Costituenti fenolici con attività antiossidante, inibitoria della tirosinasi e antietà da Dendrobium Loddigesii Rolfe

Astratto

Estratti acquosi con etanolo di steli in polvere di Dendrobium loddigesii hanno fornito tre nuovi composti fenolici tra cui tre -7-O-etil-9-O-(4-idrossifenil)propionil-diacilglicerolo (1), (R){{ 7}},5,4ʹ-triidrossi-3,3ʹ, -trimetossibibenzile (2) e (S)-5,5′,7-triidrossi-3′,4′ -dimetossifavanone (3), insieme a undici analoghi noti. Le loro strutture sono state determinate da un'ampia analisi spettroscopica. Per identificare antiossidanti naturali, agenti sbiancanti e anti-invecchiamento, è stata valutata la capacità di questi composti fenolici di eliminare il radicale 1,2-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH), la loro capacità di inibire la produzione di tirosinasi e le loro capacità di stimolare la produzione di collagene mediante dosaggio di fibroblasti cutanei umani-adulti (HDFa). È stato riscontrato che i composti 1, 4–8, 13 e 14 hanno mostrato significative attività di scavenging dei radicali DPPH, il composto 10 ha mostrato attività inibitoria della tirosinasi (IC50 37.904 ug/mL) e il composto 9 ha mostrato una significativa produzione di collagene con un valore EC50 di 3,182 ug/mL. Questi risultati suggeriscono che i costituenti fenolici di D. loddigesii possono essere candidati antiossidanti, sbiancanti per la pelle e/o agenti antietà.

Secondo studi pertinenti,cistancheè un comuneerbache è conosciuta come "l'erba miracolosa che prolunga la vita". Il suo componente principale ècistanoside, che ha vari effetti comeantiossidante, antinfiammatorio, Epromozione della funzione immunitaria. Il meccanismo tra cistanche esbiancamento della pellesta nell'effetto antiossidante diglicosidi di cistanche. La melanina nella pelle umana è prodotta dall'ossidazione ditirosinacatalizzata dalla tirosinasi e la reazione di ossidazione richiede la partecipazione di ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importante che influenza la produzione di melanina. Cistanche contiene cistanoside, che è un antiossidante e può quindi ridurre la generazione di radicali liberi nel corpoinibendo la produzione di melanina.

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Grafico astratto

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Parole chiaveDendrobium loddigesii · Costituenti fenolici · Antiossidante · Inibitore della tirosinasi · Antietà

1. Introduzione

Il genere Dendrobium (Orchidaceae) contiene circa 1500 specie a livello globale, di cui circa 80 specie crescono in Cina [1]. Gli steli di diverse piante di questo genere sono conosciuti come "Shi-Hu", che sono stati usati per migliaia di anni sia come medicina tradizionale cinese che come rimedi popolari per il trattamento di gastrite atrofica cronica, invecchiamento cutaneo, febbre, malattie cardiovascolari e un tonico per favorire la produzione di liquidi corporei [2]. Precedenti studi su questo genere hanno portato all'isolamento di una serie di polisaccaridi, composti fenolici, alcaloidi e sesquiterpenoidi [1, 3-5], alcuni dei quali possiedono varie bioattività tra cui antinfiammatorie [6], antimicrobiche [2], antiossidanti [7], antitumorale [8], antiaggregante piastrinico [9], immunomodulante [10] e contro le attività dell'influenza A [11].

Il Dendrobium loddigesii, un'erba epifita perenne, è ampiamente distribuito nell'area sud-occidentale della Cina, come le province di Guangxi, Guizhou e Yunnan [12]. Il suo stelo è stato applicato nella medicina popolare per trattare gastrite, febbre e vertigini [13]. Continuando la ricerca di prodotti naturali strutturalmente diversi e biologicamente attivi di questo genere [1, 5, 14-17], è stata condotta un'indagine approfondita sui costituenti farmacologicamente attivi di questa specie vegetale. Di conseguenza, tre nuovi composti fenolici (1-3) e undici noti (Fig. 1) sono stati isolati da un estratto etanolico all'80% dello stelo di D. loddigesii. L'isolamento, la delucidazione della struttura e la valutazione biologica di questi composti sono presentati qui.

