Oligoglicosidi feniletanoidi e oligozuccheri acilati con attività vasorilassante da Cistanche Tubulosa

per ulteriori informazioni:ali.ma@wecistanche.com

Masayuki Yoshikawa et al

Astratto

L'estratto metanolico dagli steli essiccati diCistanche tubulose(Schrenk) R. Wight ha mostrato un effetto inibitorio sulle contrazioni indotte dalla noradrenalina in strisce aortiche di ratto isolate. Dall'estratto sono stati isolati nuovi costituenti feniletanoidi aminoglicosidi, kancanosidi F e G, e un oligozucchero acilato, kankanose, insieme a 14 composti noti. Le strutture di questi nuovi composti sono state determinate sulla base delle loro evidenze chimiche e fisico-chimiche. Inoltre, i costituenti principali, kankanoside F, kankanose, echinacoside, acteoside e cistanoside F, hanno mostrato attività vasorilassante e sono stati chiariti diversi requisiti strutturali per l'attività. 2006 Elsevier Ltd. Tutti i diritti riservati.

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introduzione

La pianta parassita delle Orobanchaceae,Cistanche tubulose(Schrenk) R. Wight, è ampiamente distribuito in Nord Africa, Arabia e paesi asiatici e le radici diCistanche tubulose, così come C. salsa e C. deserticola, sono stati tradizionalmente usati come agente promotore della circolazione sanguigna e trattamento di impotenza, sterilità, lombalgia, debolezza corporea e tonico.2,3 Nel corso dei nostri studi di caratterizzazione sui costituenti bioattivi di origine cinese medicinali,1,4–14 abbiamo riportato l'isolamento e la delucidazione della struttura di cinque iridoidi, kancanosidi A–D e kankanol, e un monoterpeneglicoside, kankanoside E, insieme a 16 composti noti dagli steli diCistanche tubulose1 Come continuazione dello studio su questo medicinale a base di erbe, è stato riscontrato che l'estratto tetanolico mostra un effetto inibitorio sulle contrazioni indotte dalla noradrenalina in strisce aortiche toraciche isolate di ratto. Da questo estratto metanolico, abbiamo inoltre isolato oligoglicosidi feniletanoidi, kancanosides F (1) e G (2) e oligozucchero anacilato, kankanose (3) e 14 composti noti, echinacoside (4), acteoside (5), isoacteoside (6 ),20-acetilatteoside (7), tubuloside A (8) e B (9), cistanoside F (10), salidroside (11), (2R,3R)-butano-2,{{18 }}diolo 2-ObD-glucopiranoside,Meso-butano-2,3-diolo2-ObD-glucopiranoside, etil bD-glucopiranoside,3-metil butanolo bD-glucopiranoside, ( più )-pinoresinolo40-ObD -glucopiranoside e ( più )-siringaresinolo 40-ObD-glucopiranoside. Questo articolo si occupa della delucidazione della struttura di nuovi composti (1–3) e degli effetti vasorilassanti dei principali costituenti (1, 3–6, 10 e 11) sulle contrazioni indotte da strisce aortiche di ratto isolate con noradrenalina sulla base dell'applicazione tradizionale per circolazione sanguigna (Fig. 1).

risultati e discussione

2.1. Effetto vasorilassante dell'estratto metanolico dai gambi diCistanche tubulosesulla contrazione indotta dalla bynoradrenalina nell'aorta toracica isolata di ratto

Come mostrato nella tabella 1, l'estratto metanolico dai gambi diCistanche tubulose(acquistato a Urumqi, provincia dello Xinjiang, Cina) è risultato mostrare un'attività vasorilassante sulle contrazioni indotte dalla noradrenalina nelle strisce aortiche di ratto isolato, in funzione del tempo e della concentrazione(30–3{{10}} 0 lg/ml). L'estratto metanolico è stato ulteriormente purificato mediante cromatografia su colonna in fase normale e inversa e infine HPLC per dare 1 ({22}}.016 percento), 2({28}}.{{31} }25 percento), 3 ({34}}.020 percento), 4 (3.{59}}9 percento),3 5 ({64} },68 percento ),3 6(0.096 percento ),3 7 (0,017 percento ),3 8 (0,052 percento),3 9 (0,0036 percento),3 10(0,025 percento),15 11 (0,044 percento),16 (2R,3R)-butano-2,{{44 }}diolo2-ObD-glucopiranoside (0,0087 percento),17 meso-butano-2,3-diolo 2-ObD-glucopiranoside (0,0065 percento),17 etilb-D- glucopiranoside (0,055 percento),17 3-metilbutanolo bD-glucopiranoside (0,0030 percento),17 (più)-pinoresinolo 40-ObD-glucopiranoside (0,016 percento),18 e (più)-siringaresinolo{{81} }ObD-glucopiranoside (0,022 percento).15

