Parte 1: Il cistanoside di Cistanche Herba migliora il danno riproduttivo maschile indotto dall'ipossia attraverso la soppressione dello stress ossidativo

Maggiori informazioni contattare: Tinatina.xiang@wecistanche.com

Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, He Wang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1

1Dipartimento di Urologia, Ospedale Tang Du, Quarta Università di Medicina Militare, Xi'an 710038, Shaanxi, Cina;

2Ospedale di Urologia e Nefrologia, Ospedale del Popolo di Xi'an, Xian 710100, Shaanxi, Cina;

3Institute of Basic Medical Science, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi, Cina;

4Dipartimento di Radioterapia, Ospedale Tang Du, Quarta Università di Medicina Militare, Xi'an 710038, Shaanxi, Cina. *Contribuenti uguali. Ricevuto il 1 settembre 2020;

Accettato il 18 gennaio 2021; Epub 15 maggio 2021; Pubblicato il 30 maggio 2021

Astratto: Prove crescenti dimostrano che l'ipossia è una causa diinfertilità maschile, e l'ipossia può essere correlata alo stress ossidativo(OS). Il cistanoside (Cis) è un composto glicoside feniletanoide da cui può essere estrattoCstanches Herbae possiede diverse funzioni biologiche. Questo studio mirava a studiare gli effetti protettivi del Cis sul danno riproduttivo indotto dall'ipossia ed esplorare i meccanismi sottostanti specifici. Sono stati costruiti modelli sperimentali di ipossia cellulare e animale e sono stati valutati gli effetti protettivi di diversi sottotipi di Cis sul sistema riproduttivo maschile sia in vitro che in vivo. I risultati hanno indicato che l'ipossia ha ridotto significativamente la vitalità delle cellule GC-1 attraverso l'arresto del ciclo cellulare e l'attivazione dell'apoptosi, che erano associati a un aumento della OS. Inoltre, Cis ha mostrato forti effetti antiossidanti sia in vitro che in vivo, ripristinando significativamente le attività enzimatiche antiossidanti e sottoregolando i livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS), aumentando la vitalità cellulare e diminuendo l'apoptosi. È importante sottolineare che i sottotipi Cis (Cis-A. Cis-B, Cis-C e Cis-H) qui studiati hanno mostrato tutti alcuni effetti antiossidanti, tra i quali gli effetti di Cis-B erano i più significativi. Questo studio dimostra che Cis attenua notevolmente gli effetti dannosi dell'OS indotta dall'ipossia influenzando le attività degli enzimi antiossidanti nei testicoli e nelle cellule GC-1.

Parole chiave: Cistanoside, ipossia ipobarica, infertilità maschile, stress ossidativo, protezione riproduttiva

introduzione

Attualmente, circa 48,5 milioni (15%) di coppie in età riproduttiva nel mondo sono affette da infertilità [1], di cui il 40-50 percento dei casi è attribuito ainfertilità maschile[2], una condizione fortemente associata a fattori ambientali e di stile di vita. L'evidenza suggerisce che la suscettibilità del testicolo dei mammiferi alla bassa pressione dell'ossigeno è un fattore causale di alcune forme diinfertilità maschile[3]. Come dimostrato in studi precedenti, la spermatogenesi è compromessa e ridotta dopo l'esposizione aipossia ipobarica [4-7].

Per esplorare il meccanismo sottostante, gli studi hanno dimostrato che l'esposizione aipossia ipobaricaaumenta le specie reattive dell'ossigeno (ROS) pro-

duzione [8, 9].ROS svolge un ruolo importante nel sistema riproduttivo maschile. A bassi livelli, sono necessari per la capacità degli spermatozoi, la reazione acrosomiale e la fusione degli spermatozoi-0[10]. Tuttavia, un ROS eccessivo può indurre danni al DNA nucleare/mitocondriale dello sperma e alla membrana plasmaticadanno perossidativo, che a loro volta sono i principali fattori eziologici per l'aumento del rischio di infertilità maschile [11,12]. Pertanto, l'accumulo di ROS indotto dall'ipossia potrebbe essere una delle cause dell'infertilità maschile.