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2 Risultati e discussione

Il composto 1, ottenuto come solido bianco, ha dato una formula molecolare di C21H26O7 determinata dallo ione (−)-HRESIMS a m/z 389,1602 [M−H]− (calcolato per C21H25O7, 389,16{{ 28}}6) con nove gradi di insaturazione. Lo spettro 1 H NMR di 1 contiene sette protoni aromatici a δH 6,85 (1H, d, J=1.7 Hz), 6,75 (1H, d, J=8.0 Hz), 6,68 (1H , dd, J = 8.0, 1.7 Hz), 7.01 (2H, re, J = 8.5 Hz) e 6.68 (2H, re, J = 8.5 Hz), suggerendo la presenza di un anello benzenico 1,3,4-trisostituito e di un anello benzenico 1,4-disostituito. Il suo spettro NMR 13C mostrava 21 risonanze di carbonio inclusi due metili (uno metossi), quattro metilene alifatico, nove metine (due sp3, sette sp2) e sei atomi di carbonio quaternari (uno carbonilico, cinque olefinici di cui tre ossigenati). Le correlazioni HMBC (Fig. 2) di H-7/C-1 (δC 131.6), C-2 (δC 111.7), C-6 (δC 121.4), C -8 (δC 74,2) e C-10 (δC 65,3); H-9/C-7 (δC 83,8) e C-8 (δC 74,2); H-10/C-11 (δC 15,6); 3-OMe (δH 3.81)/C-3 (δC 149.1), insieme alle correlazioni di H-7/H-8/H2-9 e H{{ 87}}/H3-11 dallo spettro 1 H–1 H COSY (Fig. 2) indicava la presenza di 7-O-etilguaiacilglicerolo [18]. È stato riportato che J7,8 era di circa 5 Hz per l'isomero eritro e 7 Hz per i tre isomeri nei casi di siringhe-gliceroli e derivati del diacilglicerolo. Pertanto, il composto 1 è stato considerato come i tre isomeri con J7,8 (6,5 Hz) [18]. Le correlazioni HMBC di H-7' (δH 2.79, t, J = 7.5 Hz)/C-8' (δC 37.1), C-1' (δC 132.7), C-2', 6' (δC 130.2) e C-9' (δC 174.6), H-8' (δH 2.59, t, J = 7.5 Hz)/C-7' (δC 31.0), C-1', e C-9', insieme a ACCOGLIENTI picchi incrociati di H-8'/H-7' indicati la presenza di acido p-idrossicumarico [19]. Sulla base delle prove sopra descritte, è stato proposto che 1 abbia una frazione 7-O-etilguaiacilglicerolo e un acido p-idrossi-cumarico tramite un legame estere. La correlazione HMBC da H-9 a C-9' ha suggerito che il legame estere fosse tra C-9 e C-9'. Pertanto, la struttura di 1 è stata determinata come mostrato.

