Parte 1: L'acteoside sopprime l'osteoclastogenesi mediata da RANKL inibendo l'induzione di C-Fos e il percorso NF-KB e attenuando la produzione di ROS
Mar 05, 2022
Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
Astratto
Numerosi studi hanno riportato che le citochine infiammatorie sono importanti mediatori per l'osteoclastogenesi, causando così un eccessivo riassorbimento osseo e l'osteoporosi.Acteoside da erba cistanche, il principale composto attivo della Rehmannia glutinosa, ampiamente utilizzato nella medicina tradizionale orientale, ha potenziali antinfiammatori e antiossidanti. In questo studio, l'abbiamo trovatoacteosidedifferenziazione e formazione degli osteoclasti marcatamente inibite dai macrofagi del midollo osseo (BMM) e dai macrofagi RAW264.7 stimolati dall'attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare-kappaB (NF-kB) (RANKL).Atteosidiil pretrattamento ha anche impedito il riassorbimento osseo da parte degli osteoclasti maturi in modo dose-dipendente. L'acteoside (10 mM) ha attenuato l'attivazione stimolata da RANKL della chinasi p38, delle chinasi regolate dal segnale extracellulare e della chinasi N-terminale c-Jun e ha anche soppresso l'attivazione di NF-kB inibendo la fosforilazione della subunità p65 e dell'inibitore kBa. Inoltre, aumenti mediati da RANKL nell'espressione di c-Fos e fattore nucleare dei linfociti T attivati, citoplasmatico 1 (NFATc1), e nella produzione del fattore di necrosi tumorale-a, interleuchina (IL)-1b , e IL-6 sono stati apparentemente inibiti dal pretrattamento con acteoside. Inoltre, oraleacteosideridotta perdita ossea indotta da ovariectomia e produzione di citochine infiammatorie per controllare i livelli. I nostri dati suggeriscono che l'acteoside inibisce la differenziazione e la maturazione degli osteoclasti dai precursori osteoclastici sopprimendo l'attivazione indotta da RANKL delle protein chinasi attivate dal mitogeno e dei fattori di trascrizione come NF-kB, c-Fos e NFATc1. Collettivamente, questi risultati suggeriscono che l'acteoside può agire come agente anti-riassorbimento per ridurre la perdita ossea bloccando l'attivazione degli osteoclasti.
introduzione
L'osso è costantemente rimodellato dall'equilibrata attività degli osteoclasti e degli osteoblasti [1]. Gli osteoclasti derivano da cellule precursori ematopoietiche del lignaggio monociti/macrofagi, mentre gli osteoblasti sono del lignaggio mesenchimale [2]. L'attivazione anormale degli osteoclasti o la ridotta osteoblastogenesi possono interrompere l'omeostasi ossea, causando infine malattie come l'osteoporosi, l'artrite e il cancro alle ossa [3,4]. L'osteoporosi è una malattia ossea comune che porta ad un aumentato rischio di frattura. La forma più comune di osteoporosi è causata dalla carenza di estrogeni nelle donne in menopausa. Anche i farmaci come i corticosteroidi e gli antiepilettici possono causare uno squilibrio tra il riassorbimento e la formazione dell'osso, che può provocare l'osteoporosi [5].
Per il trattamento dell'osteoporosi sono stati usati molti inibitori del riassorbimento, inclusi bisfosfonati, calcitonina, estrogeni e modulatori selettivi del recettore degli estrogeni. Questi inibitori mantengono la massa ossea inibendo la funzione degli osteoclasti [6]. La terapia sostitutiva con estrogeni è il trattamento più popolare per prevenire e curare l'osteoporosi postmenopausale. Tuttavia, la terapia sostitutiva con estrogeni a lungo termine può aumentare il rischio di tumori dell'endometrio e della mammella. Pertanto, molti ricercatori hanno concentrato i loro sforzi sullo sviluppo di un nuovo agente anti-riassorbimento che non abbia effetti collaterali [7-10]. Poiché gli osteoclasti funzionano nel riassorbimento osseo, l'inibizione specifica degli osteoclasti è stata considerata l'obiettivo principale in numerosi studi.