2.2. Strutture dei kancanosidi F (1) e G (2)

Kankanoside F (1) è stato ottenuto come polvere bianca con rotazione ottica negativa (½a -28D -44.8- in MeOH). Lo spettro IR di 1 ha mostrato bande di assorbimento a156{{69} }, 1508 e 1458 cm-1 attribuibili a un anello aromatico e a forti bande di assorbimento a 3432, 1075 e 1044 cm-1, indicative di una struttura aminoglicosidica. FAB-MS a ioni negativi di 1, picchi di ioni quasimolecolari sono stati osservati a m/z 647 (M più Na) più e 623 (MH) e l'analisi FAB-MS ad alta risoluzione ha rivelato che la formula molecolare di 1 è C26H40O17. Gli spettri 1H e 13C NMR (CD3OD,Tabella 2) di 1, assegnati da vari esperimenti NMR,19 hanno mostrato segnali assegnabili a duemetileni [d 2,78 (2H, m, H{35}}), 3,70, 4.{{ 39}} (1H ciascuno, entrambi m, H2-8)] e protoni aromatici di tipo ABC orto e meta-accoppiati [d 6,56 (1H, dd, J=1.9,7,9 Hz, H-6), 6,67 (1H, re, J=7,9 Hz, H{58}}), 6,69(1H, re, J=1,9 Hz, H{ {64}})] insieme a tre frazioni di glucopiranosio [d 4,30 (1H, d, J=8.0 Hz, H{70}}), 4,37(1H, d, J=8. 0 Hz, H{76}}), 5,16 (1H, br s, H-100)]. La struttura del theaminoglicoside in 1 è stata caratterizzata dall'esperimento di connettività a legame multiplo eteronucleare (HMBC), che ha mostrato correlazioni a lungo raggio tra le seguenti coppie di protoni e carbonio (H-10 e C-8; H-100 e C-30; H-1000 e C-60) come mostrato nella Figura 2. Deacilazione enzimatica dell'echinacoside (4), la cui stereostruttura assoluta è stata riportata in precedenza,3 con tannasi13,14 ha dato 1. Sulla base delle prove sopra menzionate, la struttura del kankanoside F è stata determinata essere 2-(3,4- diidrossifenil)etil OaL-ramnopiranosil(1-3)[bD-glucopiranosil(1-6)]-b-D-glucopiranoside (1).