Cstanches Herba, pianta medicinale parassitaria perenne, è ampiamente distribuita nelle zone aride [13]e ampiamente utilizzata per le sue attività farmacologiche [14-17]. Tra tutti i contenuti efficaci diCstanches Herba, i PhG sono stati considerati il ​​principale componente attivo. Ad oggi, 34 PhG sono stati isolati dalle piante di Cistanches [13]. Il cistanoside (Cis), un PhG attivo isolato da Cistanches Herba, ha ricevuto attenzione per i suoi effetti antiossidanti.

Considerando gli effetti antiossidanti del Cis e il ruolo dei ROS nell'ipossia indottainfertilità maschile, Cis è considerato un potenziale farmaco candidato per il trattamento dell'ipossia indottainfertilità maschile. Tuttavia, pochi rapporti hanno affrontato gli effetti antiossidanti del Cis estratto da Cistanches Herba nel trattamento dell'ipossia indottainfertilità maschileo le vie di segnalazione coinvolte. In questo studio sono stati costruiti modelli sperimentali di ipossia in vitro e in vivo e sono state valutate le componenti degli effetti di diversi Cis.

Materiali e metodi

Coltura cellulare e reagente

La linea cellulare di spermatogoni di topo GC-1spg (GC-1) è stata acquistata dall'American Type Culture Collection (ATCC) e coltivata in DMEM (Invitrogen, USA) integrata con il 10% di siero bovino fetale, l'1% È stato acquistato L-glutamina (100 mM), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 ug/mL) a 37 gradi in un'incubatrice umidificata con 5% di CO, Cis (Cis-A, B, C, H) di Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Cina).

Test di vitalità cellulare

La vitalità cellulare è stata testata mediante il test del kit di conteggio cellulare{{0}}(CCK-8). In breve, le cellule GC-1 sono state seminate in 96-piastre a pozzetti a 1,5 × 103 per pozzetto e coltivate a 37 gradi per 24 ore. Quindi, le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni (20 percento, 15 percento, 10 percento, 5 percento) di ossigeno o diverse concentrazioni (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) di Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) per il tempo richiesto. Quindi, il supernatante è stato scartato e le vitalità cellulari sono state rilevate utilizzando un kit CCK-8 (Dojindo Japan). L'assorbanza di ciascun pozzetto è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre (BioRad USA). Infine, le vitalità cellulari sono state calcolate secondo la seguente formula: Vitalità cellulare=(gruppo OD sperimentale - gruppo OD vuoto)/ (gruppo OD di controllo - gruppo OD vuoto) × 100 percento. Analisi Western blot Le cellule oi tessuti raccolti sono stati omogeneizzati in tampone RIPA per estrarre proteine ​​(RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Svizzera). Sono stati raccolti i supernatanti e la concentrazione delle proteine ​​è stata testata con il metodo BCA (Beyotime). Circa 40 ug delle proteine ​​estratte da ciascun campione sono stati separati mediante SDS-PAGE ed elettrotrasferiti sulla membrana del filtro di nitrocellulosa (NC) (Beyotime China). Le membrane del filtro NC sono state bloccate con latte scremato al 5% per 1,5 ore e incubate con anticorpi specifici (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti- Bax 1:1000, anti-GAPDH 1:1000; tutti gli anticorpi sono stati acquistati da Cell Signaling Technology, USA) durante la notte a 4 gradi. Quindi, tutte le membrane NC sono state incubate con il corrispondente anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano per 1,5 ore a temperatura ambiente e riprese con un sistema di imaging (Tannon, Cina).

Rilevazione del ciclo cellulare

È stato eseguito un test citometrico a flusso (FCM) per analizzare il ciclo cellulare. Le cellule sono state trattate in condizioni diverse per 72 ore e raccolte. Le cellule sono state quindi lavate con PBS, fissate in etanolo al 75% e colorate con ioduro di propidio (PI). Per ogni campione, 1 × 104 cellule sono state raccolte e analizzate mediante citometria a flusso (FACS Calibur, BD Biosciences). Quindi, sono state calcolate la proporzione di cellule di fase G1/S/G2 e l'indice di proliferazione [Fase(S più G2)/Fase(G1 più S più G2) × 100 percento].

