Parte 3: Effetti dell'isorhamnetina sul diabete e le sue complicanze associate: una revisione degli studi in vitro e in vivo e un'analisi post hoc del trascrittoma del percorso molecolare coinvolto

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5. Un'analisi del trascrittoma post hoc predice il potenziale effetto dell'isorhamnetina sul diabete in uno strumento basato su cellule staminali

Abbiamo creato uno strumento basato su cellule staminali utilizzando un perinatalecellula staminale, cellule epiteliali amniotiche umane (hAECs), per valutare le bioattività di composti naturali che impiegano l'analisi di microarray dell'intero genoma [71.140-144]. Negli ultimi anni, un numero sempre maggiore di composti bioattivi nelle piante medicinali sono stati sottoposti a screening per i loro potenziali effetti terapeutici e preventivi. In questo contesto, gli approcci basati sulle cellule staminali che utilizzano cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) ricevono grande attenzione in quanto modelli umani in vitro fisiologicamente più rilevanti per lo screening dei farmaci e la convalida di migliaia di composti sia nella ricerca accademica che nell'industria farmaceutica[145-147]. Tuttavia, le hPSC, comprese le cellule staminali embrionali (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC), hanno risorse cellulari limitate, richiedono procedure di estrazione invasive, costose riprogrammazioni cellulari e procedure di manutenzione critiche, oltre a porre vincoli etici e quindi sono meno favorevoli come fonte pratica per lo screening farmacologico. D'altra parte, le hAEC sono rimosse dal termine placenta scartato, un prodotto di scarto medico. Non richiedono procedure di raccolta invasive e hanno preoccupazioni etiche minime. Inoltre, le hAEC sono svincolate dagli epiblasti pluripotenti e quindi mantengono il potenziale di differenziazione multilinea di tipo ESC e possono essere differenziate in cellule da tutti e tre gli strati germinali [148-151].

Vale la pena notare che, secondo un appropriato protocollo di differenziazione, le hAEC possono essere differenziate in cellule simili agli epatociti [152-155], colangiociti [156] e, soprattutto, cellule produttrici di insulina simili a β pancreatiche [157-160]. Il trapianto di cellule pan-creatiche indotte da hAEC in topi diabetici indotti da streptozotocina potrebbe normalizzare il livello di glucosio nel sangue[161]. hAECs[162], così come gli esosomi derivati dalle hAECs [163], potrebbero accelerare la guarigione delle ferite diabetiche promuovendo l'angiogenesi e la funzione dei fibroblasti e riducendo l'infiammazione. Incorporare hAECs in organoidi insulari [164] e schermare le isole native con uno strato di hAECs [165] potrebbe migliorare l'attecchimento e la rivascolarizzazione delle isole nei modelli di topi diabetici. Inoltre, le cellule epatocitarie derivate dall'hAEC, così come la stessa hAEC, sono state segnalate per avere efficacia terapeutica nelle malattie del fegato, tra cui la fibrosi epatica [166,167], la cirrosi [168] e l'insufficienza epatica [169].

Considerando la complessa fisiopatologia della DM, hAEC potrebbe non essere un modello ideale in vitro per studiare gli effetti antidiabetici dei composti. Tuttavia, a causa delle sue proprietà simili alle cellule staminali, può essere utilizzato per lo screening iniziale dei composti bersaglio. In precedenza abbiamo esplorato il potenziale antifibrotico[71] e di differenziazione epatica [170] dell'isorhamnetina nelle hAEC. Nel presente studio, abbiamo eseguito un'analisi secondaria mirata dei nostri dati precedentemente pubblicati [71] per esplorare le potenziali funzionalità dell'isorhamnetin inDiabete(Figura 4). L'analisi dei dati è stata condotta per tre repliche biologiche del controllo del giorno 10 (n = 3) e delle hAEC trattate con isorhamnetin (n = 3). Le cellule sono state coltivate in coltura cellulare 3D. Le cellule di controllo sono state mantenute in mezzo cellulare epiteliale basale placentare (Promo Cell, Cat.#C-26140) in assenza di qualsiasi mezzo di differenziazione o fattori di crescita, mentre le cellule di trattamento sono state integrate con 20 mM di isorhamnetin (Sigma-Aldrich, Giappone) per 10 giorni. I geni differenzialmente espressi (DEG) sono indicati come geni con un cambiamento lineare di piega>2 e valore p<0.05(one-way between-subjects="" anova).="" a="" total="" of="" 303="" degs="" were="" identified;="" among="" them,="" 60="" were="" upregulated="" and="" 243="" were="" downregulated.="" details="" of="" methodology="" have="" been="" explained="" elsewhere="" [71,170].="" all="" microarray="" data="" are="" available="" at="" gene="" expression="" omnibus(geo)="" under="" accession="" number:="" gse153149="" (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc="GSE153149,accessed" on="" 24="" november="">

