1 è stato integrato per bilanciare la dose di trasfezione in ciascun trattamento. 10 ng pGL4.73.huc/SV40 vettore che esprime renilla luciferasi è stato incluso in ciascun trattamento per normalizzare l'efficienza di trasfezione. 6 ore dopo la trasfezione, il mezzo è stato cambiato seguito da un'incubazione per ulteriori 48 ore. Le cellule sono state lisate e l'attività della luciferasi è stata determinata con il Dual-Luciferase ® Reporter Assay System (Promega, USA) e quantificata in un luminometro (VICTORTM X4 2030 Multilabel Reader, PerkinElmer, USA). L'attività trascrizionale del promotore E2F3 clonato è stata presentata come rapporto di valore tra luciferasi di lucciola e luciferasi di renilla. Ogni trattamento è stato eseguito in triplicato.

14. Statistiche

I dati sono stati presentati come media ± SD e analizzati con il software SPSS (16.0). La normalità dei dati è stata verificata mediante il test One-Sample di Kolmogorov-Smirnov. L'omogeneità delle varianze tra i gruppi è stata testata dalla statistica di Levene. Per il confronto tra i due gruppi è stato utilizzato il test t di Student. Per il confronto tra più gruppi, è stata utilizzata l'ANOVA unidirezionale con un test LSD se si assumeva una varianza uguale. Per la varianza uguale che non è stata assunta, è stata utilizzata una statistica del test di Welch alternativa seguita da confronti multipli con il test T2 di Tamhane. P < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.

Integratori di cistanche

Conclusioni

La carenza di Smad3 migliora ampiamente la terapia sostitutiva delle isole sia per il T1DM che per il T2DM e protegge dal danno renale diabetico. L'aumento della proliferazione cellulare dipendente da E2F3- può essere un meccanismo chiave della terapia delle isole Smad3KO sia nel T1DM che nel T2DM. Pertanto, la terapia sostitutiva cellulare Smad3KO può essere clinicamente una migliore strategia terapeutica per il diabete.

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Hong-Lian Wang1,2, Biao Wei2, Hui-Jun He2, Xiao-Ru Huang2,3, Jing-Yi Sheng2,4, Xiao-Cui Chen2,5, Li Wang1, Rui-Zhi Tan1, Jian-Chun Li1, Jian Liu1, Si-Jin Yang6, Ronald CW Ma2 e Hui-Yao Lan2,7

1 Centro di Ricerca per la Medicina Integrata e Dipartimento di Nefrologia, Affiliato Ospedale di Medicina Tradizionale Cinese della Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Cina.

2. Dipartimento di Medicina e Terapeutica e Li Ka Shing Institute of Health Sciences, Università cinese di Hong Kong, Hong Kong, 999077, Cina.

3. Laboratorio congiunto Guangdong-Hong Kong sulle malattie renali immunologiche e genetiche, Ospedale popolare provinciale del Guangdong, Accademia delle scienze mediche del Guangdong, Guangzhou, Guangdong, 510080, Cina.

4. State Key Laboratory of Bioelectronics, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices, School of Biological Sciences & Medical Engineering, Southeast University, Nanchino, Cina.

5. Laboratorio chiave di prevenzione e gestione della malattia renale cronica della città di Zhanjiang, Istituto di nefrologia, ospedale affiliato dell'Università medica del Guangdong, Zhanjiang, Guangdong, 524001, Cina.

6. Base nazionale di ricerca clinica sulla medicina tradizionale cinese, ospedale di medicina tradizionale cinese affiliato della Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan, 646000, Cina.

7. CUHK-Guangdong Provincial People's Hospital Joint Research Laboratory on Immunological and Genetic Kidney Diseases, Università cinese di Hong Kong, Hong Kong, 999077, Cina.