(R){{0}},5,4'-Triidrossi-3,3',-trimetossibibenzile (2) è stato ottenuto come solido bianco. Lo spettro HRESIMS di 2 mostrava un picco di ioni quasimolecolari a m/z 319.1180 [M−H]− (calcolato per C17H19O6, 319.1187) con 8 gradi di insaturazione. Lo spettro 1 H NMR di 2 mostrava tre gruppi metossilici a δH 3,75 (3H, s), 3,7 0 (3H, s) e 3,17 (3H, s); un protone metina ossigenato a δH 4.13 (1H, t, J=6.8 Hz, H- ); due segnali di metilene a δH 2.73 (1H, dd, J=13.5, 6.9 Hz) e 2.96 (1H, dd, J=13.5, 6.9 Hz); e cinque protoni aromatici, che appaiono come un anello aromatico 1,3,4,5-tetrasostituito a δH 6.28 (1H, d, J=1.8 Hz) e 6.34 (1H, d, J{{ 60}}.8 Hz), e un anello aromatico 1,3,4-trisostituito a δH 6.49 (1H, d, J=2.0 Hz), 6.62 (1H, d, J=8.0 Hz) e 6.52 (1H, gg, J = 8.0, 2.0 Hz). Gli spettri 13CNMR e DEPT di 2 mostravano tre ossimetilene, un metilene, una metina ossigenata e 12 carboni aromatici (cinque ossigenati). Il confronto dei suoi dati NMR (Tabella 1) con quelli della dendrocandina C [20] ha mostrato grandi somiglianze ad eccezione della presenza di un altro gruppo metossilico, che era localizzato in C-3' dalle correlazioni HMBC da 3'-OMe e H-5' a C-3' (δC 148,4). Inoltre, le molteplici interazioni HMBC (Fig. 2) di 3-OMe e H-2/C -3 (δC 149,5); -OMe/C- (δC 86,9) ha suggerito gli altri gruppi metossilici in C-3 e C-, rispettivamente. La configurazione assoluta in C- è stata determinata come R sulla base della rotazione ottica negativa ([훼] 26 D –12.46), simile a D afillo [훼] 20 D –20.3, MeOH) [15]. Di conseguenza, la struttura di 2 è stata determinata come mostrato.

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(S){{0}},7,5′-Triidrossi-3′,4′-dimetossifavanone (3) è stato ottenuto come polvere gialla amorfa e aveva la molecola C17H16O7 (1{{69} } indici di carenza di idrogeno) secondo lo ione (−)-HRESIMS a m/z 331.0819 [M – H]− (calcd 331.0823). I massimi di assorbimento UV a 206 e 294 nm indicavano la presenza di un flavanone [21]. Lo spettro 1 H NMR (Tabella 1) ha mostrato tre segnali nella regione non aromatica posizionata a δH 5.29 (1H, dd, J=12.7, 3.1, H-2), 3.04 (1H, gg, J=17.1, 12.7, H{-3ax) e 2.71 (1H, gg, J=17.1, 3.1, H-3 eq), quattro protoni aromatici δH 5.87 (1H, d, J=2.2, H-6), 5.91 (1H, d, J=2.2, H-8), 6.62 (1H, d, J=2.0, H-2ʹ) e 6.61 (1H, d, J=2.0, H-6ʹ), due gruppi metossilici δH 3.83 (3H, s) e 3,77 (3H,s). Gli spettri 13C NMR e DEPT (Tabella 1) contengono risonanze per 17 atomi di carbonio inclusi due metossi, un metilene, una metina, un carbonio carbonilico e 12 carboni aromatici. L'analisi completa dei suoi dati NMR ha indicato che la sua struttura planare è strettamente correlata a quella della diidrotricina [22], ad eccezione delle risonanze OH-4' e OCH3-5' nella diidrotricina che sono state trasposte in 3. Ciò è stato confermato dall'incrocio di HMBC picchi (Fig. 2) da H-2ʹ, H-6ʹ, e OCH3-4ʹ a C-4ʹ (δC 137,7), da H-6ʹ a C-5ʹ (δC 151,8). La configurazione assoluta in C-2 è stata postulata essere nella forma S sulla base di un valore di rotazione specifica negativo (– 46.64, MeOH) nella sua rotazione ottica [23]. Pertanto, la struttura del composto 3 è stata quindi assegnata in modo inequivocabile come mostrato.

