Come viene utilizzato l'inibitore della fosfoinositide 3-chinasi Alpelisib per la sindrome di Lowe/malattia dell'ammaccatura?
Mar 14, 2022
L'inibitore della fosfoinositide 3-chinasi alpelisib ripristina l'organizzazione dell'actina e migliora la disfunzione del tubulo prossimale in vitro e in un modello murino di sindrome di Lowe e malattia di Dent
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Marine Berquez1,5, Jonathan R. Gadsby2,5, Beatrice Paola Festa1,5, Riccardo Maggiordomo3 , Stephen P. Jackson2, Valeria Bernino4, Alessandro Luciani1 , Olivier Devuyst1,6e Jennifer L. Gallop2,6
PAROLE CHIAVE: citoscheletro; endocitosi; lipidi; tubulo prossimale; sindrome renale di Fanconi
Mutazioni con perdita di funzione nel gene OCRL, che codifica per il fosfatidilinositolo [PI] 4,5-bisfosfato [PI(4,5)P2] 5-fosfatasi OCRL, causano endocitosi difettosa e disfunzione del tubulo prossimale inSindrome di Lowe e malattia di Dent2. Il difetto è dovuto all'aumento dei livelli di PI(4,5)P2 e alla polimerizzazione aberrante dell'actina, che blocca il traffico endosomiale. PI 3-fosfato [PI(3)P] è stato recentemente identificato come coattivatore con PI(4,5)P2 nella via dell'actina. Qui, abbiamo testato l'ipotesi chefosfoinositide 3-chinasiGli inibitori (PI3K) possono salvare il difetto endocitico conferito dalla perdita di OCRL, riequilibrando i segnali del fosfoinositide al macchinario dell'actina. L'ampio PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)inibitore copanlisib e classe IA p110a PI3K(fosfoinositide 3-chinasi) inibitore alpelisibridotta polimerizzazione dell'actina aberrante in cellule renali umane carenti di OCRL in vitro. I livelli di PI 3,4,{3}}trifosfato, PI(4,5) P2 e PI(3)P sono stati tutti ridotti con il trattamento con alpelisib e il knockdown siRNA della subunità catalitica PI3K p110a ha fenocopiato il fenotipo dell'actina. In un modello murino umanizzato OcrlY/-, alpelisib ha ridotto la colorazione dell'actina endosomiale ripristinando l'architettura delle fibre di stress e i livelli di megalina sulla membrana plasmatica delle cellule dei tubuli prossimali, come riflesso da un migliore assorbimento endocitico delle proteine a basso peso molecolare in vivo. Pertanto, i nostri risultati supportano il legame tra lipidi fosfoinositidici, polimerizzazione dell'actina e traffico endocitico nel tubulo prossimale e rappresentano una prova di concetto per riproporre alpelisib inSindrome di Lowe/malattia dell'ammaccatura2.
Dichiarazione traslazionale
Sindrome di Lowe e malattia di Dent2, causata da mutazioni nella fosfoinositide lipidica 5-fosfatasi OCRL, si manifesta con disfunzione del tubulo prossimale e proteinuria a basso peso molecolare con solo cure di supporto disponibili. I nostri risultati rivelano che ilfosfoinositide 3-chinasi inibitore alpelisib, che è attualmente approvato per la terapia del cancro, allevia l'equilibrio aberrante del fosfoinositide e il fenotipo dell'actina associati alla perdita di OCRL, causando un sostanziale miglioramento del macchinario endocitico e della capacità di assorbimento nei sistemi cellulari e un modello murino umanizzato per la sindrome di Lowe/malattia di Dent 2. Dato il suo apparente profilo di sicurezza, alpelisib è un candidato promettente per il reimpiego di farmaciSindrome di Lowe e malattia di Dent.