Gli osteoclasti sono cellule giganti multinucleate formate da progenitori mononucleati della famiglia dei monociti/macrofagi attraverso la proliferazione sequenziale, la differenziazione e la fusione di cellule precursori ematopoietiche [11]. Il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e l'attivatore del recettore del ligando del fattore nucleare (NF)-kB (RANK) (RANK) sono fattori essenziali per la differenziazione degli osteoclasti [12]. Inoltre, diverse citochine infiammatorie, come il fattore di necrosi tumorale (TNF) e l'interleuchina (IL)-1b, contribuiscono all'osteoclastogenesi modulando l'induzione di RANKL, osteoprotegerina e M-CSF [7,13]. Il legame di RANKL con il recettore RANK della superficie cellulare risulta in complessi di fattori associati RANKL/RANK/TNFR (TRAF) che attivano sequenzialmente NF-kB e proteine chinasi attivate da mitogeni (MAPK), inclusa la c-Jun N-terminal chinasi (JNK), p38 chinasi e chinasi correlata al segnale extracellulare (ERK) [14]. Questa attivazione gioca un ruolo chiave nel mediare la differenziazione, l'attivazione e la sopravvivenza degli osteoclasti. RANKL attiva anche l'espressione di fattori di trascrizione come un fattore nucleare di cellule T attivate, citoplasmatico 1 (NFATc1) e c-Fos, che sono essenziali per lo sviluppo degli osteoclasti [7,9]. Pertanto, la segnalazione RANKL è considerata l'obiettivo principale degli agenti anti-riassorbimento che sopprimono l'attivazione degli osteoclasti e la perdita ossea.
Atteosidiè il principale composto attivo della Rehmannia glutinosa, ampiamente utilizzato nella medicina tradizionale orientale [15,16]. L'acteoside è un potente antiossidante e ha attività antiepatotossiche, antinfiammatorie e anti-nocicettive [17-20]. In precedenza abbiamo scoperto che l'acteoside diminuisce l'attività della tirosinasi e la biosintesi della melanina regolando la segnalazione di ERK [21], protegge dal danno gengivale mediato da specie reattive dell'ossigeno (ROS) [22] e sopprime il danno cellulare mediato da micotossine [23]. Questi effetti sono strettamente correlati alla capacità dei nucleosidi di rimuovere i ROS e regolare la segnalazione mediata da MAPK. In particolare, i ROS sono suggeriti per mediare le vie di segnalazione indotte da RANKL e gli eventi cellulari negli osteoclasti. Il pretrattamento con antiossidanti ha inibito l'attivazione indotta da RANKL di NF-kB, ERK e IkBa, sopprimendo così l'osteoclastogenesi [24]. Questi risultati suggeriscono fortemente che, oltre all'attività antinfiammatoria, l'attività antiossidante è cruciale per un agente anti-riassorbimento, quindi l'acteoside può sopprimere l'osteoclastogenesi indotta da RANKL.
Nel presente studio, abbiamo esplorato se l'acteoside abbia un effetto terapeutico sulla perdita ossea. Abbiamo esaminato gli effetti dell'acteoside sulla differenziazione degli osteoclasti e sul riassorbimento osseo e i relativi meccanismi cellulari utilizzando sistemi sperimentali in vitro e in vivo.
Cistanche acteoside sopprime l'osteoclastogenesi indotta da RANKL
Materiali e metodi
Dichiarazione etica
Le pratiche di cura e utilizzo degli animali sono state approvate dal Comitato dell'Università Nazionale di Chonbuk sull'etica nella cura e nell'uso degli animali da laboratorio (permesso n. CBU 2010-0007). Tutti gli esperimenti in questo studio sono stati condotti secondo le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università.
