La floretina sopprime la neuroinfiammazione mediante l'attivazione di Nrf2 mediata dall'autofagia nei macrofagi

Contatto:tina.xiang@wecistanche.com

Astratto

Sfondo: I macrofagi svolgono un duplice ruolo nei disturbi neuroinfiammatori come la sclerosi multipla (SM). Sono coinvolti nell'insorgenza e nella progressione della lesione, ma possono anche favorire la risoluzione diinfiammazionee riparazione dei tessuti danneggiati. In questo studio, indaghiamo se e comefloretina, un flavonoide abbondantemente presente in mele e fragole, abbassa il fenotipo infiammatorio dei macrofagi e sopprimeneuroinfiammazione.

Metodi: I cambiamenti trascrizionali nei macrofagi derivati ​​dal midollo osseo del topo in seguito all'esposizione alla floretina sono stati valutati mediante sequenziamento dell'RNA di massa. I percorsi sottostanti correlati all'infiammazione, alla risposta allo stress ossidativo e all'autofagia sono stati convalidati mediante PCR quantitativa, test di fluorescenza e assorbanza, topi knockout per il fattore nucleare eritroide 2- correlato al fattore 2 (Nrf2), western blot e immunofluorescenza. Il modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE) è stato utilizzato per studiare l'impatto della floretina sulla neuroinfiammazione in vivo e confermare i meccanismi sottostanti.

Risultati: Mostriamo che la floretina riduce il fenotipo infiammatorio dei macrofagi e sopprime notevolmente la neuroinfiammazione nell'EAE. La floretina media il suo effetto attivando la via di segnalazione Nr2. L'attivazione di Nrf2 è stata attribuita all'attivazione dell'autofagia dipendente dalla protein chinasi (AMPK) attivata da 5'AMP e alla successiva degradazione della proteina 1 (Keap1) associata a ECH simile a kelch.

Conclusioni: questo studio apre prospettive future per la floretina come strategia terapeutica per disturbi neuroinfiammatori come la SM.

Registrazione di prova: Non applicabile.

Parole chiave: Floretina, Macrofagi, Neuroinfiammazione, Sclerosi multipla, Autoimmunità

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Sfondo

Le lesioni della sclerosi multipla attiva (SM) sono caratterizzate dalla presenza di numerosemacrofagi[1-5]. I primi studi hanno dimostrato che i macrofagi adottano un fenotipo pro-infiammatorio nelle lesioni della SM, promuovendo cosìneuroinfiammazione, demielinizzazione e neurodegenerazione. Le funzioni effettrici che promuovono la malattia includono la presentazione degli antigeni derivati ​​dal sistema nervoso centrale (SNC) alle cellule T autoreattive e la produzione di mediatori dell'infiammazione come citochine pro-infiammatorie, specie reattive dell'ossigeno (ROS) e ossido nitrico (NO)[ 6,7]. Più recentemente, è stato scoperto che i macrofagi hanno anche funzioni benefiche nelle lesioni della SM poiché possono rimodellare il loro fenotipo in uno che è tipicamente associato all'immunosoppressione e alla riparazione del SNC. Questo fenotipo protettivo è caratterizzato da una ridotta produzione di mediatori pro-infiammatori, produzione di mediatori antinfiammatori e fattori di crescita e attivazione di vie antiossidanti come la via del fattore 2(Nrf2) correlata al fattore nucleare eritroide 2- [8-14]. Poiché lo stato infiammatorio dei macrofagi è stato collegato alla progressione della SM e allo sviluppo di lesioni croniche attive, la guida dei macrofagi verso un fenotipo benefico è considerata una strategia promettente per limitare la progressione della SM [15].

I componenti dietetici guidano la funzione dei macrofagi e la neuroinfiammazione [16]. In particolare, è sempre più riconosciuto che la famiglia dei flavonoidi contenga composti promettenti che influenzano le vie patologiche e modulano il fenotipo delle cellule immunitarie come i macrofagi[17,18]. I flavonoidi formano una delle più grandi famiglie di fitonutrienti che contengono oltre 8000 composti fenolici con bioattività diversificata. Diversi membri della famiglia dei flavonoidi mostrano effetti antinfiammatori e antiossidanti sui macrofagi [19-21]. La floretina flavonoide è un membro dei diidrocalconi ed è presente nei frutti comunemente consumati come mele e fragole. La floretina è nota per esercitare caratteristiche immunomodulatorie ed è ampiamente utilizzata per la cura della pelle grazie alla sua caratteristica antiossidante [22-24]. Inoltre, la floretina è un inibitore del trasportatore del glucosio (GLUT), una caratteristica che influenza il fenotipo dei macrofagi poiché l'attivazione dei macrofagi è alimentata da GLUT [25, 26]. Nel complesso, queste caratteristiche rendono la floretina un composto promettente per modulare il fenotipo dei macrofagi e della neuroinfiammazione. In questo studio, mostriamo che la floretina guida i macrofagi verso un fenotipo meno infiammatorio e allevia la neuroinfiammazione nel modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE). Il sequenziamento dell'RNA e gli esperimenti funzionali hanno identificato il percorso Nrf2 come hub e driver di questo fenotipo protettivo dei macrofagi indotto dalla floretina. È stato riscontrato che l'attivazione AMPK-dipendente del macchinario dell'autofagia e la successiva degradazione mediata da SQSTMl/p62- (di seguito denominata p62) di Keapl, un adattatore che facilita la degradazione proteasomale Nrf2, sono alla base dell'attivazione di Nrf2 nei macrofagi. Questi risultati mostrano che la floretina ha il potenziale per essere utilizzata nelle strategie terapeutiche per i disturbi neuroinfiammatori.

