Parte 1: Un nuovo approccio per migliorare il potenziale rigenerativo delle cellule progenitrici endoteliali circolanti nei pazienti con malattia renale allo stadio terminale

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Astratto: Le cellule progenitrici endoteliali (EPC) circolanti derivate dal midollo osseo facilitano la riparazione vascolare in diversi organi, incluso il rene, ma sono progressivamente ridotte allo stadio terminalemalattie renali(ESKD), che correla con gli esiti cardiovascolari e la relativa mortalità. Abbiamo quindi determinato se il miglioramento degli effetti riparativi dei tessuti delle cellule stromali mesenchimali (BM-MSC) derivate dal midollo osseo umano con gli effetti vasculogenici della relaxina umana ricombinante (RLX) potesse promuovere la proliferazione e la funzione dell'EPC. CD34 più EPC sono stati isolati dal sangue di pazienti sani ed ESKD, coltivati ​​fino alla formazione di EPC tardivi, quindi stimolati con mezzi condizionali derivati ​​da BM-MSC (CM; 25 percento o), RLX (1 o 10 ng/mL) o entrambi trattamenti combinati. Mentre RLX da solo ha stimolato la proliferazione di EPC, la formazione di tubi capillari e la guarigione delle ferite in vitro, queste misure sono state migliorate più rapidamente e notevolmente dagli effetti combinati di CM e RLX derivati ​​​​da BM-MSC in EPC derivati ​​​​da pazienti sani ed ESKD. Questi risultati hanno importanti implicazioni cliniche, avendo identificato una nuova terapia di combinazione in grado di ripristinare e migliorare il numero e la funzione di EPC nei pazienti con ESKD.

Parole chiave: cellule progenitrici endoteliali; malattia renale allo stadio terminale; cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo; rilassarsi; la guarigione delle ferite; angiogenesi; rigenerazione

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1. Introduzione

Malattia renale cronica(CKD) è un problema di salute globale, definito come una riduzione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) inferiore o uguale a 60 ml/min/1,73 m², che spesso porta allo stadio terminale (stadio V) della malattia renale (ESKD; definita come GFR Inferiore o uguale a 15 ml/min/1,73 m2)[2]. Le caratteristiche patologiche dell'insufficienza renale cronica comprendono l'atrofia tubulare associata alla riduzione dei capillari renali e dei podociti, la distruzione delle cellule endoteliali renali e lo sviluppo difibrosi renale[3,4]. L'endotelio renale è compromesso durante questi processi, con conseguente alterazione dell'angiogenesi e della funzionalità renale [5]. Seguentedanno ai reni, le cellule progenitrici endoteliali (EPC) derivate dal midollo osseo vengono reclutate nei siti della lesione per facilitare la riparazione dei tessuti [6]. Le EPC svolgono un ruolo fondamentale nella maturazione e proliferazione delle cellule endoteliali renali, nell'integrità vascolare e nella riparazione dell'endotelio danneggiato. Tuttavia, i numeri di EPC circolanti sono progressivamente ridotti nei pazienti con ESKD [7-9], il che è correlato agli esiti cardiovascolari avversi [9,10] e alla mortalità a lungo termine.

È stato riportato che le cellule stromali mesenchimali (MSC) promuovono l'angiogenesi stimolando la programmazione EPC. Tuttavia, mentre le MSC sono state valutate in vari studi clinici [13], la loro capacità di facilitare la rigenerazione endoteliale renale non è stata studiata. Studi recenti del nostro laboratorio hanno identificato il potenziale terapeutico potenziato della combinazione di MSC derivate dal midollo osseo umano (BM) con un agente antifibrotico, vale a dire la relaxina (gene{3}}) umana ricombinante (serelaxin; RLX[14) nel miglioramento danno ai reni,infiammazionee fibrosi in modelli preclinici di malattia. Sebbene l'RLX da solo possa stimolare la proliferazione di EPC derivate dal sangue umano e la produzione di ossido nitrico (NO) in vitro e la vasculogenesi nei topi in vivo[18], non è noto se i suoi effetti combinati con BM-MSC possano accelerare e/o potenziare l'EPC- angiogenesi derivata e guarigione delle ferite. Questo studio ha quindi valutato il potenziale terapeutico della combinazione di supporti condizionati (CM) derivati ​​​​da RLX e BM-MSC su proliferazione, angiogenesi e guarigione delle ferite derivate da pazienti ESKD sani in vitro.