Topi, prodotti chimici e articoli di laboratorio
Topi ICR femmine di quattro settimane sono stati acquistati da Orient Bio Inc. (Seoul, Corea) e alloggiati a 2261uC e 5565% di umidità su un ciclo luce/buio di 12 ore con libero accesso a cibo e acqua. L'acteoside (3,4-diidrossi-bfenetil-Oa-rhamnopyranosyl-(1R3)-4-O-caffeoyl-bD-glucopiranoside; C29H36O15) (Fig. S1) è stato isolato dalle foglie di Rehmannia glutinosa. L'acteoside è stato sciolto in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) prima dell'uso. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL{26}} e M-CSF sono stati acquistati da R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anticorpi specifici per c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa e b-actina sono stati ottenuti da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA ). Gli anticorpi per p-p38 e p38 sono stati acquistati da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). I kit EIA per il test del calcio e l'osteocalcina (OC) sono stati acquistati rispettivamente da BioAssay Systems (Hayward, CA, USA) e Biomedical Technologies (Stoughton, MA, USA) per determinare i parametri biochimici del siero. Per misurare il livello sierico di TRAP5b è stato utilizzato anche il kit di test della fosfatasi acida (TRAP) resistente al tartrato di topo (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA). Se non diversamente specificato, le sostanze chimiche aggiuntive sono state ottenute da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) e gli articoli di laboratorio da SPL Life Sciences (Pochun, Corea del Sud).
Colture cellulari
Le cellule del midollo osseo sono state ottenute dalle tibie e dai femori di topi ICR femmine di 6 settimane di età secondo i metodi descritti in precedenza [25]. La sospensione di midollo osseo è stata incubata in un piatto di coltura di 100- mm in presenza di 50 ng/ml di M-CSF. Dopo 3 giorni, le cellule aderenti sono state utilizzate come macrofagi del midollo osseo (BMM) per indurre la differenziazione osteoclastica. Alcune cellule del midollo osseo sono state anche incubate per 48 ore senza M-CSF e le cellule aderenti sono state coltivate in un mezzo di differenziazione degli osteoblasti, come descritto altrove [25]. Le cellule dei macrofagi RAW264.7 sono state coltivate nel mezzo di Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 2 mM di L-glutamina e antibiotici. Queste cellule sono state utilizzate come linea cellulare controparte per i BMM per esplorare l'effetto dell'acteoside sull'osteoclastogenesi.
Differenziazione osteoclastica e colorazione TRAP
I BMM sono stati pretrattati con varie concentrazioni ({0}}–50 mM) diacteosideper 2 h prima di stimolare con 100 ng/ml RANKL. I terreni di coltura sono stati sostituiti con terreni freschi nei giorni 2 e 5. Dopo 7 giorni di incubazione, le colture sono state fissate in paraformaldeide tamponata con PBS al 4% e colorate con TRAP utilizzando un kit Sigma Aldrich secondo le istruzioni del produttore. Le cellule TRAP-positive sono state contate utilizzando la microscopia ottica e le cellule contenenti 3 o più nuclei sono state considerate osteoclasti. Le cellule RAW 264.7 sono state anche esposte a 100 ng/ml di RANKL dopo il pretrattamento con acteoside per 2 ore e, dopo 7 giorni di incubazione, le cellule sono state processate per la colorazione TRAP.
Misurazione della vitalità cellulare
La vitalità cellulare è stata determinata utilizzando il reagente di sale di tetrazolio solubile in acqua (WST)-8. In breve, le cellule BMM o RAW264.7 coltivate in un mezzo di crescita contenente il 10% di FBS e antibiotici sono state trattate con acteoside 10 mM o un composto fenolico come quercetina, luteolina, apigenina o epigallocatechina-3-gallato (EGCG). Il reagente WST-8 è stato aggiunto alle colture dopo 48 h di incubazione. Dopo l'incubazione per altre 4 ore, l'assorbanza specifica WST{10}} è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, USA).
Saggio di riassorbimento osseo
I BMM (16105 cellule/ml) sono stati sospesi in a-MEM contenente 50 ng/ml di M-CSF e 100 ng/ml di RANKL, quindi divisi in una 24-piastra a pozzetti ricoperta di nanocristalli di fosfato di calcio (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Corea del Sud) a una densità di 26104 cellule/cm2 con e senza acteoside. Dopo incubazione per 7 giorni, le cellule sono state rimosse dalle piastre con ipoclorito di sodio al 5% e al microscopio ottico è stata osservata la formazione di fossette. L'area riassorbita è stata anche misurata da un analizzatore di immagini ed espressa come percentuale del valore di controllo.