Anche il kankanoside G (2) è stato ottenuto come polvere bianca con rotazione ottica negativa (½a-26D-35.0-in MeOH). Lo spettro IR di 2 mostrava bande di assorbimento a3432, 1709, 1638, 1518, 1447 e 1040 cm-1, ascrivibili a funzioni idrossile, estere coniugato carbonile e etere e anello aromatico. La formula molecolare, C29H36O14, di 2 è stata determinata dallo ione positivo e negativo FAB-MS [m/z 631 (M più Na) più e 607(MH)-] e dal FAB-MS ad alta risoluzione. La deacilazione enzimatica di 2 con tannasi ha prodotto cistanoside G(12), la cui stereostruttura assoluta è stata riportata in precedenza.16 Su idrolisi alcalina di 2 con idrossido di potassio acquoso al 10% (KOH)—50% acquoso di 1,{32}}diossano (1:1, v/v), l'acido caffeico è stato identificato mediante analisi HPLC. Gli spettri 1H e 13C NMR (CD3OD, Tabella2)19 di 2 indicavano la presenza delle seguenti funzioni: 4-parte di alcol idrossifeniletilico {duemetileni [d 2,82 (2H, m, H{45}}), 3,70, 3,96 ( 1H ciascuno, entrambi m, H{51}})] e protoni aromatici di tipo A2B{54}}ortoaccoppiati [d 6,65, 7,03 (2H ciascuno, entrambi d, J=8.6 Hz,H{ {62}},5 e H-2,6)]} e due frazioni di glucopiranosio [d4.33 (1H, d, J=7.9 Hz, H{71}}), 5.19 (1H, br s, H-100)]insieme a una frazione caffeoile {una trans-olefina [d 6.29,7.56 (1H ciascuno, entrambi d, J=15.9 Hz, H{{84 }} e H-7)] e diidrossibenzene di tipo pirocatecolo [d 6,78 (1H, d,J=8,3 Hz, H-5), 6,89 (1H, dd, J {{ 96}}.9, 8,3 Hz, H-6),7,04 (1H, re, J=1.9 Hz, H-2)]}. Nell'esperimento HMBC su 2, è stata osservata una correlazione a lungo raggio tra il 60-protone [d 4,36 (1H, dd, J=6.1, 11,6 Hz),4,50 (dd, J {{ 119}}.8, 11,6 Hz)] e il caffeoil carbonilcarbonio (dC 169,1). Di conseguenza, la struttura del kankanoside G è stata determinata essere 4-idrossifenil-OaL-ramnopiranosil(1 ! 3)-(6-O-caffeoil)-bD-glucopiranoside (2).

2.3. Struttura del kancanosio (3)

Anche Kankanose (3), ½a- 27D-35.3- (MeOH), è stato ottenuto come polvere bianca. Lo spettro IR di 3 ha mostrato bande di assorbimento a 343{{30}}, 1702, 1639, 1611, 1458 e 1071 cm-1, attribuibili a idrossile, estere coniugato carbonile e funzioni eteree e anello aromatico. Gli ioni positivi e negativi FAB-MS di 3 hanno mostrato picchi di ioni quasimolecolari rispettivamente a m/z 673 (M più Na) più em/z 649 (MH). Il FAB-MS ad alta risoluzione di 3 ha rivelato che la formula molecolare è beC27H38O18. Idrolisi alcalina di 3 con 10 percento di KOH–50 percento acquoso di 1,{28}}acido caffeico liberato da diossano, identificato mediante analisi HPLC, insieme a un oligozucchero. L'idrolisi acida di questo oligo zucchero con acido cloridrico 1,0 (HCl) ha liberato L-ramnosio e D-glucosio, che sono stati identificati mediante analisi HPLC utilizzando un rivelatore di rotazione ottico.1,13,14 Gli spettri 1H e 13CNMR (CD3OD, Tabella 3)19 di 3 ha mostrato segnali assegnabili alla frazione trisaccaride {d [5.11 (d, J=3.4 Hz), 4.57 (d, J=7.9 Hz), miscela di forma a e b di H{ {52}} (ca. 1:1)], 4.25, 4.27 (entrambi d, J{59}}.7 Hz, H-1000), 5.13, 5.18 (entrambi br s, H{66 }})} insieme a un gruppo caffeoile [d 6,28, 6,29 (entrambi d, J=15.9 Hz, H{73}}), 6,78 (d,J=8.0 Hz, H -5), 6,96 (gg, J=2.0, 8,0 Hz, H{85}}), 7,06(d, J=2.0 Hz, H{90} }), 7,60 (d, J=15.9 Hz, H-7)]. Negli esperimenti dell'HMBC su 3, sono state osservate correlazioni a lungo raggio tra il 40-protone [d 5,04, 4,99 (entrambi dd, J=9.5, 9,8 Hz)] e il carbonio caffeoil carbonilico (dC168,53 , 168.65). Sulla base delle prove sopra menzionate, la struttura del kankanose è stata chiarita in bea-L-rhamnopyranosyl(1-3)[bD-glucopyranosyl(1-6)]-O-(4- O-caffeoil)-D-glucopiranosio (3).

