Parte 2: La molecola del danno renale-1 è un potenziale recettore per SARS-CoV-2
May 11, 2022
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Manifestazioni cliniche del coronavirus
1. Il periodo di incubazione è lungo e i sintomi principali sono febbre, affaticamento, mal di gola e tosse. La febbre può essere febbre alta, febbre moderata o febbre bassa;
2. I neonati e gli anziani non sono tipici e sono spesso accompagnati da dispnea e dispnea. Nei casi più gravi possono verificarsi danni multi-sistema;
3. La tosse secca nella fase iniziale è principalmente parossistica e grave, simile alla pertosse, che colpisce il sonno e le attività; nella fase successiva, la tosse è espettorato, l'espettorato è vizioso, occasionalmente contiene una piccola quantità di sangue e alcuni sono accompagnati da respiro sibilante;
4. Alcuni pazienti hanno sintomi lievi e potrebbero non avere febbre. La maggior parte dei pazienti ha una buona prognosi e un piccolo numero di pazienti è gravemente malato o addirittura muore;
5. Sindrome da distress respiratorio acuto, shock settico, acidosi metabolica refrattaria e disfunzione della coagulazione.
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Discussione
Per combattere ilPandemia di COVID-19, una profonda comprensione di comeSARS-CoV-2invade le cellule umane è giustificato. Gli studi hanno indicato l'infezione diretta di SARS-CoV-2 nelreneoltre al polmone (Braun et al., 2020; Farkash et al.,2020). Tuttavia, ACE2 rimane l'unico recettore ben riconosciuto che può mediare questa invasione. Inoltre, il tropismo renale di SARS-CoV-2 e associatodanno renalesembrano inspiegabili dal livello relativamente ridotto di ACE2 durante l'invasione virale (Kuba et al.,2005). Qui, il nostro studio suggerisce che KIM1, un biomarcatore drasticamente sovraregolato per danno renale (Yang et al., 2015), media l'invasione renale SARS-CoV-2 come recettore.
Abbiamo anche scoperto che SARS-CoV-2-RBD si lega a KIM1 con un'affinità maggiore rispetto a SARS-CoV-RBD e MERS-COV-RBD, che probabilmente è alla base del più forte contagio di SARS-CoV-2 (Rabaan et al, 2020); pertanto, l'infezione renale e i ruoli di KIM1 in queste gravi malattie respiratorie meritano una rivisitazione. In particolare, i nostri risultati suggeriscono siti di legame distinti di KIM1 e ACE2 sull'RBD virale, quindi vale la pena indagare se e come KIM1 e ACE2 mediano l'invasione di SARS-CoV-2 in questi organi. Inoltre, poiché KIM1 viene endocitato tramite percorsi clatrina-dipendenti (Zhao et al.,2016), sarebbe anche interessante esplorare ulteriormente il processo KIM1-dipendente dopo l'attaccamento virale alla membrana cellulare.
ACE2 è il recettore più studiato per SARS-CoV-2, ma non è un bersaglio terapeutico ideale per COVID-19, poiché è ampiamente espresso in più organi e svolge ruoli cruciali nella regolazione della pressione sanguigna e prevenire il danno cardiaco/renale (Imai et al.,2005; Li et al.,2020d). Al contrario, KIM1 ha un'associazione più forte con la funzione renale ed è altamente espresso solo dopodanno renale(Kondratowicz et al, 2011; Yuan et al, 2015; Costafreda e Kaplan, 2018), il che lo rende un obiettivo terapeutico più specifico e forse anche più sicuro per i pazienti COVID-19 con malattie renali.
In sintesi, i nostri dati suggeriscono un ruolo cruciale di KIM1 nel tropismo renale SARS-CoV-2 come potenziale recettore per SARS-CoV-2. Qui proponiamo un modello di un "circolo vizioso" mediato da KIM1 e ACE2 (Figura 5G), che potrebbe spiegare il tropismo renale di SARS-CoV-2 nei pazienti COVID{10}}. Durante la fase iniziale dell'invasione di SARS-CoV-2, il livello fisiologico più elevato (Figura supplementare S1) e l'affinità di legame (Tabella supplementare S1) rendono ACE2 il bersaglio principale, che non è specifico del rene. Tuttavia, dopo l'inizio dell'AKl indotto dal virus, il risultante KIM1 drasticamente sovraregolato promuove rapidamente un'infezione virale secondaria mediata da KIM1 e ACE2, che è più specifica del rene, e di conseguenza esacerba il danno renale in un circolo vizioso (Figura 5G). Approcci in grado di interrompere l'interazione tra SARS-CoV-2 e KIM1, inclusi anticorpi anti-KIM1, inibitori di piccole molecole e peptidi antagonisti derivati da KIM1-, possono far luce su COVID-19 trattamento.