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5.1. Set genetici di firma del tipo cellulare

Nei nostri precedenti studi sulle hAEC, abbiamo scoperto che diversi tipi di composti potrebbero dirigere la differenziazione delle hAEC verso diverse linee cellulari, come un estere dell'acido caffeico, l'acido rosmarinico [142] e un derivato dell'acido caffeoilchinico3,4,5-Tri-O-Caffeoylquinic Acid (TCQA)[140] che potrebbe migliorare la differenziazione delle cellule neurali, mentre un antocianina, cyanidin-3-O-glucoside (Cy3G), ha indotto la differenziazione degli adipociti [143] nelle hAEC. Abbiamo osservato che le bioattività o le funzionalità dei composti naturali potrebbero generalmente essere previste dai tipi di cellule arricchite dai DEG.

Abbiamo esaminato i set di dati sulle firme dei tipi di cellule significativamente arricchiti utilizzando il Molecular Signatures Database (MSigDB)ver. 7.4 del software online GSEA (https://software. broadinstitute.org/gsea/index.jsp; consultato il 26 novembre 2021)[171]. Questi set di geni contengono geni di firma marcatore cluster per tipi di cellule identificati in studi di sequenziamento di singole cellule di tessuto umano e facilitano le assegnazioni di tipi cellulari in set di dati, come esperimenti di sviluppo di modelli organoidi.

Abbiamo scoperto che il set di geni del tipo cellulare più significativamente arricchito erano le cellule stromali mesenchimali pancreatiche [172] (Figura 4A). Inoltre, i tipi di cellule duttali ed endoteliali pancreatiche sono stati significativamente arricchiti [172]. I geni della firma pancreatica nelle hAEC trattate con isorhamnetin sono coinvolti nella transizione epiteliale-mesenchimale, nella segnalazione TGF-β, nella segnalazione TNF-αsignal tramite NF-kB, nella segnalazione KRAS e nel metabolismo degli acidi grassi. Diversi set di geni della firma epatica sono stati anche significativamente arricchiti, come HSC, cellule kupffer, cellule del dotto biliare [173] e cellule mesoteliali del fegato fetale [174]. C'erano anche diversi set genetici di firma del muscolo scheletrico significativamente arricchiti, tra cui cellule progenitrici fibro-adipogeniche fibrillin1 + fibro-adipogeniche (FBN1 + FAP), cellule progenitrici fibro-adipogeniche (FAP) e periciti muscolari scheletrici [175]. Le funzioni biologiche dei geni della firma epatica nelle hAEC trattate con isorhamnetin includono diverse vie di risposta infiammatoria, mentre i geni della firma del muscolo scheletrico regolano la guarigione delle ferite, l'organizzazione delle fibrille di collagene e la cascata MAPK. La significatività è stata misurata come il tasso di falsa scoperta, un analogo del valore p ipergeometrico dopo la correzione di Benjamini e Hochberg per il test di ipotesi multiple (FDR q-value<>

5.2.Set genetici caratteristici significativamente arricchiti

Successivamente, abbiamo esaminato i set di geni distintivi significativamente arricchiti su MSigDB (recuperato il 26 novembre 2021). I set di geni distintivi rappresentano stati biologici specifici e ben definiti o processi generati sulla base dell'identificazione delle sovrapposizioni di set genetici e del mantenimento di geni che mostrano un'espressione coerente. I segni distintivi hanno una collezione di 50 set di geni condensati da oltre 4000 set di geni sovrapposti e quindi hanno ridotto il rumore e la ridondanza [176].