Le cellule epiteliali che rivestono i tubuli prossimali (PT) del rene possiedono un'efficiente via endolisosomica mediata da recettori che recupera ed elabora le sostanze essenziali che vengono filtrate attraverso il glomerulo. I disturbi congeniti che colpiscono gli endolisosomi causano disfunzione del PT (sindrome di Fanconi renale) con perdita urinaria di soluti e proteine a basso peso molecolare (LMW), spesso complicata da complicanze metaboliche e della crescita e sviluppo di malattia renale cronica.1La mutazione inattivante dell'OCRL è stata associata alla malattia di Dent 2 (MIM #300555), un disturbo caratterizzato da disfunzione del PT, calcoli renali e insufficienza renale progressiva, e con la sindrome oculocerebrorenale di Lowe (MIM #309000), che mostra, in aggiunta alla disfunzione del PT e all'insufficienza renale, manifestazioni sistemiche come cataratta congenita, disabilità cognitiva e ipotonia.2-4I trattamenti attuali per la malattia di Dent 2 e la sindrome di Lowe sono solo di supporto.
Figura 1|PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)gli inibitori alleviano l'assemblaggio aberrante dell'actina agli endosomi in un modello di cellula del rene umano carente di OCRL (HK2). (a) Fasi della conversione lipidica del fosfoinositide rilevanti per questo studio che indicano le conversioni tra PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P2 e PI(3)P con gli enzimi più rilevanti in grassetto, più rilevanti conversioni in linee continue e altre in linee tratteggiate. PI(4,5)P2 è elevato nella sindrome di Lowe a causa della mancanza di 5-attività della fosfatasi da OCRL ed è costituito dalla fosforilazione di PI da fosfatidilinositolo 4-chinasi (PI4K) e PI(4) P 5-chinasi (PIP5K). PI(4,5)P2 viene fosforilato da PI3K di classe I per produrre PI(3,4,5)P3. PI(3,4,5)P3 può essere defosforilato a PI(4,5)P2 da PTEN o a PI(3,4)P2 da SH-2-contenente inositolo 50 polifosfati (SHIP) 1 e 2, synaptojanin 1 e 2, e anche OCRL, sebbene questo sia (continua)
Figura 1|(continua) ritenuto minore. PI(3,4)P2 viene defosforilato a PI(3)P dall'inositolo polifosfato{5}}fosfatasi di tipo IA (INPP4A) e B. PI(3)P viene prodotto anche negli endosomi tramite la fosforilazione di PI dalla classe III PI3K(fosfoinositide 3-chinasi), proteina di smistamento vacuolare Vps34. ( b ) Western blot che illustrano la perdita di espressione di OCRL nella linea cellulare HK2 OCRL CRISPR knockout (KO) rispetto alle cellule di controllo HK2 di tipo selvaggio (WT) con tubulina come controllo di caricamento. ( c-e ) Micrografie confocali Airyscan rappresentative e quantificazione della sovrapposizione dell'antigene 1 dell'endosoma (EEA1) / actina (espressa come percentuale del totale delle vescicole EEA1 þ rilevate) per cellule HK2 WT o OCRL KO trattate con dimetilsolfossido (DMSO) (d) o l'inibitore indicato e fissato usando la soluzione di formaldeide al 4%. In tutti i casi, le immagini illustrano una singola fetta z da una pila confocale elaborata da Airyscan di cellule immunomarcate per EEA1 (giallo), falloidina (actina, magenta) e 40,6-diamidino{ {14}}fenilindolo (DAPI) (ciano). Barre=5 mm. Nelle quantificazioni, le linee indicano la media ± SEM e ogni punto dati è una singola cella. In tutti gli esperimenti, i trattamenti sono stati applicati 16 ore prima della fissazione. In tutte le quantificazioni, la significatività statistica è stata valutata mediante un'analisi della varianza di Kruskal-Wallis (KW) con il test di confronti multipli di Dunn. (c) Cellule WT o KO trattate con DMSO o 100 nM di copanlisib, a dimostrazione del salvataggio della sovrapposizione actina-endosomiale. Test KW: ***P < 0.0{{50}}1,="" confronti="" multipli;="" wt="" dmso="" vs="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" vs="" ko="" copanlisib="" entrambi="" ***p="">< 0.001,="" wt="" copanlisib="" vs="" ko="" copanlisib="" p="0.44" (non="" significativo="" [ns]).