2.4. Effetto vasorilassante dei principali costituenti (1, 3–6,10, 11) daCistanche tubulosesulla contrazione indotta da noradrenalina e alto K plus nell'aorta toracica isolata di ratto

Come mostrato in Tabella 4 e Figura 3, effetti inibitori dei principali costituenti, kankanoside F (1) e kankanose (3), echinacoside (4), acteoside (5), isoacteoside (6), cistanoside F (10) e salidroside ( 11) sono state esaminate le contrazioni indotte dalla noradrenalina nell'aorta toracica isolata di ratto. Di conseguenza, i composti 3–5 e 10 che hanno un gruppo caffeoile nella posizione 40- hanno inibito significativamente le contrazioni, in base al tempo e/o alla concentrazione (10–100 lM), mentre 6 hanno il 60- La frazione O-caffeoil ha mostrato un'attività debole rispetto a 4 e 5. D'altra parte, il composto 1 con un gruppo catecolo ha mostrato un'inibizione significativa, ma 11 con un gruppo fenolico non ha mostrato tale effetto. Questi risultati ci hanno portato a presumere che la parte 40-O-caffeoil e la parte 10-O-diidrossifenetile siano essenziali per l'attività vasorilassante. D'altra parte, i composti 1, 3-6 e 10 (100 lM) non hanno mostrato alcun effetto sulle contrazioni indotte da un'elevata concentrazione di catione potassio (alto K plus) diverso dalla nifedipina, un calcio-antagonista voltaggio-dipendente, nel stessi tessuti (dati non mostrati). Questa scoperta ha suggerito che questi costituenti attivi inibivano le contrazioni attraverso il canale del calcio operato dal recettore, ma non attraverso il canale del calcio voltaggio-dipendente. Recentemente, Iizuka et al. hanno riferito che un feniletanoide, la forsitiaside, dal frutto di Forsythia suspensa ha inibito le contrazioni indotte dalla noradrenalina nelle preparazioni dell'anello aortico di ratto e hanno suggerito che l'inibizione da parte della forsiziaside della contrazione indotta dalla noradrenalina è in parte dovuta a una diminuzione della contrazione indotta dalla noradrenalina afflusso di calcio.20 Tuttavia, nel presente studio, gli effetti rilassanti dei costituenti attivi sono stati osservati ca. 30 minuti dopo l'aggiunta di noradrenalina in modo diverso da quello di prazosina, un'adrenalina un{42}}antagonista del recettore. I meccanismi d'azione dei costituenti attivi devono essere ulteriormente approfonditi.

3. Sperimentale

3.1. Procedura sperimentale generale

Per ottenere i dati fisici sono stati utilizzati i seguenti strumenti: rotazioni specifiche, polarimetro digitale Horiba SEPA-300 (l=5 cm); Spettri UV, spettrometro Shimadzu UV-1600; spettri IR, spettrometro Shimadzu FTIR-8100; spettri 1H NMR, spettrometro JEOL JNM-LA500 (500 MHz); Spettri NMR 13C, spettrometro JEOLJNM-LA500 (125 MHz) con tetrametilsilano come standard interno; spettrometro di massa FABMS e HR-FAB MS, JEOL JMS-SX 102A; Rilevatore HPLC, Shimadzu RID-6Un indice di rifrazione e rilevatori UV-vis SPD 10A. Le colonne HPLC, YMC-PackODS-A (250 · 4,6 mm id) e (250 · 20 mm id) sono state utilizzate rispettivamente per scopi analitici e preparativi

Per la cromatografia sono state utilizzate le seguenti condizioni sperimentali: cromatografia su colonna di gel di silice in fase normale, gel di silice BW-200 (Fuji Silysia Chemical, Ltd, 150–350 mesh); cromatografia su colonna su gel di silice a fase inversa, Chromatorex ODS DM1020T (FujiSilesia Chemical, Ltd, 100–200 mesh); TLC, piastre TLC prerivestite con gel di silice 60F254 (Merck, 0,25 mm) (fase normale) e gel di silice RP-18 F254S (Merck, 0,25 mm) (fase inversa); HPTLC a fase inversa, piastre TLC prerivestite con gel di silice RP-18 WF254S(Merck, 0,25 mm); il rilevamento è stato ottenuto spruzzando con l'1% di Ce(SO4)2–10% di H2SO4 acquoso, seguito da riscaldamento.