2. Materiali e metodi

2.1. Isolamento EPC e cultura dal sangue periferico

Dopo aver ricevuto un modulo di consenso del paziente firmato, circa {0}} ml di sangue da controlli maschi sani sono stati raccolti dall'Australian Red Cross Blood Service. Al contrario, solo ~5 ml massimo di sangue di pazienti maschi con ESKD sono stati raccolti dal Monash Medical Center a causa delle loro condizioni di salute. Tutti i campioni di sangue sono stati elaborati entro 24 ore dal tempo di raccolta. Tutti i campioni di sangue sono stati diluiti con 1 soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) fino a un volume totale di 20 ml. Quindi, il sangue è stato accuratamente stratificato su 15 ml di Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare, Uppsala, Svezia) in una provetta Falcon da 50 ml (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) e centrifugato a 400× g per 40 minuti a temperatura ambiente per separare il buffy coat dagli altri componenti utilizzando un metodo di separazione a gradiente di densità come descritto in precedenza [19,20]. Dopo la separazione del gradiente, lo strato superiore contenente plasma e piastrine è stato rimosso inserendo con cura una pipetta sierologica, lasciando indisturbato il buffy coat contenente cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), costituito da cellule progenitrici endoteliali (EPC). Il pellet è stato risospeso in 2 ml di Endothelial Cell Growth Media (EGM){13}} Microvascular (MV)Bullet Kit (prodotto #CC-3162, Lonza, Hayward, CA, USA); integrato con 5% di siero bovino fetale (FBS), 0,04% di idrocortisone, 0,4% di fattore di crescita dei fibroblasti umani (hFGF) e 0,1% di fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), R3-fattore di crescita simile all'insulina (IGF) )-1, acido ascorbico, fattore di crescita epidermico umano (hEGF) e gentamicina solfato/amfotericina (GA-1000), per coltivare EPC isolati. Le cellule sono state contate utilizzando un contatore di cellule automatizzato CountessM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) prima di essere seminate su piastre/flaconi di coltura rivestiti di fibronectina.

The yield of EPC varied significantly between the uncomplicated control and ESKD patients. More specifically EPC yield was significantly lower in ESKD patient samples compared to control and this observation was consistent with previous studies reported in our laboratory[19]. EPCs isolated from healthy controls were directly seeded into T-75 flasks(1-10 × 10'cells per sample), which were supplemented with 10 mL of pre-warmed endothelial growth media-2(EGM-2).In contrast, due to the low yield of EPCs from the ESKD patient samples, the cells were seeded at a density of 1 × 10°cells per well into 12 well plates, with the addition of pre-warmed EGM-2, giving a total volume of 2 mL per well. Due to the large variability in the yield of EPCs isolated from ESKD patients, cells were plated in one well of a 12-well plate if the cell yield was less than 1 ×10°cells. The media was changed every second day until outgrowth endothelial cells (OECs, also known as late EPCs) were observed. These late EPCs were identified by their cobble-stone appearance under light microscopy (Olympus CK-X41, USA). A maximum period of 30 days was allowed for late EPCs to be detected, which were further cultured until~80% confluency was reached. The cells were then passaged 1-2 times to obtain the desired number of cells for all functional assays including proliferation, tube formation, and wound-healing assays as detailed below. Cellular morphological characteristics were further assessed by the ability of the EPC cultures in both control and ESKDpatients to form a number of colonies (>50 cellule/colonia) utilizzando il test dell'unità formante colonia (CFU).

2.2. Preparazione di mezzi condizionati (CM) da BM-MSC in coltura

Poiché l'aggiunta di BM-MSC alle colture EPC comprometterebbe gli endpoint associati all'EPC da misurare, è stato deciso che sarebbe stato meglio analizzare gli effetti del CM derivato da BM-MSC sulla funzione EPC, come precedentemente utilizzato per l'analisi di altri endpoint [19]. In breve, le BM-MSC sono state coltivate in Alpha-Minimum Essential Media (-MEM; Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia), integrato con il 16% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di 200 mM L-glutammina e 1% di penicillina/streptomicina. Una volta che le cellule hanno raggiunto una confluenza dell'80% circa, le BM-MSC sono state ulteriormente sottocoltivate e piastrate in una 12- piastra a pozzetti a una densità di ~0,5 × 10 gradi per pozzetto e mantenute in coltura per 24-48 h per garantire l'attaccamento cellulare. Per preparare il supporto condizionato (CM) da BM-MSC, brevemente le cellule sono state lavate tre volte con 1 mL preriscaldato di 1 × HBSS. Dopo le fasi di lavaggio, 500 μL di siero e media basale delle cellule endoteliali privi di fattore di crescita (EBM; Il prodotto #CC-3121.Lonza, Hayward, CA, USA) è stato aggiunto alle cellule e mantenuto in coltura al 5% di CO, 37 gradi per altre 24 ore. Al termine di questo periodo di incubazione, CM è stato quindi raccolto e centrifugato a 400 × g per 10 minuti per rimuovere eventuali detriti cellulari. CM in aliquote da 500 μL è stato conservato a -80 gradi fino a un uso futuro.