Undici composti noti sono stati identificati come trepidazione 4 [24], mescalina 5 [25], 4,5,4′-triidrossi- 3, 3′-dimetossibibenzil 6 [26], 4′,5- diidrossi-3,3′- dimetossibibenzil 7 [27], Tristin 8 [28], batatas in III 9 [27], 3,5,3′-idrossibibenzil 10 [29], aphyllous C 11 [15], dentiform A 12 [30], diidroconiferil diidro-p-cumarato 13 [31], p-idrossifenil trans-ferulato 14 [32] mediante analisi spettroscopiche e confrontando i loro dati spettrali con la letteratura.

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I composti fenolici, sono una parte essenziale della dieta umana e sono noti come potenti antiossidanti grazie alla loro potente azione di rottura della catena e possono contribuire direttamente all'attività antiossidante [33]. Il test DPPH radical scavenging è uno dei metodi più comuni e relativamente rapidi utilizzati per valutare l'attività antiossidante. I composti in grado di donare un atomo di idrogeno al radicale DPPH, e quindi dare origine alla forma ridotta di DPPH, saranno considerati potenziali agenti antiossidanti. Tutti i composti sono stati valutati per le loro attività di scavenging dei radicali DPPH. I risultati attuali (Tabella 2) hanno mostrato che la maggior parte dei composti fenolici (1, 4–8, 13 e 14) ha mostrato attività significative con capacità di scavenging che vanno dall'89,411 al 94,278 percento a 100 ug/mL.

D'altra parte, la tirosinasi è un enzima contenente rame e svolge un ruolo fondamentale nel controllo della via di biosintesi della melanina nei melanociti [34]. Pertanto, gli inibitori della tirosinasi sono diventati componenti importanti di cosmetici o prodotti medicinali per l'iperpigmentazione e lo sviluppo di agenti sbiancanti per la pelle. Nel presente studio, tutti gli isolati sono stati valutati per la loro attività inibitoria della tirosinasi (Tabella 2). L'acido cogico, un presunto agente schiarente per la pelle, è stato utilizzato come controllo positivo. Il 3,5,3′-idrossibibenzile (10) ha rivelato una significativa attività inibitoria con un valore IC50 di 37,904 ug/mL. Le afille C (11) hanno mostrato una moderata inibizione (IC50, 152,56 ug/mL). Tutti i restanti composti erano inattivi a concentrazioni fino a 200 ug/mL. In questo studio, si può concludere che i composti 10 e 11 possono essere un potenziale candidato per il trattamento delle malattie della pelle legate alla biosintesi della melanina.

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Considerando che questa specie è utilizzata in medicina per l'invecchiamento della pelle, poiché il collagene è fondamentale per la forza e l'elasticità della pelle e la sua degradazione porta alle rughe che accompagnano l'invecchiamento [35]. Pertanto, tutti i composti sono stati appositamente valutati anche per i loro effetti sulla produzione di collagene in HDFa. I risultati (Tabella 2) hanno mostrato che il composto 9 stimola in modo significativo l'attività di produzione di collagene HDFa (EC50 3.182 ug/mL). I composti 6 e 7 hanno mostrato attività più deboli, con una produzione di collagene rispettivamente del 33,062% e del 29,157% a 10 ug/mL. I risultati attuali non solo hanno supportato l'uso etnofarmacologico di D. loddigesii, ma hanno anche fornito un modello di struttura affidabile per lo sviluppo di malattie associate a carenza di collagene come ustioni e ulcere.