Analisi Western Blot
I lisati proteici interi sono stati preparati in un tampone di lisi come descritto altrove [26]. Le proteine citosoliche e nucleari sono state preparate come descritto in precedenza [25]. Uguali quantità di estratto proteico sono state separate dal 12-15% di SDS-PAGE e asciugate su membrane di polivinil difluoruro. Le macchie sono state sondate con anticorpi primari durante la notte a 4uC prima dell'incubazione con l'anticorpo secondario nel tampone bloccante per 1 ora. Le macchie erano
sviluppato con chemiluminescenza potenziata (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, Regno Unito) ed esposto a pellicola a raggi X (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, USA).
Saggio di attività MAPK
Le cellule sono state pretrattate conacteosideper 2 ore e poi stimolato con RANKL per altri-30 min. Le attività MAPK sono state determinate utilizzando kit di test immunometrici, come il kit di test della chinasi p-p38 (Assay Designs, Inc., MI, USA), il kit di test enzimatico p-ERK (Assay Designs) e il kit ELISA sandwich p-SAPK/JNK (Tecnologia di segnalazione cellulare, MA, USA). Tutte le procedure hanno seguito le istruzioni del produttore e l'assorbanza è stata misurata da un lettore di micropiastre.
Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA)
Le reazioni di legame alle proteine del DNA sono state eseguite per 30 minuti a temperatura ambiente, con 10-15 mg di proteine in 20 ml di tampone contenente 1 mg/ml di BSA, 0,5 mg/ml di poli (dI-dC), 5% di glicerolo , 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 30,{18}} cpm di [a-32P] oligonucleotidi marcati con dCTP e il frammento di Klenow di DNA polimerasi. I campioni sono stati separati su gel di poliacrilammide al 6%, che sono stati essiccati ed esposti a pellicola a raggi X (Eastman Kodak Co.) per 12-24 ore a 270 uC. Le sequenze di primer oligonucleotidici specifiche per NF-kB erano 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 e 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.
Saggio della luciferasi NF-kB
I macrofagi RAW264.7 in 24-piastre a pozzetti sono stati trasfettati con 0.8 mg di vettore reporter kB-luciferasi utilizzando 2 ml di Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. A 24 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state stimolate con RANKL in presenza e assenza di acteoside per 24 ore. Le cellule sono state risospese in 100 ml di tampone di lisi reporter
(Promega, Madison, WI, USA). Uguali quantità di campioni proteici sono state collocate in 96-micropiastre a pozzetti e miscelate con il substrato della luciferasi. La luminescenza è stata misurata utilizzando un luminometro a micropiastre (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germania). In questo esperimento, un peptide inibitore NF-kB permeabile (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) è stato utilizzato come inibitore kB positivo.
Misurazione delle citochine
Le cellule BMM o RAW264.7 sono state stimolate con RANKL in presenza di acteoside in 24-piastre di coltura di pozzetti. Dopo 48 h di incubazione, i supernatanti di coltura sono stati raccolti e valutati mediante ELISA utilizzando kit OptEIATM specifici per TNF-a-, IL{6}}b- e IL{8}} secondo le istruzioni del produttore.
Reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa in tempo reale (RT-PCR)
L'espressione dell'mRNA di marcatori osteoclastici, come c-Fos, NFATc1 e TNF-a, è stata determinata mediante RT-PCR in tempo reale. In breve, l'RNA totale è stato estratto dai macrofagi con il reagente Trizol secondo le istruzioni del produttore (Invitrogen). Il cDNA è stato sintetizzato con 1 mg di RNA totale utilizzando SuperScript Reverse Transcriptase II e primer (Invitrogen). Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) è stato utilizzato per rilevare l'accumulo di prodotto PCR durante il ciclo con il sistema di rilevamento della sequenza ABI 7500 (Applied Biosystems). Dopo la denaturazione a 95uC per 10 minuti, la PCR è stata
eseguita utilizzando quaranta 3-cicli di denaturazione a 95 uC per 15 sec, ricottura a 60 uC per 1 sec ed estensione a 72 uC per 30 sec. Tutte le reazioni PCR sono state eseguite almeno in triplicato e i livelli di espressione sono stati normalizzati al gene housekeeping HPRT nella stessa reazione. Questo studio ha utilizzato le stesse sequenze di primer descritte altrove [7].