Colorazione Ki-67

Le cellule sono state coltivate in un piatto confocale e trattate con ipossia o diversi sottotipi di Cis per 72 ore. Dopo aver fissato tutte le cellule con paraformaldeide al 4%, sono state incubate con l'anticorpo anti-Ki-67 (1:200, Cell Signaling Technology). Quindi, tutte le cellule sono state incubate con un anticorpo IgG anti-coniglio coniugato con CY-3- (1:200, Boster, Cina) e una soluzione DAPI (1,0 ug/mL, Beyotime). La fluorescenza è stata osservata con un microscopio confocale Fluoview FV1000 (Olympus, Giappone).

Rilevamento di ROS

FCM è stato introdotto per misurare i livelli di ROS intracellulari utilizzando DCFH-DA. Le cellule sospese sono state seminate in 6-piastre a pozzetti e sottoposte a diversi trattamenti. Dopo 72 ore di trattamento, le cellule sono state sospese in DMEM senza siero con 10 μM DCFH-DA (Beyotime). I contenuti di ROS sono stati quindi determinati mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza su un sistema di citometria a flusso Beckman Coulter con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 525 nm [18].

Determinazione della perossidazione lipidica (LPO)

Il test delle sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS) è stato eseguito per rilevare l'LPO. Tutte le fasi operative sono state eseguite secondo le istruzioni (Sigma USA). Le concentrazioni sono state calcolate utilizzando un coefficiente di estinzione molare di 1,56×105/(M-cm), ottenuto utilizzando la malondialdeide come standard. I risultati sono espressi come nmol di equivalenti MDA/mg di proteine.

Determinazione delle attività enzimatiche

Le attività enzimatiche sono state testate utilizzando kit di analisi tra cui glutatione reduttasi (GR), glutatione perossidasi (GPx) e superossido dismutasi (SOD). Tutte le fasi operative sono state eseguite secondo le istruzioni fornite (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).

Animali e protocollo sperimentale

Ratti Wistar maschi maturi (180-220 g, 8 w) sono stati ottenuti dal centro per animali della Quarta Università medica militare, Xi'an, Cina. L'autorizzazione all'uso degli animali è stata ottenuta dal Comitato Etico di Ateneo (Numero di riferimento: 20190506). L'esperimento sugli animali è stato condotto secondo le linee guida universitarie per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

Tutti i ratti sono stati autorizzati ad adattarsi per circa 1 settimana prima dell'inizio dell'esperimento. Dopo l'acclimatamento, i ratti sono stati distribuiti casualmente in 6 gruppi con 5 animali in ciascun gruppo. I ratti nel gruppo di controllo sono stati allevati a pressione normale (PO.:20 percento; pressione dell'aria: 101,3 kPa), mentre i ratti nel modello e i gruppi trattati con Cis sono stati allevati in una camera di ossigeno a bassa pressione (pressione interna di 61,6 kPa). , equivalente a un'altezza di 4000 metri sul livello del mare; PO:14,55 percento) per simulare un ambiente ipossico di alta quota. Tutti i ratti hanno avuto libero accesso a cibo e acqua in gabbie di plastica a 22 ± 2 gradi e condizioni di umidità con un ciclo automatico 12-h luce/buio. I ratti nel modello e nei gruppi trattati con Cis sono rimasti in condizioni ipobariche ma sono stati trasferiti in condizioni normobariche ogni 96 ore, momento in cui sono stati forniti loro cibo e acqua e le gabbie sono state pulite. La durata del passaggio da ipobarico a ipobarico è stata di circa 2 ore. Tutti i gruppi di trattamento sono stati trattati con il Cis corrispondente (8 mg/kg/giorno) tramite sonda gastrica per 8 settimane, mentre i ratti di controllo e modello sono stati trattati con un uguale volume di acqua.