3 Sperimentale

3.1 Procedure sperimentali generali

La rotazione ottica è stata ottenuta su un polarimetro digitale JASCO P-1020 (Horiba, Tokyo, Giappone). Gli spettri UV sono stati misurati utilizzando uno spettrofotometro per PC Shimadzu UV-2401 (Shimadzu, Kyoto, Giappone). Gli spettri IR sono stati ottenuti su uno spettrofotometro a infrarossi Bruker Tensor 27 (Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Germania) con pellet KBr. Gli spettri di massa sono stati eseguiti su uno spettrometro API QSTAR time-of-fight (MDS Sciqaszex, Concord, Ontario, Canada) e LCMSIT-TOF (Shimadzu, Kyoto, Giappone). Gli spettri NMR sono stati registrati su strumenti DRX-500 e Av III-600 con TMS come standard interno (Bruker, Bremerhaven, Germania). Gli spostamenti chimici sono stati dati in δ (ppm) con riferimento al segnale del solvente. La cromatografia su colonna è stata eseguita su gel di silice (200–300 e 300–400 mesh, Qingdao Marine Chemical Inc., Qingdao, Cina), gel Lichroprep RP-18 (40–63 μm, Merck, Darmstadt, Germania), MCI gel CHP-20P (75–150 μm, Mitsubishi Chemical Corp., Tokyo, Giappone), Sephadex LH-20 (20–150 μm, Amersham Biosciences, Uppsala, Svezia) e YMC*GEL ODS -AHG (50 μm, YMC Co. Ltd. Giappone). Le frazioni sono state monitorate mediante TLC e le macchie sono state visualizzate mediante luce UV e spruzzate con il 10% di H2SO4 in EtOH, seguito dal riscaldamento. 1,1-difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH), Trolox, tirosinasi dei funghi, L-Dopa e acido Kojic sono stati acquistati da Sigma (USA); Il fattore di crescita trasformante beta (TGF-) è stato ottenuto da Peprotech (USA); I terreni di crescita DMEM (alto glucosio w/L-glut), la soluzione salina bilanciata di Hank, il siero bovino fetale sono stati acquistati da HyClone (USA); Il kit ELISA del peptide procollagene è stato ottenuto da TaKaRa (Giappone). Tutti gli altri prodotti chimici e solventi erano di grado analitico.

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3.2 Materiale vegetale

I gambi di D. loddigesii sono stati raccolti nel settembre 2014 dalla città di Wenshan, provincia dello Yunnan, Repubblica popolare cinese, e identificati dal professor Hong Yu (Università dello Yunnan, Kunming, Repubblica popolare cinese). L'esemplare del buono (n. 20.140.829) è stato depositato presso lo State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resource nella Cina occidentale, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences.

