Parte 1: L'effetto dell'ascite anti-maligno dei diterpenoidi totali da Euphorbiae Ebracteolatae Radix è attribuibile alle alterazioni delle acquaporine tramite l'inibizione dell'attività PKC nel rene
May 18, 2022
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Astratto: Questo studio ha valutato l'effetto anti-ascite dei diterpenoidi totali estratti da Euphorbiae ebracteolate Radix (TDEE) su topi ascitici maligni e ne ha chiarito il meccanismo sottostante. Il TDEE è stato estratto con diclorometano e sottoposto a cromatografia su colonna. La purezza di sei diterpenoidi isolati da TDEE è stata determinata essere del 77,18 percento mediante HPLC. TDEE (3 e 0,6 g di erbe crude/kg, po) ha ridotto l'ascite e aumentato la produzione di urina. Nel frattempo, l'analisi della vitalità, del ciclo e dell'apoptosi delle cellule tumorali ha indicato che il TDEE non avevaantitumoraleattività. Inoltre, i livelli di espressione delle acquaporine (AQP) e i livelli di traslocazione di membrana della protein chinasi C (PKC) e PKC inrenie le cellule sono state misurate. Il TDEE ha ridotto i livelli di AQP1-4 e ha inibito l'espressione di PKC nella frazione di membrana. Quattro diterpenoidi principali, ad eccezione del composto 2, hanno ridotto i livelli di AQP1 nelle cellule renali umane-2. I composti 4 e 5 hanno inibito l'espressione di AQP2-4 nelle cellule del dotto collettore midollare interno murino. L'inibizione dell'espressione di AQP1-4 indotta da diterpenoidi è stata bloccata dal forbol{9}}miristato{10}}acetato (PMA; agonista della PKC). I diterpenoidi del TDEE sono i principali componenti anti-ascite. L'effetto anti-ascite dei diterpenoidi può essere associato ad alterazioni degli AOP nei reni per promuovere la diuresi. L'inibizione dell'espressione AOP1-4 da parte di TDEE è correlata all'inibizione dell'attivazione della PKC.
Parole chiave: Euphorbia ebracteolate Hayata; diuresi; componenti bioattivi; terpenoidi; cellule renali; inibitore della PKC
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1. Introduzione
Euphorbia ebracteolate Hayata (EEH) è un membro del genere Euphorbia nella famiglia Euphorbiaceae ed è ampiamente utilizzato nel trattamento della distensione addominale e dell'edema, infezioni parassitarie, tubercolosi e altre malattie nella medicina tradizionale cinese (MTC)[1]. La radice di EEH (EER) contiene vari terpenoidi, che sono considerati componenti efficaci. Recenti studi sui terpenoidi sono stati condotti per determinarneantinfiammatorio, antivirale,antitubercolare e altri effetti in vitro [2-5]. Tuttavia, le ricerche di base sugli effetti tradizionali dell'EER nel trattamento della distensione addominale e dell'edema sono limitate. Secondo la teoria della MTC, l'EER può eliminare rapidamente la distensione e l'edema addominale favorendo la minzione e la diarrea [6]. I nostri studi precedenti hanno dimostrato che i diterpenoidi totali da EER (TDEE) possono causare diarrea regolando l'espressione di acquaporina (AQP)-1 e AQP3 [7]. Tuttavia, ad oggi, le sostanze efficaci degli anti-ascite nell'EER rimangono poco chiare.
La distensione e l'edema addominale sono descritti come ascite nella medicina moderna. L'ascite è un accumulo patologico di liquido peritoneale [8]. Ci sono molte cause di formazione di ascite, come cirrosi, tumore, insufficienza cardiaca e sindrome nefrosica [9]. L'insorgenza di ascite è correlata all'ipertensione portale, che porta a vasodilatazione arteriosa splancnica, riduzione del volume circolante effettivo, attivazione di sistemi vasocostrittori endogeni e ritenzione idrica avida nei reni [10]. Gli AQP sono trasportatori rapidi di membrana dell'acqua per l'attraversamento delle barriere epiteliali ed endoteliali e svolgono quindi un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'equilibrio idrico [11]. Numerosi studi hanno dimostrato che gli AQP svolgono un ruolo chiave nella formazione e nel disturbo dell'ascite [12-15]. Ci sono molti tipi di AQP nei reni, come AQP1, AQP2, AQP3 e AQP4[16]. Poiché il TDEE può regolare l'espressione degli AQP nell'intestino [7], proponiamo che il TDEE possa essere utilizzato nel trattamento dell'ascite regolando gli AQP nei reni.
Gli AQP svolgono un ruolo critico nella formazione delle urine, tuttavia, i meccanismi di regolazione dell'espressione degli AQP nei reni non sono stati chiariti. Attualmente, solo un numero limitato di rapporti indica che gli AQP sono regolati attraverso i percorsi della proteina chinasi C(PKC) e della proteina chinasi A(PKA) [17-20]. Alcuni terpenoidi isolati dall'euforbia (p. es., uphold e ingenol 3-angelate) hanno effetti regolatori sulla PKC. TDEE può regolare l'espressione di AQP nei reni attraverso la via PKC.