Cistanche tubulose

3.2. Materiale vegetale

Gambi secchi diCistanche tubulosesono state acquistate a Urumqi, provincia dello Xinjiang, Cina, nel gennaio 2005 tramite EishinTrading Co., Ltd, Osaka, Giappone, come descritto in precedenza.1

3.3. Estrazione e isolamento

Frazioni {{0}} (590 mg), 2-1 (466 mg), 2-3 (3931 mg), 3-3(3610 mg), 3-4 (190 mg), 4-5 [=echinacoside (4, 2595 mg, 0,44 percento)], 4-6 (1635 mg), 5-2 (1114 mg), {{ 20}} (306 mg), 5-4(347 mg), 5-5 (=4, 1620 mg, 2,03 percento) e 5-6 (1453 mg) sono stati ottenuti da l'estratto metanolico degli stemsofCistanche tubulosecome riportato in precedenza.1 La frazione 1–2(590 mg) è stata purificata mediante HPLC [MeOH/H2O (35:65,v/v)] per dare 3-metilbutanolo bD-glucopiranoside(18 mg , 0.0030 percento), (più)-pinoresinolo 40-anoside ObD-glucopir (96 mg, 0. 016 percento) e ( più )-siringaresinolo 40-O bD-glucopiranoside (129 mg, 0.022 percento) insieme a cistanoclorina (21 mg, {{ 76}}.{{80}}035 percento). La frazione 2-1 (466 mg) è stata separata mediante HPLC [MeOH/H2O (5:95, v/v)] per dare (2R,3R)-butano-2,{{40 }}diolo 2-ObD-glucopiranoside(12 mg, {{1{{108}}4}}.0087 percento), (2R, 3S)-butano-2,3-diolo 2-ObD glucopiranoside (9 mg, 0.0065 percento) ed etile bD -gluco piranoside (76 mg, 0.055 percento) insieme a uridina(0.0069 percento). La frazione 2-2 (535 mg) è stata purificata mediante HPLC [MeOH/H2O (5:95, v/v)] per ottenere salidroside (11, 41 mg, 0,022 percento) insieme ad antirride (15 mg, 0,0079 percento) e{78}}desossicatalpolo (214 mg, 0,11 percento). La frazione 2-3(535 mg) è stata separata mediante HPLC [MeOH/H2O (5:95, v/v)] per fornire 11 (17 mg, 0,022 percento) insieme al lato gluro (110 mg, 0,14 percento) e bartsioside (164 mg, 0,21 percento). La frazione 3-3 (510 mg) è stata sottoposta a HPLC [MeOH/H2O (40:60, v/v)] per dare acteoside (5, 257 mg, 0,31 percento), isoacteoside (6, 79 mg, 0,096 percento) e 20-acetilacteoside (7, 14 mg, 0,017 percento). La frazione 3-4 (190 mg) è stata ulteriormente purificata mediante HPLC [MeOH/H2O (40:60, v/v)] per dare kankanoside G (2, 17 mg, 0,0029 percento) e tubuloside B(9, 21 mg, 0,0036 per cento ). La frazione 4-6 (75 mg) è stata purificata mediante HPLC [MeOH/H2O (35:65, v/v)] per ottenere 5 (18 mg, 0,065 percento). La frazione 5-2 (1114 mg) è stata sottoposta a HPLC[MeOH/H2O (10:90, v/v)] per dare 2 (24 mg, 0,030 percento). La frazione 5-3 (306 mg) è stata purificato mediante HPLC [MeOH/H2O (15:85, v/v)] per dare kankanoside F (1, 13 mg, 0,016 percento). La frazione 5-4 (347 mg) è stata sottoposta a HPLC [MeOH/H2O (10:90, v/v)] per dare kankanose (3, 30 mg, 0,038 percento) e cistanoside F (10, 20 mg, 0,025 per cento ). La frazione5-6 (530 mg) è stata purificata mediante HPLC [MeOH/H2O (35:65, v/v)] per ottenere 4 (185 mg, 0,62 percento), 5 (91 mg, 0,30 percento) e tubuloside A (8, 16 mg, 0,052 percento).