Metodi

Anticorpi e reagenti chimici

floretina(Sigma Aldrich) è stato sciolto in 50 mM KOH in una soluzione madre 15 mM e conservato a-20 gradi . Ulteriori diluizioni sono state effettuate in un mezzo RPMI1640 (Gibco). Per il trattamento in vivo, la floretina è stata disciolta in NaOH 1 N, quindi il pH è stato riaggiustato a 7,2 con HCL 1 N e la soluzione è stata ulteriormente diluita in acqua fisiologica per ottenere una concentrazione di 50 mg/kg. BML-275 (1 μM, Biotecnologia Santa Cruz) è stato aggiunto 1 ora prima del trattamento con floretina per inibire l'attivazione dell'AMPK. La bafilomicina A1 (BAF, 0,1 μM, InvivoGen) è stata aggiunta 2 ore prima della raccolta per bloccare la fusione di autofagosomi e lisosomi. Il lipopolisaccaride (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) è stato utilizzato per stimolare le cellule per la fenotipizzazione infiammatoria. Il forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) è stato utilizzato per indurre la produzione di ROS. Per il western blot sono stati utilizzati i seguenti anticorpi: anti{22}}actina di topo (1:10,000;sc-47778, biotecnologia di Santa Cruz), anti-GAPDH di topo (1:{{29 }};AB_2537659, Invitrogen), coniglio anti-AMPK (1:1000;5831S, tecnologia di segnalazione cellulare), coniglio anti-fosforilato AMPK (1:1000; 2535S, tecnologia di segnalazione cellulare), coniglio anti-LC3 (1:1000; L7543, Sigma-Aldrich), coniglio anti-p62 (1: 1000; 23214, tecnologia di segnalazione cellulare). Per l'immunofluorescenza sono stati utilizzati i seguenti anticorpi: anti-CD3 di ratto(1:150; MCA500G, Bio-Rad), anti-F4/80 di ratto(1:100; MCA497G, Bio-Rad), anti-LC3 di coniglio(1:1000 ;L7543, Sigma-Aldrich), coniglio anti-p62 (1:500;23214,Cell Signaling Technology), coniglio anti-Keap1(1:500;60027-1-Ig,Proteintech Europa), coniglio anti-TMEM119(1 :100, ab209064,Abcam). Gli anticorpi secondari appropriati sono stati acquistati da Invitrogen.

Topi

I topi Wild-type(WT) C57BL/6JOlaHsd sono stati acquistati da Envigo. Gli animali venivano nutriti con una dieta regolare e alloggiati nella struttura per animali dell'Istituto di ricerca biomedica dell'Università di Hasselt. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida istituzionali e sono stati approvati dal comitato etico per gli esperimenti sugli animali dell'Università di Hasselt.

Coltura cellulare

Derivato dal midollo osseomacrofagi(BMDM) sono stati isolati da topi WT e Nrf2 knockout (KO) C57BL/6JOlaHsd, acquistati da Envigo e forniti dal RIEN BRC secondo un MTA rispettivamente al Prof S. Kerdine-Römer [27,28]. I BMDM sono stati ottenuti come descritto in precedenza [29]. In breve cellule del midollo osseo tibiale e femorale da topi WT e Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd di 12- settimane sono state coltivate in piastre Petri di 10-cm a una concentrazione di 10×106 cellule/ piastra, in terreno RPMI1640 integrato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS, Gibco), 50 U/ml di penicillina (Invitro-gen), 50 U/ml di streptomicina (Invitrogen) e il 15% di L{22}}mezzo condizionato (LCM ). Dopo la differenziazione, i BMDM sono stati staccati a 37 gradi con 10 mM EDTA in PBS (Gibco) e coltivati ​​(0,5 × 10 cellule/ml) in RPM1640 integrati con 10 percento di FCS, 50 U/ml di penicillina, 50 U/ml di streptomicina e 5 percento di LCM ( 37 gradi C, 5 percento di CO2). Le colture di microglia sono state isolate dal cervello di cuccioli di P1-3 C57BL/6/OlaHsd postnatali. Dopo che il tronco cerebrale, il plesso coroideo e le meningi sono stati rimossi, i cervelli sono stati dissociati meccanicamente e digeriti enzimaticamente per 15 minuti con 1× tripsina (Gibco) a 37 gradi. Successivamente, la sospensione cellulare è stata seminata in DMEM un mezzo ad alto contenuto di glucosio (Sigma) integrato con 30 percento di LCM, 10 percento di FCS, 50 U/ml di penicillina e 50 U/ml di streptomicina in flaconi di coltura T75. Da due a 3 giorni dopo, è stata eseguita una modifica completa del mezzo. Le colture gliali miste sono state agitate (230 giri/min, 3 ore, 37 gradi) dopo 6-7 giorni per ottenere colture di microglia pure.