Dopo 8 settimane, i ratti sono stati sacrificati in anestesia. Testicoli, epididimo e vescicole seminali sono stati separati e pesati e l'indice dell'organo è stato calcolato secondo la seguente formula: (peso dell'organo/peso dell'animale)

t) ×100 percento. Successivamente, sono stati raccolti gli spermatozoi nell'epididimo e sono state testate la loro motilità e l'attività dell'enzima acrosomiale. Allo stesso modo, i tessuti testicolari sono stati raccolti per studi istopatologici e rilevamento dell'attività enzimatica ROS, LPO e antiossidante.

Valutazione del tasso di spermatozoi vivi

L'epididimo è stato inciso con forbici chirurgiche e la sospensione spermatica è stata preparata in soluzione fisiologica normale. Per valutare il tasso di spermatozoi vivi, 5 ul della sospensione di spermatozoi sono stati accuratamente miscelati con un volume uguale di colorante eosina-Y. Gli spermatozoi sono stati quindi contati al microscopio ottico. I tassi di spermatozoi vivi sono stati valutati calcolando sia gli spermatozoi colorati (spermatozoi morti) che quelli non colorati (spermatozoi vivi).

Determinazione dell'attività dell'enzima acrosomiale spermatico

Il test di attività dell'enzima acrosomiale spermatico è stato utilizzato per valutare gli enzimi acrosomiale spermatici [19]. I risultati in ciascun gruppo sono stati calcolati utilizzando la seguente formula: attività dell'enzima acrosomiale (μIU)=(gruppo ODExperiment - gruppo ODBlank)/(247,5×10) × 106.

analisi statistica

Tutti i dati quantitativi sono espressi come media ± DS e sono stati analizzati utilizzando il software SPSS 22.0. Il test t di Independent Student è stato utilizzato per confrontare i dati tra due gruppi. "P<0.05>< 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">

Risultati

Effetti dell'ipossia sulle cellule GC-1

Per determinare gli effetti dell'ipossia sulle cellule germinali, abbiamo prima esaminato i cambiamenti nella capacità di sopravvivenza delle cellule dopo il trattamento dell'ipossia con diverse concentrazioni di ossigeno (20 percento, 15 percento, 10 percento, 5 percento) per 1, 3,5 e 7 giorni , rispettivamente. I risultati del test CCK-8 hanno mostrato che, rispetto al gruppo di controllo (concentrazione di ossigeno del 20%), le cellule esposte all'ipossia mostravano una significativa diminuzione della vitalità (P<0.01; figure="" 1a).="" moreover,="" their="" survival="" rate="" was="" inversely="" proportional="" to="" the="" oxygen="" concentration="" and="" further="" decreased="" with="" induction="" time.="" to="" avoid="" an="" excessive="" cytotoxic="" effect,="" a="" 10%="" oxygen="" concentration="" and="" 3-day="" induction="" time="" were="" selected="" as="" the="" hypoxic="" model="" criteria="" for="" subsequent="" in="" vitro="">

Successivamente, è stata eseguita la colorazione FCM e immunofluorescenza per valutare ulteriormente l'alterazione della proliferazione delle cellule GC-1 sotto trattamento con ipossia. I risultati hanno mostrato che l'ipossia potrebbe indurre l'arresto delle cellule GC-1 nella fase G1, riducendo così l'ingresso delle cellule nella fase S e inibendo la replicazione del DNA. Pertanto, l'ipossia ha ridotto significativamente l'indice di proliferazione delle cellule GC-1 (P<0.01; figure="" 1b).="" positive="" ki-67="" staining="" is="" another="" specific="" biomarker="" of="" proliferating="" cells.="" therefore,="" we="" also="" examined="" the="" ratio="" of="" ki-67-positive="" cells="" with="" or="" without="" hypoxia="" treatment.="" compared="" with="" the="" control="" group,="" hypoxia="" treatment="" remarkably="" reduced="" ki-67-positive="" cells,="" as="" shown="" in="" figure="">