3.3.1. Kancanoside F (1).

Una polvere bianca, ½a{{0}}D -44.8- (c0,50, MeOH). Ioni positivi ad alta risoluzione FAB-MSm/z: Calcd per C26H40O17Na (M più Na) più, 647.2163.Trovato: 647.2160. UV [MeOH, nm (log e)]: 224 (3,83),283 (3,37). IR (KBr): 3432, 2940, 1560, 1508, 1458,1075, 1044 cm-1. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) d: dati nella tabella 2. Dati 13C NMR (125 MHz, CD3OD) dC: dati nella tabella 2. FAB-MS a ioni positivi m/z: 647 (M più Na) più . Ioni negativi FAB-MS m/z: 623 (MH), 477 (M-C6H11O4)-, 623 (M-C6H11O5)-, 623(M-C12H21O9)-.

3.3.2. Kancanoside G (2).

Una polvere bianca, ½a{{0}}D -35.0-(c 0,80, MeOH). Ioni positivi ad alta risoluzione FAB-MSm/z: Calcd per C29H36O14Na (M più Na) plus, 631.2003.Trovato: 631.1996. UV [MeOH, nm (log e)]: 329 (4,10).IR (KBr): 3432, 2924, 1709, 1638, 1518, 1447, 1264,1040 cm-1. 1H NMR (500 MHz, CD3OD) d: dati nella tabella 2. Dati 13C NMR (125 MHz, CD3OD) dC: dati nella tabella 2. FAB-MS a ioni positivi m/z: 631 (M più Na) più .ioni negativi FAB-MS m/z: 607 (MH)-, 461(M-C6H11O4).

3.3.3. Kancanosio (3).

Una polvere bianca, ½a{{0}}D -35.3- (c0,50, MeOH). Ioni positivi ad alta risoluzione FAB-MSm/z: Calcd per C27H38O18Na (M più Na) plus, 673.1956.Trovato: 673.1959. UV [MeOH, nm (log e)]: 219 (4,10),247 (3,96), 333 (4,21). IR (KBr): 3430, 2962, 1702,1639, 1611, 1458, 1264, 1071 cm-1. 1H NMR(500 MHz, CD3OD) d: dati nella tabella 3. Dati 13C NMR (125 MHz, CD3OD) dC: dati nella tabella 3. FAB-MS a ioni positivi m/z: 673 (M più Na) più . Ioni negativi FABM-Sm/z: 649 (MH), 487 (M-C9H8O3)-, 325(M-C15H18O8)-.

Cistanche tubulose

3.4. Deacilazione enzimatica di 2 e 4 con tannasi

Una soluzione di 2 (4,8 mg, 0.008 mmol) in H2O (1.0 ml) è stata trattata con tannasi (3,7 mg, da Aspergillus oryzae , Wako Pure Chemical Ind., Ltd, Osaka, Giappone) e la soluzione è stata agitata a 37 gradi per 24 ore. Dopo che EtOH è stato aggiunto alla miscela di reazione, il solvente è stato rimosso a pressione ridotta e il residuo è stato purificato mediante HPLC [MeOH/H2O (35:65, v/v)] per fornire cistanoside G (12, 2,8 mg, 80 percento).16 Attraverso una procedura simile, una soluzione di 4 (9,2 mg, 0,012 mmol) in H2O (2,0 mL) è stata trattata con tannasi (7,5 mg) e la soluzione è stata agitata a 37 gradi per 24 ore. Il trattamento della miscela di reazione come descritto sopra ha dato un residuo, che è stato purificato mediante HPLC [MeOH/H2O (15:85, v/v)] per fornire 1 (4,7 mg, 62 percento).