Sequenziamento dell'RNA

Le cellule sono state pretrattate con floretina (50 μM) per 20 ore e stimolate con LPS (100 ng/ml) per 6 ore. La lisi cellulare è stata eseguita utilizzando il reagente di lisi Qiazol (Qiagen). L'RNA è stato estratto dalle cellule utilizzando il mini kit RNeasy (Qiagen). I campioni sono stati quindi elaborati dal Genomics Core Leuven (Belgio). La preparazione delle librerie è stata eseguita con il kit QuantSeq di Lexogen per generare librerie compatibili con Illumina. Le librerie sono state sequenziate sul sistema di sequenziamento Illumina HiSeq4000. L'allineamento sensibile alla giunzione è stato eseguito con STAR v2.6.1b[30]. La quantificazione delle letture per gene è stata eseguita con HT-seq Count v2.7.14. L'analisi dell'espressione differenziale basata sul conteggio è stata eseguita con il pacchetto di bioconduttori DESeq2 basato su R (The R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). Un elenco di geni differenzialmente espressi è stato selezionato ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

PCR quantitativa di trascrizione inversa

Le cellule sono state pretrattate con floretina (50 μM) per 20 ore e stimolate con LPS (100 ng/ml) per 6 ore. La lisi è stata eseguita utilizzando il reagente di lisi Qiazol (Qiagen). L'RNA è stato estratto utilizzando il mini kit RNeasy (Qiagen). La concentrazione e la qualità dell'RNA sono state determinate con uno spettrofotometro Nano-drop (Isogen Life Science). La sintesi del cDNA è stata condotta utilizzando Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) secondo le istruzioni del produttore. La qPCR è stata eseguita su un sistema di PCR in tempo reale StepOne-Plus (Applied Biosystems) utilizzando una miscela SYBR verde contenente 1 × SYBR green (Applied Biosystems), 0,3 μM di primer (Integrated DNA Technologies), 12,5 ng di cDNA e acqua priva di nucleasi Per quantificare l'espressione genica è stato utilizzato il metodo comparativo Ct. I dati sono stati normalizzati ai geni di riferimento più stabili ciclina A e ipoxantina fosforibosiltransferasi 1. Le sequenze di primer sono disponibili su richiesta.

Determinazione delle specie reattive dell'ossigeno

Le cellule sono state pretrattate con floretina (50 uM) per 2 ore. Successivamente, le cellule sono state stimolate con PMA (15 min, 100 ng/ml) e la produzione di ROS è stata misurata utilizzando la sonda fluorescente 2',7'-diclorodiidrofluoresceina diacetato a 10 μM in PBS per 30 minuti. La fluorescenza è stata misurata utilizzando il lettore di micropiastre FLUOstar optima a fluorescenza (BMG Labtech, Ortenberg, Germania) (eccitazione: 495 nm, emissione: 529 nm).

Misure di ossido nitrico

Le cellule sono state pretrattate con floretina (50 μM) per 2 ore. Successivamente, le cellule sono state stimolate con LPS (24 h, 100 ng/ml). NO è stato indirettamente monitorato utilizzando il kit di misurazione del nitrito del reagente Griess (Abcam). In breve, il nitrato reagisce con sulfanilamide e N-({5}}naftil)etilendiammina dicloridrato per produrre un colorante azoico rosa. L'assorbanza di questo derivato azoico è stata quindi misurata a 540 nm utilizzando un lettore di micropiastre (iMark, Bio-Rad).

Macchia occidentale

Le cellule sono state trattate con floretina（5{{1{18}}}} μM） e LPS（100 ng/ml) per 1 ora o 24 ore per determinare rispettivamente l'attivazione di AMPK oi livelli di proteine ​​p62, LC3 e Keapl. Le cellule sono state lisate utilizzando il tampone RIPA (150 mM NaCl, 1% Triton X{9}}, 0,5% sodio desossicolato, 1% SDS, 50 mM Tris) e separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato. I gel sono stati trasferiti su una membrana PVDF (VWR) e le macchie sono state bloccate per 1 ora in albumina di siero bovino al 5% in soluzione fisiologica tamponata con Tris contenente lo 0,1% di Tween-20(TBS-T). Le membrane sono state sondate con anticorpi primari durante la notte a 4 "C, lavate con TBS-T e incubate con il corrispondente anticorpo secondario marcato con perossidasi di rafano per 1 ora a temperatura ambiente (RT). I segnali immunoreattivi sono stati rilevati con una chemiluminescenza potenziata (ECL Plus, Thermo Fisher) utilizzando l'Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences).Le densità delle bande sono state determinate utilizzando ImageJ.