Successivamente, abbiamo mirato a studiare la modalità di inibizione della vitalità cellulare GC-1 indotta dall'ipossia. Come riportato in letteratura, il livello di ROS è aumentato quando i ratti sono stati esposti ad un ambiente ipobarico ipossico [8,20]. Pertanto, i livelli di ROS endogeni nelle cellule GC-1 sono stati misurati utilizzando il test FCM. I risultati hanno mostrato livelli di ROS più elevati in ipossia rispetto al gruppo di ossigeno normale (P< 0.01;="" figure="" 1d).="" accumulated="" ros="" cause="" marked="" dna="" impairment,="" which="" in="" turn="" causes="" cell="" apoptosis="" pathway="" activation="" and="" might="" be="" the="" major="" etiological="" factor="" for="" the="" increased="" risk="" of="" male="" infertility="" [21,22].="" next,="" we="" detected="" the="" apoptotic="" activation="" effect="" of="" hypoxia="" on="" gc-1="" cells="" by="" tunelstaining.="" as="" shown="" in="" figure="" 1e,="" treatment="" with="" hypoxia="" resulted="" in="" an="" increase="" in="" tunel="" fluorescence="" compared="" with="" the="" control="" group,="" indicating="" an="" increase="" in="" apoptosis="" in="" the="" model="">

Poiché il danno cellulare indotto da ROS è solitamente causato dal sistema operativo, abbiamo ulteriormente testato il sistema operativo delle cellule GC-1. Come presentato nella Figura 1F, i livelli di LPO delle cellule GC-1 nel gruppo modello erano notevolmente

aumentato rispetto ai livelli di LPO delle cellule GC-1 nel gruppo di controllo. Questi risultati suggeriscono che il danno cellulare GC-1 indotto dall'ipossia potrebbe essere correlato alla OS, che è indotta dall'accumulo di ROS.

Effetti del Cis sulla vitalità cellulare GC-1 indotta dall'ipossia in vitro.

Per studiare se il Cis può prevenire gli effetti inibitori dell'ipossia sulla vitalità cellulare GC{{0}}, è stato eseguito un test CCK-8. Le cellule GC-1 sono state trattate con diversi sottotipi (Cis-A, B, C, H) e intervalli di concentrazione （0.02 μM, 0,2 μM, 2 μM） di Cis per 72 ore. Confronto di il gruppo modello con il gruppo DMSO ha mostrato che DMSO non promuoveva direttamente la vitalità cellulare GC-1 (Figura 2A). Tuttavia, la vitalità cellulare è stata notevolmente ripristinata (P< 0.05)="" with="" cis="" treatments.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" cis-a,="" cis-b,="" cis-c,="" and="" cis-h="" all="" showed="" certain="" protective="" effects="" on="" hypoxia-induced="" damage="" to="" gc-1="" cell="" viability,="" and="" cis-b="" showed="" the="" most="" significant="" effect(figure="" 2a).="" the="" protective="" effects="" of="" cis="" at="" 0.2="" μm="" were="" significantly="" higher="" than="" the="" protective="" effects="" of="" cis="" at="" 0.02="" μm,="" while="" the="" difference="" between="" 2="" μm="" and="" 0.2="" um="" was="" not="" obvious,="" indicating="" that="" the="" restored="" gc-1="" cell="" viability="" induced="" by="" cis="" demonstrated="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" the="" concentration="" range="" from="" 0.02-0.2="" μm="" （figure="" 2a）.="" therefore,="" according="" to="" the="" experimental="" needs,="" 0.2="" m="" cis="" was="" selected="" as="" the="" optimal="" concentration="" in="" the="" following="" in="" vitro="" experiments.="" to="" further="" confirm="" whether="" germ="" cells="" were="" indeed="" protected="" by="" cis,="" fcm,="" and="" ki-67="" staining="" were="" performed="" to="" assess="" the="" alteration="" of="" the="" proliferation="" of="" gc-1="" cells="" after="" treatment="" with="" cis.="" upon="" cis="" treatment,="" the="" proportion="" of="" gc-1="" cells="" in="" the="" g1="" phase="" was="" reduced.="" in="" contrast,="" more="" cells="" entered="" s-phase,="" suggesting="" that="" cis-treatment="" could="" increase="" the="" germ="" cell="" proliferation=""><0.01; figure="" 2b).="" the="" statistics="" for="" the="" gc-1="" cell="" cycle="" are="" shown="" in="" figure="" 2bb.="" the="" ki-67="" staining="" results="" also="" showed="" that="" cis-a,="" cis-b,="" cis-cand="" cis-h="" treatment="" significantly="" improved="" the="" ki-67-positive="" cell="" ratio="" of="" hypoxia-induced="" gc-1="" cells="" in="" vitro(figure="">