2.3. Saggi funzionali

2.3.1. Trattamento delle EPC tardive coltivate

Una volta raccolte le EPC tardive, sono stati eseguiti i test funzionali. Tutti gli esperimenti sono stati condotti nei passaggi 3-6. Sono stati eseguiti saggi funzionali per studiare l'effetto di (i)25% di mezzi condizionati derivati ​​da BM-MSC(25% CM)[20];(ii)1 [RLX-1] o 10 [RLX-10 ]ng/mL [18] RLX (che rappresenta i livelli circolanti di relaxina H2 riscontrati nelle donne in gravidanza [21]); o(i) gli effetti combinati di 25% CM e 1 o 10 ng/mL RLX;(iv)20% FBS è stato utilizzato come controllo positivo sul potenziale di proliferazione e formazione di tubi (angiogenici) degli EPC tardivi derivati ​​​​da pazienti di controllo . I gruppi di trattamento sono stati confrontati con le cellule non trattate.

2.3.2. Saggio di fattibilità e proliferazione

La vitalità e il potenziale proliferativo degli ultimi EPC sono stati determinati utilizzando il {{0}}(4,5-dimeticiazol-2-yl)-2,5- dosaggio di difenil tetrazolio bromuro (MTT) secondo le istruzioni del produttore (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia). In breve, ~ 5 × 103 cellule per pozzetto sono state seminate in 96- piastre di pozzetti (BD Falcon, North Ryde, NSW, Australia), in seguito le cellule sono state trattate con CM, RLX (10 ng/) derivato da BM-MSC mL) o una combinazione di CM e RLXat 1 o 10 ng/mL per 24 h. Alla fine del periodo di incubazione, sono stati aggiunti 10 μL di reagente di etichettatura MTT (0,5 mg/mL, Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC, Australia) e incubati a 37 gradi C e 5% di CO2 per altre 4 ore. Le cellule sono state solubilizzate mediante l'aggiunta di 100 μL della soluzione di solubilizzazione (Sigma-Aldrich, Melbourne, VIC Australia) e il potenziale di proliferazione degli EPC tardivi è stato determinato misurando l'assorbanza di ciascun campione a 590 nm utilizzando una micropiastra lettore (Bio-strategy, Balwyn North, VIC, Australia) e analizzato con il software SoftMax Pro per Windows OS (Ver. 7.3, Molecular Devices LLC, CA, USA). Ciascuno dei gruppi di trattamento è stato eseguito e analizzato in sei repliche.

2.3.3. Saggio di formazione del tubo

Gli effetti dei vari trattamenti per promuovere il potenziale angiogenico delle ultime EPC, utilizzando un test di formazione di tubi sono stati determinati utilizzando il test di μ-angiogenesi (Abidi, Fitchburg, WI, USA). In breve, 10 μL di fattore di crescita ridotto （GFR） Matrigel （Prodotto n. 356231, Corning, Tewksbury, MA, USA） sono stati aggiunti nel pozzetto interno del μ-Slide del kit di analisi dell'angiogenesi (Abidi, Fitchburg, WI, USA ). Le colture confluenti delle ultime EPC sono state seminate sulle cellule rivestite e trattate con CM, RLX (10 ng/mL) derivato da BM-MSC o una combinazione di CM e RLX a 10 ng/mL. A ciascun pozzetto è stato applicato un volume totale di 50 μL di sospensione cellulare contenente ~ 1 × 104 cellule. Le immagini sono state immediatamente catturate ed etichettate come 0-punto temporale dell'ora. La capacità delle cellule sotto vari trattamenti di

sono stati osservati i tubi di forma e le immagini sono state acquisite a 2-24 h dopo la semina delle cellule utilizzando un microscopio ottico. Il numero di tubi, la lunghezza del tubo e il numero di punti di diramazione sono stati determinati utilizzando il software ImageJ.