Materiali e metodi
Materiali
Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 percento) sono stati sintetizzati chimicamente da Genscript. L'anticorpo anti-topo-lgG (p/n 18-8816-33) e l'anticorpo anti-coniglio-lgG (p/n 18-8817-33) sono stati ottenuti da Rockland. IgG with SureBeads" Le sfere magnetiche di proteina G (J2112LB-02) sono state acquistate da Bio-Rad. DAPI (D9542) proveniva da Sigma. Falloidina marcata Alex Flour 594 (C2205S) proveniva da Beyotimes. Anticorpi contro KIM1 (NBP{{ 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) e ACE2 (2115-1-AP, Proteintech).
Acquisizione e analisi dei profili di espressione di KIM1 e ACE2
Per ottenere il trascrittoma completo e i profili proteici di KIM1 e ACE2 per i tessuti umani, abbiamo raccolto e analizzato i dati del trascrittoma e i profili proteici basati sull'immunoistochimica da Human Protein Atlas (HPA, https://www.proteinatlas.org), che ha mostrato il espressione e localizzazione di proteine umane attraverso tessuti e organi, sulla base del sequenziamento profondo dell'RNA (RNA-seq) da 37 tessuti normali e immunoistochimica su microarray di tessuti contenenti 44 tipi di tessuto (Uhlen et al., 2015). Il tessuto HPA RNA-seq del gene codificante le proteine è stato registrato come trascrizioni di codifica delle proteine medie per milione (pTPM), corrispondenti ai valori medi dei campioni di ciascun tessuto. I livelli di espressione proteica basati sull'istologia sono stati analizzati manualmente in quattro livelli (non rilevato, basso, medio e alto). Nella figura supplementare S1, sono elencati rispettivamente i primi 10 livelli trascrizionali tissutali e i livelli di espressione proteica basati sull'istologia di KIM1 e ACE2 e viene riassunto il profilo di espressione sovrapposto di KIM1 e ACE2.
Docking molecolare e simulazioni dinamiche
Gli ancoraggi sono stati condotti tramite Z-Dock (http://zdock. umassmed.edu/). Strutture cristalline di SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), SARS-CoV{5}}RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2 (PDB ID 1R42) e KIM1 Ig Il dominio V (PDB ID 5DZO) è stato utilizzato per cercare potenziali modelli di legame. I complessi proteici con il punteggio migliore sono stati selezionati per le seguenti simulazioni di dinamica molecolare, che sono state condotte dal server Desmond e analizzate da Pymol2.3 e Maestro11.8.012. Il diagramma di simulazione dinamica di 50 ns è stato applicato per studiare i parametri dinamici dei complessi proteici . L'energia libera di legame MM-GBSA è stata calcolata da HawkDock (Misini lgnjatovic et al.,2016).
Deviazione quadratica media radice (RMSD) e fluttuazione quadratica media radice (RMSF)
RMSD è stato utilizzato per stimare la variazione media dello spostamento di una selezione di atomi per un particolare frame come descritto (Li et al.,2011). L'RMSF è stato condotto per studiare i cambiamenti di spostamento nella catena proteica (Li et al.,2011) .
Modelli di mouse AKI e qPCR
La lesione I/R è stata eseguita su topi C57BL/6 come descritto in precedenza (Chen et al, 2015, 2017). Per l'AKI indotta da cisplatino, 30 mg/kg di cisplatino di peso corporeo sono stati iniettati per via intraperitoneale in topi maschi di 8- settimane e i topi sono stati sacrificati 3 giorni dopo. Sono stati raccolti campioni di sangue e reni per ulteriori analisi, con n=4 per ciascun gruppo di animali sperimentali. L'RNA totale è stato isolato dai reni mediante RNAiso Plus (TaKaRa) e trascritto inversamente in cDNA utilizzando il sistema di sintesi del primo filamento M-MLV (Invitrogen). L'abbondanza di trascrizioni di geni specifici è stata valutata mediante qPCR. Vengono forniti i primer utilizzati nello studio (Tabella Supplementare S4).
Costruisce
Plasmidi di espressione di mammiferi per KIM1 umano, KIM1 Ig V (residui KIM1 aa 20-127), KIM1 △lg V(KIM1 troncato senza residui aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S residui aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}Sono stati costruiti RBD-YFP e TIM4-YFP. I prodotti di amplificazione PCR dei corrispondenti frammenti di cDNA sono stati clonati in un vettore basato su promotore pRK contenente tag HA o FLAG. I plasmidi correlati a SARS-CoV-2-sono stati doni gentili del Dr. PHWang dell'Università di Shandong.
Coltura cellulare e trasfezione
La linea cellulare tubulare renale umana HK-2 (ottenuta dal China Center for Type Culture Collection) è stata coltivata in terreno DMEM/F12 (Hyclone) contenente 17,5 mM di glucosio e il 10% di siero bovino fetale. Per valutare l'impatto di SARS-CoV-2 sulle cellule, le cellule HK-2 sono state trasfettate con plasmidi SARS-CoV-2-S e SARS-CoV-2-RBD e quindi raccolte per ulteriore rilevamento.