3.3 Estrazione e isolamento

I gambi essiccati e polverizzati (10.2 kg) di D. loddigesii sono stati estratti tre volte con 80 percento di etanolo a temperatura ambiente e concentrati a pressione ridotta. Quindi, il residuo è stato sospeso in H2O e ripartito con EtOAc per ottenere la frazione EtOAc (220 g), che è stata sottoposta a cromatografia su colonna di gel di silice eluita con un gradiente di etere di petrolio/acetone (da 15:1 a { {110}}:1) per permettersi 22 frazioni (Fr.1–22). Fr.11 (6 g) è stato sottoposto a gel di silice CC eluito con CHCl3/MeOH (300:1), quindi seguito da colonna MCI (gradiente MeOH/H2O, 60:40–95:5) e gel di silice CC (CHCl3/ MeOH, 200:1) per ottenere 12 (4 mg). Fr.13 (850 mg) è stato separato su una colonna di MCI (MeOH/ H2O, da 60:40 a 95:5) per dare cinque frazioni (Fr.13.1–Fr.13.5). Fr.13.4 (150 mg) ha fornito i composti 4 (3 mg) e 5 (5 mg) mediante preparazione HPLC (MeOH/H2O, 60:40). Fr.16 (19 g) è stato cromatografato su colonna di gel di silice eluita con CHCl3/MeOH (da 100:1 a 20:1) per fornire 6 sottofrazioni (Fr.16.1-Fr.16.6). Fr.16,4 (2,3 g) è stato applicato alla colonna MCI eluita con MeOH/H2O (50:50–100:0) e poi ulteriormente frazionata su una colonna di Sephadex LH-20 (MeOH/ H2O, 90:10) a resa 7 (716 mg) e 13 (39 mg). Utilizzando le stesse condizioni di Fr.16.4, Fr.16.6 (240 mg) si ottiene il composto 9 (7 mg). Fr.18 (10 g) è stato separato da gel di silice CC (CHCl3/MeOH, 100:1–20:1), quindi passato attraverso MCI (gradiente MeOH/H2O, 50:50–100:0) e Sephadex LH{{ 96}} (MeOH/H2O, 90:10) per produrre 3 (25 mg) e 11 (4 mg). Fr.19 (20 g) è stato sottoposto a una colonna MCI eluita con MeOH/H2O (30:70–100:0) per ottenere sette frazioni (Fr.19.1–Fr.19.7). Fr.19,5 (2,3 g) è stato separato mediante colonna ripetuta di gel di silice (CHCl3/MeOH, 30:1) per fornire 8 (15 mg) e 10 (7 mg). Fr.19.6 (4.3 g) è stato frazionato su una colonna di gel di silice (CHCl3/MeOH, 30:1) per dare 5 frazioni (Fr.19.6.1– Fr.19.6.5). Fr.19.6.1 (1,2 g) è stato sottoposto a colonna di gel di silice (CHCl3/MeOH, 30:1) e dopo purificazione mediante HPLC (MeOH/H2O, 45:55), fornendo 1 (15 mg). Fr.19.6.3 (540 mg) è stato applicato a una colonna di Sephadex LH-20 eluita con MeOH/H2O (90:10) e quindi ulteriormente purificata mediante HPLC semipreparativa (MeOH/H2O, 45:55) fornire 2 (6 mg) e 6 (5 mg). Fr.20 (12 g) è stato applicato a una fase cromatografica su gel MCI (MeOH/H2O, 30:70–100:0) e quindi è stato sottoposto a gel di silice CC (CHCl3/MeOH, 30:1) per dare 14 (21 mg).tre{{0}}O-etil-9-O-(4-idrossifenil) propionil-diacilglicerolo (1): solido bianco; [ ] D 26 – 3,72 (c 0,51, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 203 (4,53), 225 (4,17), 280 (3,66) nm; IR (KBr)νmax 3426, 1727, 1516, 829 cm-1; 1 H e 13C NMR (CD3OD), vedere Tabella 1; ESIMS m/z 389 [M−H]−, HRESIMS m/z 389.1602 [M−H]− (calcolato per C21H25O7, 389.1606).

(R)-4,5,4′-Triidrossi-3,3', -trimetossibibenzil (2): polvere bianca amorfa; [ ] D 26 –12,46 (c 1,07, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 204 (4,59), 286 (3,75) nm; IR (KBr) νmax 3418, 1607, 1517, 1455, 1434, 796 cm-1; 1 H e 13C NMR (CD3OD), vedere Tabella 1; ESIMS m/z 319 [M−H]−, HRESIMS m/z 319.1180 [M−H]− (calcolato per C17H19O6, 319.1187).

(2S)-5,7,3'-Triidrossi-6,4,5-trimetossifavone (3): polvere gialla amorfa; [ ]Re 26 – 46,64 (c 0,46, MeOH); UV (MeOH) λmax (log ε) 206 (4,70), 294 (4,17) nm; IR (KBr) νmax 3335, 2940, 1641, 1514, 1462, 1345, 1434, 1182, 1091, 998, 833 cm-1; 1 H e 13C NMR (CD3OD), vedere Tabella 1; ESIMS m/z 331 [M−H]−, HRESIMS m/z 331.0819 [M−H]− (calcolato per C17H15O7, 331.0823).