2.3.4. Saggio di guarigione delle ferite

Gli effetti dei vari trattamenti sul potenziale rigenerativo delle EPC tardive sono stati determinati utilizzando un test di guarigione delle ferite. Per eseguire il test, ~ 1 × 10 cellule sono state sospese in 50 μL di terreno di crescita e seminate in 2 pozzetti di silicone in un piatto da 35 mm per il test di guarigione delle ferite (Abidi Inc., Fitchburg, WI, USA). Le ferite artificiali all'interno dei piatti sono state create rimuovendo delicatamente i pozzetti di silicone utilizzando una pinzetta sterile (distanza di spazio=500±100μm). I piatti sono stati reintegrati con 2 ml di EGM al 50%-2, con l'aggiunta di vari trattamenti inclusi CM-MSC derivati, RLX (10 ng/mL), o una combinazione di CM e RLX a 1 o 10 ng/mL. Il numero di cellule che sono migrate per chiudere la ferita è stato valutato mediante microscopia ottica. Fotomicrografie del le cellule migrate sono state catturate al 0-24 h dopo il trattamento. La percentuale dell'area di chiusura del gap è stata determinata utilizzando il software Image].

2.3.5.Analisi dell'immagine

Tutte le analisi delle immagini per i saggi funzionali sono state eseguite utilizzando ImageJ per MacOS (Ver. 1.8, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). Per il potenziale di formazione del tubo delle ultime EPC, le immagini sono state analizzate utilizzando il plug-in del test di angiogenesi e sono stati registrati quattro diversi parametri tra cui lunghezza totale, numero di maglie, numero di giunzioni e numero di rami. Per il test di guarigione della ferita, l'area di chiusura della ferita è stata analizzata marcando manualmente l'area priva di cellule in ciascuno dei punti temporali. Tutte le misurazioni sono state eseguite almeno 3 volte per controllare la variazione.

2.3.6. Immunofluorescenza

La localizzazione della proteina del recettore peptidico della famiglia Relaxin 1 (RXFP1; il recettore RLX affine) nelle EPC tardive coltivate è stata determinata utilizzando la colorazione con immunofluorescenza. In primo luogo, cellule di circa 1 × 1{{20}} gradi cresciute su un vetrino coprioggetto di vetro da 13 mm (rivestito con poli-D-lisina) in una 12-piastra a pozzetti sono state fissate in PFA al 4% per 15 min a temperatura ambiente. Le cellule fissate sono state bloccate per il legame proteico non specifico utilizzando l'1% di albumina di siero bovino (BSA) per 60 minuti a temperatura ambiente. Al termine del periodo di incubazione, le cellule sono state lavate in PBS per 5 minuti (3 volte) e incubate con un anticorpo policlonale RXFP1 di coniglio (aa 609-624; A 9227;1:2000; Immunodiagnostic AG, Bensheim, Germania )in 0,01 per cento BSA durante la notte a 4 gradi. Le cellule sono state lavate con PBS e incubate con anticorpo secondario di capra anti-coniglio Alexa-fluor 594 (1:500; Invitrogen, Scoresby, Victoria, Australia) in BSA allo 0,01% per 2 ore a temperatura ambiente. La colorazione di contrasto nucleare è stata eseguita aggiungendo 40 μL di DAPI nel mezzo di montaggio Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) e applicato su vetrino coprioggetto. La proteina immunoreattiva RXFP1 è stata visualizzata utilizzando un microscopio a fluorescenza con ingrandimento × 40 (Olympus BX51) e le immagini sono state unite utilizzando il software ImageJ.

2.4. Analisi statistiche

Tutti i dati vengono visualizzati come media ± SEM e tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism'M (Ver. 9; GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). È stato utilizzato un metodo ANOVA per confrontare l'effetto di vari trattamenti sulla proliferazione (test MTT) e sul potenziale angiogenico (test di formazione di tubi) degli EPC tardivi, seguito da un test post-hoc di Tukey per consentire confronti multipli tra i gruppi di trattamento. È stata utilizzata una misura ripetuta, a due vie, ANOVA per confrontare l'effetto dei vari trattamenti sulla chiusura della ferita da parte degli EPC tardivi nel tempo, seguita dal test post-hoc di Tukey per confrontare ciascuno dei gruppi di trattamento. Un p-value inferiore a 0.05 è stato considerato statisticamente significativo.