I set di geni caratteristici significativamente arricchiti includono geni che definiscono la transizione epiteliale-mesenchimale, geni sovraregolati in risposta all'ipossia, geni regolati da NF-kB in risposta al TNF, geni su e giù regolati dall'attivazione di KRAS, geni che mediano l'apoptosi mediante attivazione di caspasi, geni coinvolti nella miogenesi, geni sovraregolati in risposta a TGF-β1, geni sovraregolati da STAT5 in risposta alla stimolazione IL-2, geni che definiscono la risposta infiammatoria, geni coinvolti in percorsi e reti p53 e geni che codificano proteine coinvolte nella glicolisi e nella gluconeogenesi (Figura 4B). La significatività è stata considerata al valore Q di FDR<>

Una scoperta interessante è l'arricchimento dell'attivazione di KRAS da parte dei DEG delle HAEC trattate con isorhamnetin. Diverse espressioni geniche indotte da KRAS sono risultate significativamente sottoregolate dall'isorhamnetin, come MMP9, TSPAN1 e ITGBL1. L'iperglicemia innesca l'instabilità genomica che porta a mutazioni KRAS nelle cellule pancreatiche [177] ed è stata anche associata ad un aumentato rischio e invasività dei tumori del pancreas [178] e del colon [179]. Wang et al.hanno riferito che l'isorhamnetina sopprime la proliferazione della linea cellulare di adenocarcinoma pancreatico PANC-1 attraverso la downregulationing dell'attività della via di segnalazione Ras / MAPK [134]. Pertanto, come menzionato nella sezione 4.2.4, l'effetto dell'isorhamnetin sul rischio indotto da KRAS di tumori nel diabete, in particolare i tumori del pancreas, merita un'ulteriore esplorazione.

5.3. Percorsi significativamente arricchiti

Un'ulteriore analisi del percorso dei DEG è stata condotta utilizzando il Comparative Toxicogenomics Database(CTD)(http://ctdbase.org/; consultato il 29 novembre 2021)[180]. CTD rappresenta la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) e i percorsi REACTOME. Abbiamo scoperto che diversiinfiammatoriole vie, la formazione e l'assemblaggio del collagene, la via di segnalazione PI3K-Akt e la via di segnalazione AGE-RAGE nelle complicanze diabetiche sono state significativamente arricchite (Figura 4C).

I prodotti finali di glicazione avanzata (AGE) sono prodotti attraverso la glicazione non enzimatica e l'ossidazione di proteine, lipidi e acidi nucleici. I recettori per i prodotti finali di glicazione avanzata (RAGE) appartengono alla superfamiglia delle immunoglobuline. La segnalazione AGE/RAGE è una cascata complessa e intricata che attiva più vie di segnale intracellulare che coinvolgono la proteina chinasi C, nadph ossidasi e MAPK, con conseguente espressione indotta da NF-kB di IL-1, IL-6, TNF-α, VCAM-1 e VEGF. In particolare, la segnalazione AGE/RAGE è stata implicata nella calcificazione vascolare mediata dal diabete attraverso l'attivazione delle vie mediate da fibrosi mediata da TGF-β, NFkB ed ERK1/2 [181-184]. Abbiamo scoperto che l'isorhamnetin ha ridotto significativamente l'espressione genica correlata alla segnalazione AGE / RAGE, come COL1A1, COL1A2, COL4A6, FN1, MMP2 e SERPINE1. Come discusso nella sezione precedente, gli effetti antifibrotici di isorhamnetin sono stati ben documentati [71,74,99,119], e quindi, si può affermare che l'isorhamnetin può anche avere effetti benefici nella patologia vascolare indotta dal diabete.

5.4.Malattie metaboliche significativamente arricchite ed espressioni geniche correlate

I dati curati dell'associazione gene-malattia sono stati recuperati dal CTD (recuperato il 29 novembre 2021). Abbiamo curato solo malattie metaboliche significativamente arricchite. La significatività dell'arricchimento è stata calcolata dalla distribuzione ipergeometrica regolata dal metodo Bonferroni. Le malattie metaboliche significativamente arricchite includevano DM, glucosio e disturbi del metabolismo lipidico, iperglicemia e obesità (Figura 4D). Heatmap mostra che PPARs, TGF, TNF, ILs, collagene e espressioni geniche che inducono l'apoptosi sono stati significativamente sottoregolati nelle hAEC trattate con isorhamnetin (Figura 4E). D'altra parte, i recettori dell'insulina, le lipoproteine lipasi e gli inibitori dell'apoptosi sono stati significativamente sovraregolati nelle hAEC trattate con isorhamnetin.