Misurazione dei ROS intracellulari
Una soluzione madre di 29,{1}}diclorodiidrofluoresceina-diacetato (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Germania) è stata preparata in DMSO e conservata a 220 uC al buio. In breve, le BMM (106 cellule/ml in 6-piastre a pozzetti) sono state coltivate con 50 ng/ml di M-CSF per 24 ore e quindi trattate con varie concentrazioni (0-10 mM) diacteoside2 h prima della stimolazione con 100 ng/ml RANKL. Dopo 1 ora di co-incubazione, queste cellule sono state successivamente incubate con DCFH-DA 25 mM per 30 minuti. La fluorescenza verde di 29,{8}}diclorofluoresceina (DCF) è stata registrata a 515 nm (FL 1) utilizzando un sistema FACS VantageH (Becton-Dickinson, San Jose, CA, USA) e 10,000 gli eventi sono stati contati per campione.
Induzione dell'osteoporosi indotta da ovariectomia
Per questo studio sono stati utilizzati topi ICR femmine (di 6 settimane). I topi hanno ricevuto un'operazione simulata (Sham, n =10) o un'ovariectomizzazione chirurgica (OVX, n=20) in anestesia. Una settimana dopo l'intervento chirurgico, i topi OVX sono stati divisi casualmente in 2 gruppi di 10 topi ciascuno: OVX bilaterale e OVX bilaterale integrati con 200 ml
PBS contenente 1 mM di acteoside per via orale (gruppo AC). L'acteoside orale è stato somministrato una volta ogni 3 giorni per 8 settimane dopo l'intervento chirurgico e
la stessa quantità di PBS è stata somministrata ai gruppi Sham e OVX. Dopo 1 giorno dall'ultima somministrazione, i topi sono stati sacrificati e quindi sono stati analizzati i parametri biochimici nel siero e la 3-struttura ossea dimensionale.
Determinazione dei parametri biochimici sierici
I campioni di sangue sono stati raccolti tramite puntura cardiaca e il siero è stato raccolto mediante centrifugazione. I campioni di siero sono stati conservati a 280 uC per l'analisi dei parametri biochimici. I livelli sierici di IL-1b e IL-6 sono stati stimati utilizzando il kit ELISA come descritto sopra, mentre l'attività della fosfatasi alcalina (ALP) è stata determinata utilizzando un test colorimetrico biochimico che misura la quantità di p -nitrofenolo prodotto da un substrato di p-nitrofenolo fosfato, come descritto altrove [27]. Per stimare i biomarcatori della formazione e del riassorbimento osseo, sono stati determinati anche i livelli sierici di OC, calcio e TRAP5b secondo le istruzioni dei produttori.
Analisi della struttura ossea e dei parametri morfometrici
I femori dei topi (gruppi Sham, OVX e AC) sono stati sezionati e riempiti con soluzione fisiologica per test meccanici. La resistenza meccanica del femore è stata misurata come descritto altrove [28]. Il carico di frattura è stato registrato come la forza di picco in Newton nel punto in cui l'asta mediana del femore destro si frattura. Inoltre, il femore leggero di ciascun animale è stato analizzato istomorfometricamente utilizzando un sistema di tomografia microcomputerizzata (micro-CT) (sistema a raggi X microfocus SkyScan 1076, Kontich, Belgio). In breve, le ossa nel deposito di formaldeide al 4% sono state asciugate superficialmente su carta velina prima di essere avvolte in una "pellicola trasparente" di plastica o in parafilm, per evitare che si secchi durante la scansione. Ciascun osso avvolto in plastica è stato posto in tubi di plastica/polistirene espanso che sono stati montati verticalmente orizzontalmente nella camera del campione dello scanner 1076 per
imaging micro-TC. La scansione è stata eseguita utilizzando una tensione della sorgente di 100 kV e una corrente della sorgente di 140 mA con una risoluzione di 35 mm.