Immunofluorescenza

Le criosezioni del midollo spinale sono state asciugate all'aria e fissate in acetone ghiacciato per 10 minuti a - 20 gradi. I BMDM di topo sono stati coltivati ​​su vetrini coprioggetto di vetro e fissati in metanolo ghiacciato per 10 minuti a -20 gradi . Sezioni e BMDM sono stati bloccati per 30 minuti utilizzando il blocco proteico Dako (Agi-lent). Successivamente, sono stati incubati per una notte a 4 "C con anticorpi primari, lavati e incubati con gli anticorpi secondari appropriati per 1 ora a temperatura ambiente. Le immagini del tessuto del midollo spinale sono state acquisite utilizzando un microscopio Nikon Eclipse 80i (obiettivo 10 ×) e NIS Software Elements BR 3.10 (Nikon). Le immagini di BMDM colorate per p62, LC3 e Keapl sono state riprese utilizzando il microscopio confocale Zeiss LSM 880 e sono state corrette con Airyscan (63 × obiettivo).P62-e LC3- i punti positivi sono stati determinati mediante analisi semiautomatica di puncta imageJ. In breve, dopo che l'immagine è stata resa binaria e le cellule sono state selezionate a mano, i punti sono stati analizzati per cellula. La colocalizzazione di P62 e Keapl è stata eseguita utilizzando una pipeline di colocalizzazione nel software CellProfiler [31] Le immagini mostrate nelle figure sono migliorate digitalmente.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, assetto terapeutico). I topi sono stati pesati e valutati quotidianamente per i segni neurologici della malattia secondo la guida al punteggio EAE del topo del produttore:0:nessun sintomo clinico,0.5:la punta della coda è floscia, 1:la coda floscia , 1.5: coda floscia e inibizione della zampa posteriore 2: coda floscia e debolezza delle zampe posteriori, 2.5: coda floscia e trascinamento delle zampe posteriori,3: coda floscia e paralisi completa delle zampe posteriori, 3.5: coda floscia e paralisi completa dei posteriori gambe e topo non sono in grado di raddrizzarsi quando sono posti su un fianco,4: paralisi del diaframma, 5: morte per EAE.

analisi statistica

GraphPad Prism è stato utilizzato per analizzare statisticamente i dati, che sono rappresentati come media ± sem D'Agostino e il test di normalità omnibus Pear-son è stato utilizzato per testare la distribuzione normale. Per i dati normalmente distribuiti è stato utilizzato il test t di Student non accoppiato a due code (con la correzione di Welch se necessario). L'analisi di Mann-Whitney è stata utilizzata per i dati che non hanno superato i valori di normalità test.p<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Risultati

Cambiamenti trascrizionali associati al trattamento con floretina dei macrofagi

Per stabilire potenziali effetti antinfiammatori e identificare i meccanismi alla base del trattamento con floretina sui macrofagi, abbiamo eseguito il sequenziamento dell'RNA di massa (Figura 1 supplementare). L'analisi del percorso dei macrofagi attivati ​​trattati con floretina ha mostrato che i geni differenzialmente espressi erano sovrarappresentati nei percorsi canonici correlati ainfiammazione, come iNOS(z-score:-2.449), toll-like receptor(z-score:-2.236), segnalazione dell'interferone (z-score:- 2), e via di risposta di fase acuta (z-score:- 1.633)(Fig.1A, B). Analogamente all'analisi del percorso canonico, l'analisi a monte dei dati RNA-seq prevedeva che la floretina riducesse l'attivazione di regolatori della trascrizione pro-infiammatoria chiave come IRF7 (z-score:2.229), IRF1(z-score:-2. 025) e STAT1(z-score:-2.022)(Fig. 1D). Oltre alla sottoregolazione delle vie pro-infiammatorie dei macrofagi, l'analisi RNA-seq dei macrofagi trattati con floretina ha mostrato che, tra le altre vie, la floretina attivava potentemente la via Nrf2 (z-score:1.897), evidenziata dalla sovraregolazione di Nrf2-associata geni come mafG e proxy (Fig. 1A, C). Inoltre, Nrf2(NFE2L2) è stato identificato come il regolatore trascrizionale a monte più attivato (z-score: 2.801) e la regolazione dei livelli di ROS è stata identificata come una delle funzioni biologiche più sovraregolate nei BMDM trattati con floretina (z-score: 2.008 )(Fig. 1D, E). Collettivamente, i risultati mostrano che la floretina attiva Nrf2 e sopprime il fenotipo infiammatorio dei macrofagi.