Co-IP
Le cellule HK{0}}/HEK293T indicate (1×10) sono state lisate in 1 ml di tampone di pre-lisi (Tris-HCl 25 mM, pH7,4.150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA, 5 percentuale di glicerolo), che è formulato per i test di pulldown e IP e come tampone di lavaggio per le microsfere. Per l'IP, il lisato cellulare è stato immunoprecipitato con l'anticorpo indicato o il rispettivo gG con perline magnetiche SureBeadsTM Protein G durante la notte a 4°C. Dopo il lavaggio con un tampone di prelisi contenente 500 mM di NaCl, le perline sono state bollite in un tampone di carico e sottoposte a immunoblotting (Wan et al.,2017).
Saggio FRET
L'interazione intracellulare tra KIM1 e SARS-CoV-2-RBD è stata rilevata da un test standard basato su FRET (Karpova e McNally, 2006) utilizzando KIM1-CFP e SARS-CoV-2-RBD-YFP . In breve, i plasmidi di espressione di mammiferi che esprimono KIM1-CFP o KIM1 Alg V-CFP sono stati cotrasfettati con SARS-CoV-2-RBD-YFP in{15}}cellule T. Per il rilevamento basato sullo spettrofotometro a fluorescenza, le cellule sono state raccolte e lisate 24 ore dopo la trasfezione e il lisato è stato rilevato da uno spettrofotometro a fluorescenza F-2700 (Hitachi) tramite scansione della lunghezza d'onda (500-600 nm) e scansione del tempo (435 /527 nm, eccitazione/emissione). Per il rilevamento confocale, le cellule sono state riprese con un microscopio confocale Leica TCS SP8 con obiettivo ad alta potenza (40 ×) (canale CFP: 435/485 nm, eccitazione/emissione; canale YFP :485/527 nm, eccitazione/emissione; canale FRET: 435/527 nm, eccitazione/emissione) (Li et al, 2020b). La cotrasfezione di CFP e YFP non coniugati è stata inclusa come controllo negativo come descritto (Karpova e McNally, 2006). L'interazione tra KIM1 e il suo ligando TIM4 è stata rilevata dal test FRET come controllo positivo (Rong et al, 2011).
CRISPR-Cas9-mediato knockout di KIM1
I protocolli basati su CRISPR-Cas9-per l'ingegneria del genoma sono stati utilizzati come descritto (Zhang et al.,2017). Vengono fornite le sequenze target dell'RNA guida per KIM1 (tabella supplementare S4).
Etichettatura FITC e microscopia confocale
L'etichetta FITC è stata eseguita come descritto in precedenza (Li et al, 2020b; Zhang et al.,2020). In breve, SARS-CoV-2-RBD è stato incubato con FITC (rapporto molare 1:5) durante la notte, quindi è stato aggiunto 5 mM di NHCl per fermare la reazione e spegnere il FITC non reagito. La soluzione è stata dializzata due volte e liofilizzata per un ulteriore utilizzo.
Le cellule HEK293T (5×109) o le cellule HK-2 (1×107) sono state incubate con FITC o FITC-SARS-CoV-2-RBD liberi (100 ug/ml per 2). Per i test di interiorizzazione basati sui peptidi, AP1 o AP2（50μM）è stato aggiunto insieme a FITC-SARS-CoV-2-RBD (100 ug/m2). Dopo la fissazione con formaldeide al 4 percento (p/v), le membrane cellulari sono state colorate con falloidina marcata con Alex Flour 594 (2 ug/ml) e i nuclei sono stati colorati con DAPI (1 ug/m2) e quindi fotografati con un Leica TCS Microscopio confocale SP8. Per ogni gruppo, sono state incluse nella valutazione almeno 100 cellule da cinque campi sotto una lente dell'obiettivo ad alta potenza (64 ×). Sono state presentate immagini rappresentative. La quantificazione delle immagini è stata condotta da ImageJ1.8.0.
Saggi di vitalità cellulare
Le cellule sono state piastrate a 3000-4000 cellule per pozzetto in 96-piastre a pozzetti. All'80% di confluenza, le cellule incubate con SARS-CoV-2-RBD (100 ug/ml) sono state trattate con o senza AP1 o AP2 (10,50,100 μM). Successivamente, a ciascuno sono stati aggiunti 10ul MTT (5 mg/ml).
bene per 4 ore, il mezzo è stato rimosso ed è stato aggiunto DMSO. L'assorbanza misurata a 490 nm è stata normalizzata rispetto al rispettivo gruppo di controllo.
analisi statistica
I dati sono stati espressi come media ± DS. Differenze significative sono state valutate da un test di Student a due code. Un valore P a due code<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">