Il meccanismo del Cis protegge le cellule germinali dall'ipossia in vitro.

Per studiare se gli effetti protettivi di Cis sulle cellule GC-1 fossero correlati alla rimozione di ROS in eccesso, è stato utilizzato il colorante fluorescente DCFH-DA per rilevare i livelli di ROS in ciascun gruppo. Come mostrato nelle Figure 3A, 3B, il trattamento con DMSO non ha modificato il contenuto di ROS intracellulare o il livello di LPO rispetto al gruppo modello. Tuttavia, i livelli di ROS nelle cellule GC-1 sono stati notevolmente ridotti nei gruppi trattati con Cis (Figura 3A). Inoltre, è stata osservata una diminuzione dell'LPO anche nelle cellule GC-1 soggette a Cis (Figura 3B).

Per esplorare ulteriormente il meccanismo mediante il quale Cis protegge le cellule germinali dal danno ipossico, sono state eseguite la colorazione TUNEL e le analisi Western blot per valutare l'apoptosi. La colorazione TUNEL (Figura 3C) ha mostrato un'apoptosi significativa nel modello e nei gruppi DMSO. Tuttavia, con il trattamento con Cis sono state osservate meno cellule apoptotiche, il che indicava che il trattamento con Cis riduceva l'apoptosi delle cellule GC-1. Inoltre, è stata misurata l'espressione di PARP, Caspase-3, Bax e Bcl-2 per corroborare il meccanismo molecolare. Come presentato nella Figura 3D, Caspase-3 e PARP sono state attivate nelle cellule GC-1 in ipossia e questa attivazione è stata inibita dal trattamento con Cis. Inoltre, il rapporto Bax/Bcl-2 era maggiore nel gruppo modello rispetto al gruppo di controllo e il trattamento Cis ha ridotto il rapporto Bax/Bcl-2(Figura 3D). Questi dati indicavano che Cis aveva una potenziale capacità di attenuare il danno ossidante indotto dall'ipossia e questo effetto protettivo potrebbe essere ottenuto riducendo l'accumulo di ROS e inibendo l'attivazione della via dell'apoptosi correlata alla caspasi.

Il meccanismo enzimatico che inibisce la OS coinvolge scavenger di radicali liberi come la glutatione reduttasi (GR), la glutatione perossidasi (GPx) e la superossido dismutasi (SOD)[23]. Il meccanismo enzimatico che inibisce la OS gioca un ruolo essenziale nella prevenzionedanno ossidativonelle cellule e nei tessuti [23]. Per convalidare ulteriormente il potenziale meccanismo dell'inibizione di Cis dell'OS indotta dall'ipossia nelle cellule GC-1, sono state misurate le attività di GR, GPx e SOD. I risultati hanno rivelato che le attività GR, GPx e SOD tutte significativamente (P <{3}}.01, figura="" 3e)="" sono="" diminuite="" in="" ipossia="" rispetto="" ai="" gruppi="" di="" controllo="" e="" il="" trattamento="" con="" cis="" ha="" ripristinato="" notevolmente="" le="" loro="" attività="" in="" gc{{6}="" }="" cellule="" esposte="" all'ipossia="">< 0.05,="" figure="" 3e),="" suggesting="" that="" these="" compounds="" could="" activate="" the="" powerful="" endogenous="" antioxidant="">

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