Il percorso Nrf2 controlla il fenotipo dei macrofagi trattati con floretina

Successivamente, abbiamo convalidato l'effetto antinfiammatorio della floretina e determinato se modula il fenotipo infiammatorio dei macrofagi agendo su Nrf2. Livelli ridotti di ROS sono stati osservati nei BMDM WT trattati con floretina stimolati con PMA (Fig. 2A). Inoltre, è stata osservata una ridotta produzione di NO e livelli di mRNA dei geni pro-infiammatori NOS2, I-6, COX2 e I-12 nei BMDM WT trattati con floretina stimolati con LPS (Fig. 2B, C). In in relazione al ruolo cruciale di Nrf2 nell'indurre un fenotipo meno infiammatorio, i nostri dati mostrano che la floretina attiva i geni di risposta Nrf2- HO1 e NQO1 in WT ma non i BMDM Nrf2 KO stimolati con LPS (Fig. 2D). Inoltre, il trattamento con floretina ha ridotto la produzione di ROS nel WT ma non nei BMDM Nrf2 KO (Fig. 2E). Oltre a controllare le risposte antiossidanti, è stato riportato che Nrf2 sopprime il fenotipo infiammatorio dei macrofagi [12]. A sostegno di quest'ultimo, la floretina non è stata in grado di ridurre l'espressione dei geni pro-infiammatori NOS2, IL-6, COX2 , e IL-12 nei BMDM con deficit di Nrf2-attivati ​​(Fig. 2F). Complessivamente, questi risultati indicano che Nrf2 guida lo spostamento del fenotipo infiammatorio mediato dalla floretina dei macrofagi.

La floretina promuove l'attivazione di AMPK

La floretina è un inibitore del GLUT ben definito e studi recenti evidenziano l'importanza dell'assorbimento del glucosio mediato dal GLUT per l'attivazione dei macrofagi [26,32]. Quindi, abbiamo determinato se la floretina potrebbe attivare il sensore di energia AMPK, che viene attivato a bassi livelli di energia/glucosio. I nostri risultati mostrano che il trattamento con floretina porta alla fosforilazione e all'attivazione di AMPK (Fig. 3A, B). Inoltre, l'aggiunta dell'inibitore AMPK BML-275 previene in gran parte l'attivazione di AMPK nei BMDM trattati con floretina (Fig. 3A, B). Inoltre, i nostri risultati dimostrano che l'attivazione di AMPK è essenziale affinché la floretina sopprima la produzione di ROS, come dimostrato da livelli di ROS più elevati nei BMDM trattati sia con floretina che con l'inibitore di AMPK rispetto ai BMDM trattati con la sola floretina (Fig. 3C). In totale, i nostri dati suggeriscono che l'attivazione di AMPK indotta dalla floretina è cruciale per guidare i macrofagi verso un fenotipo meno infiammatorio.

La floretina stimola l'autofagia in modo AMPK-dipendente

Poiché l'attivazione di AMPK è correlata all'attivazione di processi catabolici in risposta alla privazione di nutrienti [33], abbiamo quindi studiato se la floretina può attivare l'autofagia. L'autofagia è un processo catabolico conservato che viene indotto dalla fame e da altre risposte allo stress, che promuove la degradazione lisosomiale del carico intracellulare sequestrato nelle vescicole chiamate autofagosomi. L'analisi dell'RNA-seq prevedeva l'autofagia come uno dei processi biologici a valle che mostravano una maggiore attività nei BMDM trattati con floretina (punteggio z: 0.779) (Fig. 4A). Inoltre, l'analisi immunocitochimica dei BMDM trattati con floretina e l'inibitore dell'autofagia bafilomicina Al ha mostrato un aumento dell'accumulo dei marcatori dell'autofagia MAP1LC3/LC3 (catena leggera 3 della proteina 1 associata ai microtubuli) e p62 rispetto ai BMDM trattati con bafilomicina A1- (Fig. .4B-D), che indica un aumento del flusso autofagico dopo il trattamento con floretina [34]. Dopo l'induzione dell'autofagia, LC3 viene convertito dalla forma LC3I alla forma LC3I lipidata, che è correlata al numero di autofagosomi. In linea con ciò, sono stati determinati livelli proteici più elevati di LC3II e p62 nei BMDM stimolati con floretina mediante western blot (Fig. 4E, F). È interessante notare che questo aumento di p62 e LC3II da parte della floretina è stato prevenuto trattando i BMDM con l'inibitore dell'AMPK BML-275(Fig.4E-F). Collettivamente, i nostri dati mostrano che la floretina stimola l'autofagia in modo AMPK-dipendente.