In questo studio, abbiamo estratto TDEE e valutato il suo effetto anti-ascite, nonché l'espressione analizzata di AQP, PKC e PKA nei reni di topi ascitici. Quindi, abbiamo isolato e purificato i principali diterpenoidi dal TDEE per studiarne gli effetti sulla proteina AQP e sui livelli di espressione dell'mRNA in due tipi dicellule renali(cellule renali umane-2 (HK-2) e cellule del dotto collettore midollare interno murino (mIMCD3)). Infine, scegliamo un composto diterpenoide (eufebracteolatina A), utilizzando forbol-12-miristato-13-acetato (PMA; agonista di PKC) per attivare la via PKC, per identificare se l'espressione di AQP nei reni è regolata per via PKC. Questo studio mirava a determinare l'effetto anti-ascite del TDEE nell'EER e fornire una base per l'applicazione clinica dell'EER e l'identificazione di farmaci candidati per la diuresi e gli effetti anti-ascitici.
2. Risultati
2.1. Effetti del TDEE sul peso del liquido ascitico, sul peso delle urine e sul contenuto di acqua fecale
Il trattamento di topi ascitici con estratto totale di EER (TEER) e TDEE (3 e 0.6 g di erbe crude/kg, po) e furosemide (farmaco positivo) ha ridotto significativamente l'aumento del peso del liquido ascitico rispetto al modello gruppo (Figura 1A). La Figura 1C ha mostrato che l'urina pesa in modo significativo (p<0.05, compared="" to="" the="" model="" group)increased="" in="" ascitic="" mice="" pretreated="" with="" teer,="" tdee,="" and="" furosemide.="" in="" addition,="" in="" the="" teer="" and="" tdee="" groups="" at="" a="" dose="" of="" 3="" g="" raw="" herbs/kg,="" a="" significant="" increase="" in="" fecal="" water="" content="" was="" observed="" compared="" with="" the="" model="" group="" (figure="" 1d).="" however,="" the="" non-diterpenoid="" fraction="" of="" eer(ntdee)="" groups="" showed="" no="" significant="" influence="" on="" ascites="" weight,="" urine="" weight,="" and="" fecal="" water="" content="" compared="" to="" the="" model="">
2.2. Effetti del TDEE sui livelli di albumina sierica nei topi ascitici
L'albumina sierica è la proteina più abbondante nel plasma dei vertebrati e può mantenere la pressione osmotica del sangue e regolare il trasporto dell'acqua. La Figura 1B ha mostrato che la produzione di ascite nei topi modello ha causato una significativa diminuzione dell'albumina sierica rispetto al gruppo normale. Dopo il trattamento con furosemide, TEER e TDEE(3 e 0.6 g di erbe crude/kg, po), i livelli di albumina sierica sono stati effettivamente recuperati rispetto al gruppo modello. Nessun miglioramento in questo indice è stato osservato nei gruppi NTDEE.
2.3. Effetti del TDEE sulla vitalità, sul ciclo e sull'apoptosi delle cellule tumorali nei topi ascitici
Nell'ascite maligna, le cellule tumorali galleggiano nel liquido ascitico. Abbiamo valutato se la riduzione dell'ascite è correlata all'attività antitumorale del TEER e del TDEE. I risultati hanno mostrato che questi farmaci non hanno inibito la vitalità delle cellule tumorali (Figura 2A) e non hanno portato all'arresto del ciclo cellulare (Figura 2B) e all'apoptosi (Figura 2C, D).
2.4. Effetti del TDEE sull'espressione di AQP nei reni dei topi ascitici
Il rene è un organo importante per il riassorbimento dell'acqua e la concentrazione urinaria. I canali dell'acqua AQP mediano il rapido trasporto di acqua nei reni. Pertanto, abbiamo esaminato l'espressione di AQP nei reni. La figura 3 ha mostrato che il potenziamento dell'ascite ha avuto scarso effetto sull'espressione dell'AQP nei reni rispetto al gruppo normale. Quando trattata con TEER e TDEE, l'espressione delle proteine AQP1, AQP2, AQP3 e AQP4 era notevolmente inferiore rispetto al gruppo modello alla maggior parte delle dosi. TEER ha determinato una diminuzione significativa dell'espressione di AQP2, AQP3 e AQP4 a dosi di 3.0 e {{10}}.6 g di erbe crude/kg, mentre l'espressione di AQP1 è stata ridotta solo a un basso dosaggio (0,6 g erbe crude/kg). In particolare, TDEE ha avuto gli stessi effetti inibitori sull'espressione di AQP3 e AQP4 di TEER a due dosi. La differenza tra TDEE e TEER è che il TDEE ha inibito l'espressione di AQP1 e AQP2 solo a dosi elevate (3 g di erbe crude/kg). NTDEE ha avuto effetti deboli sui livelli di AQP nei reni e ha regolato l'espressione della proteina AQP4 solo a una dose di 3 g di erbe aromatiche crude/kg.