I modelli tridimensionali delle ossa trabecolari del femore sono stati ricostruiti utilizzando SkyScan CT Analyzer versione 1.11. I parametri strutturali come densità minerale ossea trabecolare (BMD, g/cm3), percentuale di volume osseo (volume osseo (BV)/volume tissutale (TV), percentuale ), spessore (Tb.Th, mm), separazione (Tb.Sp , mm) e il numero (Tb.N, 1/mm) sono stati quindi misurati.
Saggio di differenziazione e mineralizzazione osteogenica Le cellule del midollo osseo coltivate in piastre di coltura di {{{{10}}}} sono state trattate con DAG (desametasone 10 nM, acido ascorbico 50 mM e b-glicerofosfato 20 mM) nel presenza di 10 mM acteoside. Dopo 2 settimane di differenziazione, le cellule sono state fissate con etanolo ghiacciato al 70% (vol/vol) per 1 ora e colorate con 0,2% di rosso di alizarina S in acqua distillata per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo che le cellule sono state decolorate e asciugate all'aria, le piastre di coltura cellulare sono state valutate al microscopio ottico utilizzando un microscopio invertito (Nikon TS100, Giappone). Per quantificare la quantità di colorante rosso, il colorante è stato eluito con il 10% di acetil piridinio cloruro agitando per 20 minuti e l'assorbanza è stata misurata a 560 nm. La quantità di calcio depositata negli strati cellulari è stata anche misurata utilizzando un kit di calcio C (Wako Chemical Inc. Osaka, Giappone) secondo le istruzioni del produttore. Inoltre, l'espressione di marcatori di mRNA specifici dell'osso, come il fattore di trascrizione correlato a runt-2 (Runx2), osterix, sialoproteina ossea (BSP) e OC è stata determinata mediante RT-PCR in tempo reale. I primer oligonucleotidici di questi marcatori sono stati progettati con dimensioni del prodotto inferiori a 200 bp utilizzando Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems) come descritto altrove [27].
cistanche acteoside aumenta la formazione ossea
Risultati
L'acteoside inibisce la formazione di osteoclasti da parte dei macrofagi in modo dose-dipendente
Per verificare l'effetto dell'acteoside sulla differenziazione del BMM in osteoclasti, le cellule sono state coltivate con varie concentrazioni ({0}}– 20 mM) di acteoside per 7 giorni in presenza di 50 ng/ml di M-CSF e 100 ng/ml RANKL. Acteoside ha ridotto il numero di osteoclasti in modo dose-dipendente. Quando le cellule sono state pretrattate con acteoside 10 mM per 2 ore, il numero di osteoclasti è diminuito del 43 percento rispetto alle cellule integrate con M-CSF e RANKL (Fig. 1A). La Fig. 1B mostra la differenziazione degli osteoclasti mediata da RANKL e la sua inibizione mediante il trattamento combinato con acteoside. Coerentemente con questo risultato, il pretrattamento con acteoside ha ridotto la differenziazione stimolata da RANKL delle cellule RAW264.7 e la formazione di osteoclasti (Figg. 1C e D). Quando il potenziale antiosteoclastico dell'acteoside sui BMM è stato confrontato con il potenziale antiosteoclastico di diversi composti fenolici alla stessa concentrazione (10 mM), la luteolina ha mostrato l'attività più alta (Fig. 2A). Tuttavia, la luteolina, la quercetina o l'apigenina stessa hanno ridotto la vitalità delle cellule (Fig. 2B). Tutti i composti hanno inibito la differenziazione osteoclastica da parte dei macrofagi RAW264.7 con le seguenti attività relative: luteolina. quercetina=apigenina .
Cistanche acteoside inibisce osteoclasti