La floretina attiva il percorso Nrf2 attraverso la degradazione di Keap1 mediata dall'autofagia

I nostri dati mostrano che la floretina attiva Nrf2 e stimola l'autofagia nei macrofagi. È interessante notare che il recettore dell'autofagia p62 può competere con Nrf2 per il legame a Keapl, l'adattatore che facilita l'ubiquitinazione e la degradazione di Nrf2 in condizioni normali. Questa dissociazione p62-mediata di Keap1/Nrf2 preverrà quindi la degradazione di Nrf2 e alla fine porterà all'attivazione di Nrf2 [35]. Per questo motivo, abbiamo determinato se la floretina promuove l'interazione p62/Keapl, attivando così il percorso Nrf2. Qui, mostriamo che la floretina attiva il percorso Nrf2 attraverso la degradazione di Keapl p62-mediata nei macrofagi. Utilizzando la microscopia confocale Airyscan ad alta risoluzione combinata con l'analisi di colocalizzazione, dimostriamo che la floretina stimola l'interazione di p62 e Keapl, come dimostrato da un aumento del valore del parametro di colocalizzazione (coefficiente di Pearson) nei BMDM trattati con floretina (Fig. 5A , B). Inoltre, i nostri risultati mostrano che livelli proteici inferiori di Keapl sono presenti nei BMDM trattati con floretina, confermando la degradazione di Keapl (Fig. 5C). Per confermare che la degradazione dipende dall'autofagia, abbiamo aggiunto l'inibitore dell'autofagia bafilomicina A1 al trattamento con floretina BMDM. È interessante notare che questa riduzione di Keapl è stata invertita dal trattamento con bafilomicina Al (Fig. 5C). Questi risultati sono stati confermati dal western blot, che mostra una riduzione dei livelli di proteina Keapl nei BMDM trattati con floretina che è stata prevenuta dalla bafilomicina A1 (Fig. 5D, E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), la floretina ha ridotto la gravità della malattia (Fig. 6B). La ridotta gravità della malattia negli animali trattati con floretina è stata accompagnata da una ridotta espressione dei geni infiammatori MHCI,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 e CXCL2 nel midollo spinale (Fig.6C). Inoltre, è stata trovata una quantità ridotta di cellule F4/80t nel midollo spinale degli animali trattati con floretina (Fig.6E, F). Poiché sia ​​i macrofagi F4/80*microglia che F4/80* contribuiscono alla neuroinfiammazione, un'analisi più approfondita ha dimostrato che la floretina ha ridotto notevolmente la quantità di F480 più TMEMl19-

macrofagi nei topi EAE (Figura 2 DF supplementare) mentre è stata osservata una tendenza non significativa verso una riduzione in F480 più TMEMl19 più microglia. Coerentemente con questa scoperta, la floretina ha soppresso la produzione di mediatori infiammatori nella microglia ma questa soppressione era meno pronunciata rispetto ai macrofagi (Figura 2 AC supplementare). Questi risultati suggeriscono che il miglioramento dell'EAE da parte della floretina è principalmente guidato dai macrofagi. Oltre a ridurre l'espressione dei geni infiammatori, la floretina ha aumentato l'espressione di fattori antinfiammatori e neurotrofici, ovvero IL-4, CNTF e IGF-1 nel midollo spinale degli animali EAE (Fig. 6D ). Questi risultati suggeriscono fortemente che la floretina riduce la gravità della malattia EAE guidando i macrofagi verso un fenotipo che risolve la malattia. In linea con i nostri precedenti risultati in vitro, abbiamo anche rilevato un elevato segnale di Nrf2 nel SNC di animali EAE trattati con floretina, come indicato dall'aumentata espressione di mRNA di Nrf2 e dai suoi bersagli a valle NQO1 e GPX1 (Fig. 6G). Complessivamente, questi dati mostrano che la floretina sopprime la neuroinfiammazione sia in ambito profilattico che terapeutico. Inoltre, i nostri risultati indicano che la floretina può ridurre la neuroinfiammazione sopprimendo le caratteristiche infiammatorie dei macrofagi attraverso l'attivazione di Nrf2.

Discussione

In questo studio, dimostriamo che la floretina guida i macrofagi verso un fenotipo meno infiammatorio in modo Nrf2-dipendente. È stato riscontrato che l'attivazione dell'autofagia dipendente da AMPK e la successiva degradazione di Keapl sono alla base dell'attivazione di Nrf2 da parte della floretina. Inoltre, confermiamo gli effetti antinfiammatori della floretina in un modello EAE in cui diminuisce la gravità della malattia e allevia i macrofagi dipendentineuroinfiammazione.