="" n="52," 85,="" 67="" e="" 63="" cellule="" rispettivamente="" per="" wt="" dmso,="" wt="" copanlisib,="" ko="" dmso="" e="" ko="" copanlisib.="" (d)="" cellule="" wt="" o="" ko="" trattate="" con="" dmso="" o="" 10="" mm="" di="" alpelisib,="" dimostrando="" il="" salvataggio="" della="" sovrapposizione="" actina-endosomiale.="" test="" kw:="" ***p="">< 0,001,="" confronti="" multipli;="" wt="" dmso="" contro="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" contro="" ko="" alpelisib="" entrambi="" ***p=""><0,001, wt="" alpelisib="" contro="" ko="" alpelisib.="" p=""> 0,99 (ns). N=31, 30, 43 e 41 cellule rispettivamente per WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO e KO alpelisib. (e) Cellule WT o KO trattate con DMSO, 10 mM di GSK2636771 o 10 mM di idelalisib, dimostrando che nessuno dei due composti è in grado di ridurre significativamente la sovrapposizione actina-endosomiale. Test KW: ***P < 0,001,="" confronti="" multipli;="" wt="" dmso="" contro="" ko="" dmso,="" ***p=""><0,001, ko="" dmso="" contro="" ko="" gsk,="" *p="0.04," ko="" dmso="" contro="" ko="" idelalisib,="" p=""> 0,99 (ns). N=159, 130, 203, 122, 131 e 145 cellule rispettivamente per WT DMSO, WT GSK2636771, WT idelalisib, KO DMSO, KO GSK2636771 e KO idelalisib. Per ottimizzare la visualizzazione di questa immagine, consultare la versione online di questo articolo su www.kidney-international.org
La proteinuria LMW è una caratteristica coerente osservata nella sindrome di Lowe/malattia di Dent 2, rivelando che l'OCRL colpisce l'endocitosi mediata dal recettore.5OCRL codifica per il fosfatidilinositolo (PI) 4,5-bisfosfato [PI(4,5)P2] 5- fosfatasi OCRL,6che controlla l'identità lipidica nel percorso endolisosomiale degradando PI(4,5)P2 (Figura 1a). La degradazione carente di PI (4,5) P2 attraverso OCRL è implicata nel mancato rivestimento delle vescicole rivestite di clatrina nei fibroblasti, accompagnata dalla formazione di strutture "cometa" di actina polimerizzata e filamentosa dai risultanti organelli aberranti simili a endosomi precoci.7-9In altri tipi di cellule, in particolare le cellule PT del rene, il deficit di OCRL si traduce in strutture a "cestino" di F-actina che circondano gli organelli endolisosomiali aberranti.10L'eccesso di F-actina blocca il traffico di membrana attraverso la via endocitica ed endolisosomica e si suggerisce di ridurre il riciclo della megalina del recettore multiligando alla membrana apicale, aggravando il difetto all'interno della via endolisosomica.11In accordo con un ruolo principale dell'aberrante F-actina, l'assorbimento endocitico difettoso causato da mutazioni OCRL è alleviato bersagliando il macchinario dell'actina con latruncolina B, o esaurendo le proteine regolatrici dell'actina, nonché da un piccolo deplezione mediata da RNA (siRNA) interferente di PI(4)P 5-chinasi per regolare la sintesi di PI(4,5)P27,10(Figura 1a).