2.5. Effetti del TDEE sull'attivazione di PKC e PKA nei reni dei topi ascitici
Studi precedenti hanno indicato che l'espressione di AQP potrebbe essere regolata dall'attivazione di PKC e PKA. Abbiamo esaminato gli effetti del TDEE sull'attivazione di PKC-a, PKC- e PKA. L'attivazione della PKC è stata misurata dalla sua traslocazione dal citosol alla membrana cellulare. Come mostrato nelle Figure 4A e B, il livello di espressione proteica di PKC- nella frazione di membrana era significativamente ridotto nei gruppi TDEE, mentre non vi era alcun effetto significativo sul livello di espressione della proteina di membrana PKC. La fosfolipasi C(PLC) è un'importante molecola di segnalazione a monte che media l'attivazione del trattamento PKC.TDEE non ha avuto alcun effetto sui livelli di PLC fosforilato e totale (Figura 4D). Il PKA è un eterotetramero costituito da due subunità catalitiche legate a due subunità regolatorie. Il rilascio di subunità catalitiche è un segno distintivo dell'attivazione della PKA. Nella Figura 4C, TDEE non ha influenzato l'espressione delle subunità catalitiche PKA.
2.6. Determinazione del contenuto di sei diterpenoidi nel TDEE mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)
I risultati degli esperimenti sugli animali hanno mostrato che il TDEE era la principale frazione efficace di EER. Abbiamo isolato sei diterpenoidi (le strutture dei composti da 1 a 6 sono mostrate nella Figura 5; i dati spettrali sono stati aggiunti al materiale supplementare) dal TDEE e abbiamo utilizzato questi composti come standard per determinare il contenuto di diterpenoidi nel TDEE. I cromatogrammi HPLC per TDEE e i sei standard diterpenoidi sono presentati nella Figura 6. Il contenuto dei composti da 1 a 6 era 1,07 percento, 12.00 percento, 12,69 percento, 9,15 percento, 39,26 percento e 3,02 percento, rispettivamente, che rappresentano per il 77,18 per cento del TDEE.
2.7. Effetti dei diterpenoidi da TDEE sull'espressione di AQP nelle cellule renali
TDEE era la frazione attiva di EER che inibiva l'ascite riducendo l'espressione di AQP1, AQP2, AQP3 e AQP4 nei reni. Allo stesso tempo, il TDEE ha anche ridotto significativamente l'espressione di proteine e mRNA di AQP1, AQP2, AQP3 e AQP4 nelle cellule renali umane-2 (HK-2) e nelle cellule del dotto collettore midollare interno murino (mIMCD3) (Figura 7). I componenti principali del TDEE sono i diterpenoidi. Abbiamo confrontato gli effetti tra TDEE e miscela di diterpenoidi (sei diterpenoidi isolati sono stati miscelati in base al loro contenuto in TDEE). I risultati hanno mostrato che gli effetti inibitori della miscela di diterpenoidi e del TDEE sull'espressione di AQP1, AQP2, AQP3 e AQP4 erano simili (Figura 7). Le attività di quattro principali diterpenoidi da TDEE sono state valutate in vitro. Le figure 8 e 9 hanno mostrato che i livelli di espressione di proteine e mRNA di AQP1 nelle cellule HK-2 erano significativamente ridotti dai composti 3,4 e 5. Il trattamento con il composto 2 non ha indotto una notevole diminuzione dell'AOP1 a livello della proteina e dell'mRNA livelli. Per questi composti, il composto 3 (un diterpenoide di tipo ent-abietano) era più attivo degli altri composti. Nelle cellule mlMCD3, quattro composti diterpenoidi hanno indotto diversi gradi di inibizione dell'espressione di AQP2, AQP3 e AQP4. I risultati della proteina e dell'espressione genica sono presentati nelle Figure 8 e 9. I composti 4 e 5 possedevano potenti effetti inibitori di AQP2, AQP3 e AQP4 rispetto al gruppo di controllo a livello di gene e proteina. I composti 2 e 3 hanno mostrato effetti diversi solo sull'espressione dell'mRNA di Aqp2, Aqp3 e Aqp4.
2.8. Effetti dell'attivatore di PKC sull'inibizione di AQP indotta da diterpenoidi
I risultati dell'esperimento sugli animali hanno indicato che il TDEE ha inibito contemporaneamente l'attività PKC e l'espressione di AQP nei reni di topi portatori di cellule tumorali H22. Per chiarire ulteriormente se la PKC regolasse l'espressione di AQP nelle cellule renali, l'agonista PKC (PMA) è stato pretrattato nelle cellule HK-2 e mIMCD3 a 1,5 ore prima della stimolazione del diterpenoide (Euphebracteolatin A). È stato rilevato il cambiamento dell'espressione di membrana PKC, AOP1, AOP2, AOP3 e AOP4. I risultati di Western Bolt hanno mostrato che l'eufebracteolatina A potrebbe ridurre l'espressione proteica della membrana PKC, AOP1, AOP2, AOP3 e AOP4 e gli effetti potrebbero essere attenuati dal pretrattamento con PMA (Figura 10).