Mostriamo che la floretina sopprime il fenotipo infiammatorio dei macrofagi. Ciò è in linea con i risultati di Wei-Tien Chang et al. che ha dimostrato che la floretina ha caratteristiche antinfiammatorie in una linea cellulare di macrofagi [36]. Dimostriamo che l'induzione di questo spostamento del fenotipo dipende da Nrf2. Nrf2 è un regolatore principale delle risposte antiossidanti ed è noto che la sua attivazione guida i macrofagi verso un fenotipo antinfiammatorio [1l, 12, 37]. Inoltre, diversi studi hanno definito che l'attivazione di Nrf2 attenua la neuroinfiammazione e la neurodegenerazione nei disturbi del SNC [{{10 }}]. Tuttavia, sebbene i nostri risultati mostrino che Nrf2 è alla base dello spostamento del fenotipo dei macrofagi trattati con floretina, i dati di sequenziamento dell'RNA hanno illustrato che, tra l'attivazione di Nrf2, altri percorsi erano sovraregolati. In particolare, la sovraregolazione della via PPAR è interessante per le sue caratteristiche antinfiammatorie e per il cross-talk con Nrf2 [41-45]. Inoltre, poiché la floretina è un inibitore del GLUT ben definito e il passaggio alla glicolisi è un evento metabolico cruciale per l'attivazione dei macrofagi, i cambiamenti del fenotipo potrebbero anche essere in parte indotti dagli effetti metabolici diretti della floretina su questi trasportatori del glucosio [46,47]. Sono necessarie ulteriori ricerche per definire la rilevanza del PPAR nell'attivazione di Nrf2 indotta dalla floretina e in che misura l'immunomodulazione indotta dalla floretina è influenzata dai cambiamenti metabolici diretti. Nel complesso, i nostri risultati dimostrano chiaramente che l'attivazione di Nrf2 svolge un ruolo essenziale nell'interruttore del fenotipo mediato dalla floretina.

I nostri risultati indicano che l'attivazione di Nrf2 da parte della floretina è mediata dall'attivazione di AMPK. L'AMPK svolge un ruolo cruciale nel ripristinare l'omeostasi dell'energia cellulare in caso di stress che riducono l'ATP con conseguente aumento del rapporto ADP:ATP, attivando così percorsi catabolici alternativi che generano ATP, disattivando i percorsi anabolici che consumano ATP [48]. Di conseguenza, la floretina è un consolidato inibitore del GLUT e abbassa i livelli di glucosio cellulare [49-51]. Diversi studi hanno dimostrato che l'attivazione di AMPK nei macrofagi induce un fenotipo immunosoppressivo, che corrobora i nostri risultati che dimostrano che l'attivazione di AMPK è essenziale affinché la floretina riduca l'infiammazione[52,53]. I nostri dati sono anche coerenti con studi precedenti in cui è stato dimostrato che la floretina attiva l'AMPK in altri tipi cellulari, inclusi gli adipociti e le cellule endoteliali [50, 54-56]. La floretina può attivare AMPK indirettamente aumentando AMP e abbassando i livelli di ATP, poiché AMP e ATP stimolano o inibiscono allostericamente l'attivazione di AMPK, rispettivamente [48, 57]. Tuttavia, CaMKK , che è una chinasi a monte di AMPK, può promuovere l'attivazione di AMPK in risposta all'aumento dei livelli cellulari di Ca2 plus senza alcun cambiamento nei livelli di AMP/ATP [58]. Inoltre, data l'ampia rete dell'interazione tra AMPK e percorsi a monte ea valle, sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire il meccanismo alla base dell'attivazione dell'AMPK indotta dalla floretina.

I nostri dati suggeriscono che l'attivazione di AMPK mediata dalla floretina stimola l'autofagia nei macrofagi. Come accennato in precedenza, l'attivazione di AMPK è un processo di autoprotezione che mira a ripristinare l'equilibrio energetico della cellula [48]. Sebbene nessuno studio abbia mai dimostrato che la floretina fosse in grado di stimolare il fenotipo dei macrofagi promuovendo l'autofagia, alcuni studi hanno comunque dimostrato un effetto della floretina sulle vie dell'autofagia nelle cellule tumorali e negli epatociti [59-61]. Inoltre, vari studi mostrano che i processi catabolici a valle dell'attivazione di AMPK possono attivare l'autofagia [60, 62,63]. È interessante notare che, in risposta alla fame di glucosio, l'autofagia mediata da AMPK è indotta dalla fosforilazione dell'importante iniziatore dell'autofagia unc-51 come l'autofagia che attiva la chinasi [64,65]. Rispetto a questo, ipotizziamo che AMPK stimoli l'autofagia per ripristinare l'ATP dai componenti cellulari in risposta all'esaurimento del glucosio indotto dalla floretina. Tuttavia, la fame di glucosio può anche attivare l'autofagia in modo indipendente dall'AMPK [66-68]. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche per determinare se l'attivazione dell'autofagia da parte della floretina si verifica anche parzialmente indipendentemente dall'AMPK.