La polimerizzazione dell'actina è sempre più intesa come derivante non solo da PI(4,5)P2 ma anche da altri lipidi fosfoinositidici. Ad esempio, PI(3,4,5)P3 attiva GTPasi di tipo Rho e PI(3)P agisce insieme a PI(4,5)P2 per stimolare la polimerizzazione dell'actina a valle di un'altra GTPasi di tipo Rho, Cdc42.12-14L'interconversione di questi fosfoinositidi è accoppiata al movimento dei lipidi attraverso la via endocitica ed endosomiale. PI(4,5)P2 viene fosforilato dalla fosfatidilinositolo di classe I- 30 -chinasi (PI3K) a PI(3,4,5)P3 sulla membrana plasmatica e diventa progressivamente defosforilato a PI(3,4)P2 e PI (3)P o PI(4,5)P2.14,15PI(3)P è arricchito a livello degli endosomi, dove è essenziale per la loro funzione e costituito prevalentemente dalla fosforilazione diretta di PI da parte di PI3K( di classe III)fosfoinositide 3-chinasi), Vps3416(Figura 1a). In una linea cellulare epiteliale pigmentata retinica (RPE) carente di OCRL, le comete di actina generate sono ridotte dal trattamento con PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)inibitori wortmannin e Vps34-IN1, in accordo con studi biochimici che mostrano una coregolazione dell'actina tramite la coincidenza di PI(3)P e PI(4,5)P2.14
Il salvataggio dell'endocitosi osservato quando si prende di mira il macchinario dell'actina nel paziente OCRL e nelle cellule knockout (KO),7,10insieme alla regolazione a monte dell'actina da parte di PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)attività14e la natura altamente interconnessa della conversione PI, fornisce un'interessante possibilità che la classe I PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)gli inibitori possono essere utili nella sindrome di Lowe. Tali inibitori, sviluppati per la terapia del cancro, sono approvati per l'uso clinico17e sono quindi potenzialmente suscettibili di riutilizzo della droga. Sebbene composti come copanlisib18hanno un'ampia specificità ed effetti collaterali, il successo recente è stato dimostrato per inibitori più specifici. idelalisib,19che prende di mira PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)la subunità p110d, è approvata per il linfoma linfocitico cronico e alpelisib, che prende di mira p110a, è approvato per l'uso nel cancro al seno.20,21Inoltre, alpelisib ha mostrato benefici clinici nei bambini con sindrome PROS/CLOVES,22una rara sindrome da crescita eccessiva risultante dall'attivazione di PIK3A.
Qui, abbiamo testato l'ipotesi che la classe I PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)gli inibitori possono salvare il difetto endocitico dovuto alla perdita di OCRL, utilizzando modelli cellulari e murini consolidati.10,11,23Mostriamo che l'inibizione di PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)l'attività tramite copanlisib o alpelisib, o l'esaurimento mediato da siRNA della subunità catalitica bersaglio di alpelisib p110a riduce l'eccesso di polimerizzazione dell'actina nelle cellule del rene umano (HK2) carenti di OCRL. Concentrandoci su alpelisib come il composto più specifico per uso clinico, dimostriamo che riduce la polimerizzazione dell'actina e migliora l'assorbimento attraverso la via endolisosomiale nelle cellule PT da Ocrl umanizzatoY/-topi in vitro. Inoltre, il trattamento in vivo con alpelisib allevia la proteinuria, riduce la disfunzione del PT e salva i livelli cellulari di megalina nell'Ocrl umanizzatoY/-topi. Questi risultati supportano alpelisib come candidato per il reimpiego di farmaciSindrome di Lowe e malattia di Dent 2.
Figura 2|Gli effetti di Alpelisib sull'actina sono dose-reattivi e ricapitolati da siRNA di PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)p110a. (a) Micrografie confocali rappresentative di Airyscan (fissate utilizzando il fifix di formaldeide al 4% e immunomarcate per l'antigene endosomiale precoce 1 [EEA1], giallo; actina [falloidina], magenta; e 4{{40}},{{ 5}}diamidino-2-fenilindolo [DAPI], ciano; barre=5 mm) e quantificazione delle cellule del rene umano (HK2) wild-type (WT) o knockout (KO) trattate con dimetilsolfossido (DMSO) o le dosi indicate di alpelisib per 16 ore, dimostrando il salvataggio dose-reattivo della