3.5. Idrolisi alcalina e acida di 2 e 3

Una soluzione di 2 e 3 (ciascuna 3,5 mg) in 50 percento acquoso di 1,4-diossano (1.{11}} ml) è stata trattata con 10 percento di KOH acquoso (1.{{30}} ml) e il tutto è stato agitato a 37°C per 1 ora, rispettivamente. La rimozione del solvente a pressione ridotta ha dato una miscela di reazione, che è stata sottoposta ad analisi HPLC [colonna: YMC-Pack ODS-A,250 · 4,6 mm id; fase mobile: MeOH/H2O (30:70, v/v); rilevamento: UV (254 nm); portata: 1,0 ml/min] per identificare l'acido caffeico (tR: 13,1 min). Quindi la miscela di reazione da 3 è stata sciolta in HC1 1 M (2,0 mL) e riscaldata a riflusso per 3 ore. Dopo raffreddamento, la miscela di reazione è stata estratta con EtOAc. Lo strato acquoso è stato sottoposto ad analisi HPLC nelle seguenti condizioni, rispettivamente: colonna HPLC, KaseisorbLC NH2-60-5, 250 · 4,6 mm d.i. (Tokyo Kasei Co., Ltd, Tokyo, Giappone); rilevamento, rotazione ottica [ShodexOR-2 (Showa Denko Co., Ltd, Tokyo, Giappone); fase mobile, CH3CN/H2O (85:15, v/v); portata 0,8 ml/min]. L'identificazione di L-ramnosio e D-glucosio presenti nello strato acquoso è stata effettuata confrontando il loro tempo di ritenzione e rotazione ottica con quelli di campioni autentici, tR: 9,9 min (L-ramnosio, rotazione ottica negativa) e 17,9 min (D-glucosio, rotazione ottica positiva).

3.6. Attività vasorilassante

3.6.1. Preparazione dei tessuti.

Ratti maschi Sprague-Dawley del peso di 250–350 g sono stati sacrificati recidendo entrambe le arterie carotidee in anestesia e l'aorta toracica è stata isolata e tagliata in strisce elicoidali (2–3 mm ·15–2{25 }} mm). La soluzione salina fisiologica conteneva NaCl (118,0 mM), KCl (4,7 mM), KH2PO4 (1,2 mM), MgSO4 (1,2 mM), CaCl2 (2,5 mM), NaHCO3 (25,0 mM) e D-glucosio (10,0 mM). La soluzione è stata aerata con una miscela di gas dal 95% di O2 al 5% di CO2 e mantenuta a 37 gradi. Per studiare la risposta meccanica, ogni preparato è stato sospeso in un bagno d'organo (6 ml) e sottoposto ad un carico iniziale di circa 1 g. È stata consentita un'ora di equilibrationperiod prima dell'inizio degli esperimenti. Le contrazioni sono state misurate isometricamente tramite un trasduttore forza-spostamento (AD Instruments) e registrate su un poligrafo.

3.6.2. Effetto inibitorio sulla contrazione indotta da dl-noradrenalina o alto K plus.

Dopo l'equilibrio, al bagno è stato aggiunto dl-nor-adrenalina (concentrazione finale: 1 lM) o 3 M KCl(0.1 mL, concentrazione finale di K più: 54 mM). I tessuti sono stati lavati tre volte e riequilibrati dopo che la contrazione aveva raggiunto il livello massimo. La contrazione prolungata è stata nuovamente indotta dall'aggiunta di dl-noradrenalina o KCl, quindi il composto in esame è stato applicato a 10–100 lM (noradrenalina) o 100 lM (alto K più). La risposta contrattile prima dell'applicazione del campione di prova era del 100%. Prazosina cloridrato e nifedipina sono stati usati come composti di riferimento.

3.6.3. Analisi statistica.

I valori sono espressi come medie± SEM. Per l'analisi statistica è stata utilizzata un'analisi della varianza unidirezionale seguita dal test di Dunnett per l'analisi di confronto multiplo. I valori di probabilità (p) inferiori a0.05 sono stati considerati significativi.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata dal 21° programma COE, dal progetto Academic Frontier e da una sovvenzione per la ricerca scientifica del Ministero dell'istruzione, della cultura, dello sport, della scienza e della tecnologia del Giappone.

Riferimenti e note

1. Questo documento è il numero 19 della serie "Costituenti bioattivi delle medicine naturali cinesi". Per il documento numero 18, vedere Xie, H.; Morikawa, T.; Matsuda, H.; Nakamura, S.; Muraoka, O.; Yoshikawa, M. Chem. Farma. Toro. 2006, 54, 669–675.
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