La nostra analisi mirata dei dati di microarray delle hAEC trattate con isorhamnetin ha anche confermato il potenziale dell'isorhamnetin nella regolazione delle funzioni biologiche correlate al DM e alle complicanze associate.

6. Biodisponibilità e assorbimento intestinale di Isorhamnetin Aglycone e dei suoi derivati glicosilati

Con la presenza di varie categorie diflavonoidiin natura, è interessante analizzare la presenza di questi composti nel corpo. Quando parliamo del metabolismo dell'isorhamnetin e della sua disponibilità nel corpo umano dopo il consumo, stiamo parlando dell'origine, del metabolismo e del trasporto. Questo si basa su un'osservazione fatta dalla cromatografia di alcuni flavonoidi come i flavonoli nel siero umano. La cromatografia liquida-spettrometria di massa fornisce informazioni sulla biodisponibilità di alcuni flavonoidi nelle loro forme di aglicone e glicoside nel corpo [49]. La spettrometria di massa può essere utilizzata per determinare i flavonoidi in campioni biologici [185]. Uno studio ha riportato 23 derivati misti di solfato, metile, glucuronide e glucosio diquercetinasia nelle urine che nel plasma di volontari umani 1 ora dopo l'ingestione di cipolle rosse leggermente fritte. Questo studio ha rilevato glicosidi sia della quercetina che dell'isorhamnetin nel plasma [186].

Diversi fattori svolgono un ruolo nell'ingresso di sostanze nutritive attraverso il tratto digestivo. Ad esempio, gli enzimi del microbiota intestinale influenzano l'ingresso di composti fenolici.

Uno studio condotto sugli estratti di foglie di ginkgo in un modello di topi ha mostrato l'importanza del microbiota intestinale sulla biodisponibilità e l'assorbimento dal tratto gastrointestinale di alcune molecole bioattive, in particolare l'isorhamnetin [187]. In questa fase, gli enzimi del microbiota intestinale produconoflavonoideagliconi e una varietà di prodotti di fissione ad anello. Le analisi dei campioni di sangue intero hanno indicato che l'assorbimento di isorhamnetin è stato aumentato dal trattamento antibatterico, suggerendo che gli enzimi del microbiota intestinale hanno un effetto negativo sulla farmacocinetica delle molecole naturali, come l'isorhamnetin.Antibattericoo il consumo di probiotici può aumentare la biodisponibilità della forma glicosidica di isorhamnetin. Inoltre, i tassi di biotrasformazione in vitro e i tempi di permanenza delle molecole bioattive differivano tra ratti normali, diabetici e con nefropatia diabetica [188].

D'altra parte, diversi trasportatori di membrana controllano il trasporto di flavonoidi, come il trasportatore di glucosio sodio-dipendente 1 (SGLT1) e le proteine 2 e 3 associate alla resistenza multifarmaco (MRP2 e MRP3)[189]. In questo contesto, i trasportatori MRP regolano le vie di trasporto transcellulare e paracellulare dell'isorhamnetin [190]. All'interno delle cellule, il trasporto di isorhamnetin dal lato apicale a quello basale era 6,8-9,3 volte più alto. Nella Figura 5, gli effetti antidiabetici dell'isorhamnetin sono riassunti.

7. Conclusioni

L'isorhamnetin è un composto fenolico della famiglia dei flavonoidi, più precisamente dei flavonoli. Originariamente è una molecola di quercetina ma ha subito metilazione. Isorham-netin è distribuito nel regno vegetale in molte piante selvatiche e cosmetiche. Inoltre, diverse piante medicinali producono questa molecola e diversi studi hanno attestato il suo effetto antidiabetico tra le altre attività biologiche. Tutti questi dati mostrano quindi l'interesse dell'isorhamnetin nell'industria terapeutica. Da questo punto di vista, sarebbe molto interessante esplorare l'effetto dell'isorhamnetin e dei suoi derivati, isolati soprattutto dalle risorse naturali, sui disordini metabolici. È inoltre necessario evidenziare e rivedere gli studi clinici condotti in questo contesto utilizzando frazioni ricche di flavonoidi e prodotti naturali al fine di evitare l'impatto di effetti collaterali causati da farmaci sintetici e chimici.

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