sovrapposizione actina-endosomiale. In tutti i casi, le linee indicano la media ± SEM e i punti indicano le singole celle. N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66 e 67 cellule per controllo WT, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO , e KO 2,5, 5, 10, 15, 25 e 50 mM alpelisib, rispettivamente. Significatività statistica valutata dal test di Kruskal-Wallis (KW) con il test di confronti multipli di Dunn: globale ***P < 0,001,="" confronti="" multipli;="" wt="" dmso="" contro="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" contro="" ko="" 5,="" 15,="" 25="" e="" 50="" mm="" alpelisib="" tutti="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" contro="" ko="" 2,5="" mm="" alpelisib="" *p="0.0131," ko="" dmso="" contro="" ko="" 10="" mm="" alpelisib="" **p="0.0043," wt="" dmso="" rispetto="" a="" wt="" 10="" e="" 50="" mm="" alpelisib="" p=""> 0,9999 (non significativo [ns]). (b) Western blot per p110a e la a-tubulina di controllo del carico di cellule WT o KO trattate con siRNA scramble (Scram.) o p110a. (c) Micrografie confocali rappresentative di Airyscan (fissate utilizzando la fissazione di formaldeide al 4% e immunomarcate per EEA1, giallo; actina [falloidina], magenta; e DAPI, ciano; barre=5 mm) e quantificazione delle cellule WT o KO trattate con scramble (S) o siRNA di p110a, dimostrando una riduzione della sovrapposizione di actina{60}}SEE sull'esaurimento di p110a. Test KW con test di confronti multipli di Dunn: ***P < 0,001,="" confronti="" multipli;="" wt="" scramble="" contro="" ko="" scramble,="" ko="" scramble="" contro="" ko="" p110a="" sirna="" entrambi="" ***="" p=""><0,001. n="79," 108,="" 93="" e="" 131="" celle,="" rispettivamente.="" hk2,="" rene="" umano;="" pi3k,="" fosfatidilinositolo-30="" -chinasi;="" sirna,="" piccolo="" rna="" interferente.="" per="" ottimizzare="" la="" visualizzazione="" di="" questa="" immagine,="" consultare="" la="" versione="" online="" di="" questo="" articolo="" su="">
Figura 3|I livelli di fosfatidilinositolo (PI) 4,5-bisfosfato [PI(4,5)P2] sono elevati con OCRL knockout (KO) e PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 , e PI(3)P sono soppressi dal trattamento con alpelisib. In tutti gli esperimenti, i trattamenti indicati sono stati applicati 16 ore prima della fissazione. Nelle quantificazioni, le linee indicano la media ± SEM e ogni punto dati risulta da una singola cella. In tutte le quantificazioni, la significatività statistica è stata valutata mediante un'analisi della varianza di Kruskal-Wallis (KW) con il test di confronti multipli di Dunn. Barre=20mm in tutte le immagini. (a) Micrografie rappresentative ad ampio campo di cellule del rene umano (WT) o KO (HK2) trattate con dimetilsolfossido (DMSO) o 10 mM di alpelisib e quindi fissate con il fifix della membrana plasmatica e immunomarcate per PI(3,4,5 )P3 (rosso) e 40,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (ciano), con quantificazione dell'intensità media dell'etichettatura cellulare PI(3,4,5)P3, a dimostrazione dell'efficacia di alpelisib trattamento sulla sintesi di PI(3,4,5)P3. N=96, 128 e 109 cellule rispettivamente per WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO e KO alpelisib. KW (continua)
Figura 3|(continua) test: complessivo ***P < 0.001,="" confronti="" multipli;="" wt="" dmso="" contro="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" contro="" wt="" alpelisib="" e="" ko="" dmso="" contro="" ko="" alpelisib="" tutti="" ***p="">< 0.0{{70}}1.="" (="" b="" )="" micrografie="" confocali="" rappresentative="" di="" cellule="" wt="" o="" ko="" hk2="" trattate="" con="" dmso,="" 10="" mm-="" o="" 50-="" mm="" alpelisib="" per="" 16="" ore="" e="" quindi="" fissate="" con="" la="" correzione="" di="" golgi="" ed="" etichettate="" utilizzando="" m="" ch="" {{10}}sonda="" xfyve="" pi(3)p="" (magenta)="" e="" dapi="" (ciano),="" con="" quantificazione="" del="" numero="" di="" punti="" pi(3)p-positivi="" rilevati="" in="" cellule="" trattate="" con="" un="" intervallo="" di="" concentrazioni="" di="" alpelisib="" ,="" come="" indicato,="" che="" mostra="" che="" i="" punti="" pi(3)p-positivi="" sono="" ridotti="" in="" modo="" dose-reattivo.