Studi recenti hanno mostrato l'importanza dell'autofagia per guidare il fenotipo funzionale dei macrofagi. In questo contesto, la disregolazione dell'autofagia nei macrofagi è stata in particolare collegata all'insorgenza di aterosclerosi e malattie neurologiche [69-72]. Qui, forniamo un collegamento tra il trattamento della floretina, l'induzione dell'autofagia e l'attivazione di Nrf2 dimostrando che la floretina promuove l'attivazione di Nrf2 tramite la degradazione mediata da p62- di Keap1. Fino a poco tempo, un aumento di p62 puncta era considerato un segno di diminuzione dell'autofagia poiché p62 è degradato negli autofagosomi dopo l'attivazione dell'autofagia [34]. In relazione a ciò, l'accumulo di p62 è stato collegato alla disfunzione dell'autofagia nelle lesioni aterosclerotiche [73]. Tuttavia, questa nozione è stata contestata negli ultimi anni e ora si pensa che p62 sia necessario per la formazione di autofagosomi e che un aumento dei livelli di p62 in parallelo con un aumento di LC3Il puncta possa essere un segno di induzione dell'autofagia [74]. Pertanto, insieme alla capacità della floretina di attivare AMPK e al suo ruolo noto nell'attivazione dell'autofagia, i nostri risultati suggeriscono che l'accumulo di P62 e LC3 durante il trattamento con bafilomicina A1 nei macrofagi stimolati dalla floretina è dovuto a un aumento del flusso autofagico e non a un alterato autofagia. È interessante notare che Lee Y et al. ha recentemente dimostrato che, oltre all'attivazione di Nrf2, il legame di p62 con Keapl è anche coinvolto nella formazione di autofagosomi, suggerendo che l'attivazione dell'autofagia mediata dalla floretina è direttamente collegata all'aumento dell'attività di p62 da un lato, ma anche a una maggiore interazione di Keapl-p62 dall'altro. 75]. Keapl è un adattatore dell'ubiquitina ligasi a base di Cullin-3-che forma un omodimero con Nrf2 in condizioni omeostatiche, promuovendo così l'ubiquitinazione di Nrf2 e la degradazione del proteasoma [76]. L'interruzione del complesso Keapl-Nrf2 porta alla stabilizzazione e alla traslocazione di Nrf2 nel nucleo [77, 78]. È ben documentato che l'interruzione di questo complesso avviene tramite la modifica dei residui di cisteina di Keapl da parte di molecole elettrofile, l'interazione diretta di piccole molecole con Keapl o la degradazione di Keapl mediata da p62-[35]. Ying Y et al. suggeriscono un'interazione diretta di floretina e Keapl basata su esperimenti in silico, che porta quindi all'attivazione della via Nrf2 in una linea cellulare di cardiomiociti [79]. Qui, abbiamo stabilito un meccanismo aggiuntivo relativo all'autofagia mediante il quale la floretina attiva Nrf2.

Utilizzando il modello EAE, abbiamo stabilito che la floretina allevia la neuroinfiammazione in vivo. I nostri dati suggeriscono fortemente che la floretina migliora l'EAE sopprimendo la risposta infiammatoria mediata dai macrofagi e attivando il percorso Nrf2. In altri modelli di malattia, è stato anche riportato che la floretina esercita caratteristiche neuroprotettive e immunomodulatorie. In particolare, è stato scoperto che la floretina attiva la via Nrf2 nel cervello in caso di ischemia cerebrale e diminuisce l'accumulo di beta amiloide nel modello di malattia di Alzheimer del ratto [80-84]. La floretina potrebbe anche influenzare altre cellule immunitarie in vivo, poiché è stato scoperto che questo composto inibisce l'attivazione delle cellule T e delle cellule dendritiche in vitro [85, {5}}]. Dato che la neuroinfiammazione nel modello EAE non è puramente dipendente dai macrofagi, sarebbe interessante definire in che misura la riduzione della neuroinfiammazione è mediata da altre cellule immunitarie. Rispetto a questo, sebbene i nostri dati suggeriscano che il miglioramento dell'EAE sia principalmente guidato dai macrofagi e sia meno dipendente dalla modulazione della microglia, sono necessari ulteriori esperimenti per chiarire in che misura la floretina colpisce la microglia nelle malattie neuroinfiammatorie. Nel complesso, i nostri risultati dimostrano che la floretina riduce la neuroinfiammazione influenzando il fenotipo dei macrofagi, mostrando il potenziale terapeutico della floretina per i disturbi neuroinfiammatori.

Conclusioni

Il nostro studio dimostra che la floretina è un potente agente immunomodulatore che modula le proprietà infiammatorie dei macrofagi nei disturbi neuroinfiammatori. L'attivazione della via Nrf2, mediata dall'attivazione dell'autofagia AMPK-dipendente e dalla successiva degradazione di Keapl, è stata stabilita per guidare questo spostamento del fenotipo. Quindi, la floretina è un promettente agente naturale che può essere utilizzato per ridurre il carico infiammatorio delle malattie neuroinfiammatorie come la SM.

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