3.4 Analisi dell'attività di scavenging radicale DPPH

Il saggio dell'attività di scavenging dei radicali liberi è stato effettuato secondo il metodo precedente [36] con alcune modifiche. In breve, 30 campioni μL (1000 ug/mL, disciolti in etanolo) e Trolox (1 mM) sono stati aggiunti a 270 μL di soluzione DPPH (100 μM, sciolti in metanolo), rispettivamente. La reazione è proseguita per 1 ora a 37 gradi su una micropiastra a 96-pozzetti. L'assorbanza è stata quindi letta a 515 nm e la percentuale dell'attività totale di radical scavenging è stata calcolata utilizzando la seguente formula: percentuale di inibizione =[(A0− A1)/A0]×100 percento , dove A0 è l'assorbanza del DPPH senza campioni (reazione di controllo) e A1 è l'assorbanza di DPPH incubato con i campioni. Tutti i test sono stati condotti in triplicato e Trolox è stato utilizzato come agente di controllo positivo.

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3.5 Saggio inibitorio della tirosinasi dei funghi

L'inibizione dell'attività della tirosinasi è stata determinata spettrofotometricamente secondo il metodo precedentemente descritto [36] con alcune modifiche. In breve, diverse concentrazioni di composti di prova sono state preparate in 10 percento di DMSO. Ciascuna soluzione del campione (20 μM) è stata miscelata con L-Dopa (1,25 mM) e diluita con 970 μL di 0,05 mM di tampone fosfato di sodio (PBS, pH 6,8) nelle provette. La reazione è stata avviata aggiungendo tirosinasi di fungo (25 U/mL). La miscela di reazione è stata incubata per 5 minuti a temperatura ambiente. La quantità di Dopachrome nella miscela è stata determinata misurando l'assorbanza di ciascun pozzetto a 490 nm. L'acido cogico è stato utilizzato come controllo positivo. La percentuale di inibizione della tirosinasi è stata calcolata secondo la seguente equazione: Inibizione percentuale=[(A0− A1)/A0] × 100 percento , dove A0 è l'assorbanza del dopacromo senza i composti in esame (reazione di controllo) e A1 è l'assorbanza del dopacromo incubato con i composti in esame.

3.6 Produzione di collagene mediante HDFa Assay

La linea cellulare HDFa è stata ottenuta da Cascade Biologics. Le cellule HDFa sono state seminate in {{0}}pozzetti contenenti DMEM con l'10 percento di FBS in un'atmosfera umidificata con il 5 percento di CO2 a 37 gradi . Dopo 24 ore di incubazione, le cellule sono state trattate con i campioni di prova per 72 ore (37 gradi, 5 percento di CO2). Il TGF- è stato utilizzato come controllo positivo. Il terreno (50 μL) è stato raccolto da ciascun pozzetto e congelato a -80 gradi fino a quando non è stato analizzato con un kit ELISA del peptide procollagene. La concentrazione di pro-collagene è stata ottenuta misurando l'assorbanza a 450 nm sul lettore di micropiastre. Rimuovere tutti i supporti dalle cellule e aggiungere 100 µ l di reagente MTS diluito in ciascun pozzetto. La reazione è stata incubata per 40 minuti a 37 gradi. L'assorbanza è stata misurata a 490 nm con un lettore di micropiastre. La percentuale aumentata di produzione di collagene I è stata calcolata in base alla seguente equazione: vitalità cellulare ( percentuale )=(campione OD490 medio/controllo OD490 medio); un aumento della percentuale di produzione di collagene=(A1/B/A0 − 1) × 100 percento . Dove A1 è l'assorbanza con i campioni, A0 è l'assorbanza senza campioni (reazione di controllo) e B è la vitalità cellulare.

Ringraziamenti Questo progetto è stato sostenuto finanziariamente dal Dipartimento provinciale di scienza e tecnologia dello Yunnan (n. 2017ZF003-04, 2015HB093 e 2019HA001). Gli autori sono grati allo staff del gruppo analitico dello State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, per le misurazioni di tutti gli spettri.

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Rispetto degli standard etici

Conflitto d'interesseNessun potenziale conflitto di interessi è stato segnalato dagli autori in questo manoscritto.

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Riferimenti

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