="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240="" e="" 215="" cellule="" per="" controllo="" wt,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" e="" ko="" 2,5,="" 5,="" 10,="" 25="" e="" 50="" mm="" alpelisib,="" rispettivamente.="" test="" kw:="" complessivo="" ***p="">< 0,001,="" confronti="" multipli;="" wt="" dmso="" contro="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" contro="" wt="" 10="" e="" 50="" mm="" alpelisib,="" ko="" dmso="" contro="" ko="" 50="" mm="" alpelisib="" tutti="" ***p=""><0,001; ko="" dmso="" contro="" ko="" 2,5="" e="" 5="" mm="" alpelisib="" entrambi="" p=""> 0,9999 (non significativo [ns]); KO DMSO contro KO 10 mM alpelisib **P=0.0049; KO DMSO contro KO 25 mM alpelisib ***P=0.0002. (c) Micrografie rappresentative ad ampio campo di cellule WT o KO HK2 trattate con DMSO o 10 mM di alpelisib e quindi fissate con il fifix della membrana plasmatica e immunomarcate per PI(4,5)P2 (giallo) e DAPI (ciano), con quantificazione di l'intensità media dell'etichettatura cellulare PI(4,5)P2, che mostra un aumento della membrana plasmatica PI(4,5)P2 nelle cellule KO, che è ridotto dal trattamento con alpelisib, in particolare nelle cellule KO. N=126, 112, 85 e 116 cellule rispettivamente per WT DMSO, WT alpelisib, KO DMSO e KO alpelisib. Test KW: complessivo ***P < 0,001,="" confronti="" multipli;="" wt="" dmso="" contro="" ko="" dmso="" e="" ko="" dmso="" contro="" ko="" alpelisib="" entrambi="" ***p=""><0,001; wt="" dmso="" rispetto="" a="" wt="" alpelisib="" p="0.4752" (ns).="" (d)="" micrografie="" rappresentative="" ad="" ampio="" campo="" di="" cellule="" wt="" o="" ko="" hk2="" trattate="" con="" dmso="" o="" 10="" mm="" di="" alpelisib="" e="" quindi="" fissate="" con="" il="" fifix="" di="" formaldeide="" al="" 4%="" e="" immunoetichettate="" per="" pi(4,5)p2="" (giallo)="" e="" dapi="" (ciano),="" con="" quantificazione="" del="" numero="" di="" pi(4,5)p2-puncta="" positivi,="" che="" mostrano="" un="" aumento="" di="" pi(4,5)p2="" puncta="" nelle="" cellule="" ko,="" che="" viene="" ridotto="" dal="" trattamento="" con="" alpelisib,="" in="" particolare="" nelle="" cellule="" ko.="" n="75," 65,="" 52="" e="" 69="" cellule="" rispettivamente="" per="" wt="" dmso,="" wt="" alpelisib,="" ko="" dmso="" e="" ko="" alpelisib.="" test="" kw:="" complessivo="" ***p="">< 0,001,="" confronti="" multipli;="" wt="" dmso="" contro="" ko="" dmso="" e="" ko="" dmso="" contro="" ko="" alpelisib="" entrambi="" ***p=""><0,001; wt="" dmso="" rispetto="" a="" wt="" alpelisib="" p=""> 0,99 (ns). au, unità arbitrarie. Per ottimizzare la visualizzazione di questa immagine, consultare la versione online di questo articolo su www.kidney-international.org.
Come viene utilizzato l'inibitore della fosfoinositide 3-chinasi alpelisib per la sindrome di Lowe/malattia di Dent?
1. RISULTATI
1.1 Gli inibitori PI3K di classe I riducono l'aggregazione dell'actina nelle cellule OCRL-KO HK2
Abbiamo utilizzato l'editing del gene CRISPR-Cas9 per knockout (KO) OCRL nella linea cellulare HK2 per consentire il test della classe I PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)inibitori sulla caratteristica aggregazione di actina a compartimenti endolysosomal.7,9,10,14Il western blotting ha verificato una riduzione del 98,0± 0,7 percento dell'espressione OCRL nei lisati delle cellule KO HK2 (Figura 1b). L'OCRL KO ha ricapitolato il fenotipo del paniere di actina nelle cellule HK2, come indicato da una maggiore sovrapposizione tra F-actina e antigene endosomiale precoce 1 (EEA1), quantificato su pile z di microscopia confocale Airyscan (Figura 1c-e). Questa maggiore sovrapposizione osservata nelle cellule OCRL KO è stata invertita dal trattamento con copanlisib (C), un PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)inibitore che prende di mira p110a e d e, in misura minore, le isoforme p110b e g (Figura 1c). Con il western blotting degli estratti di cellule intere HK2, abbiamo scoperto che il PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)Le subunità regolatorie p110 a, b e d erano tutte ben espresse in entrambe le cellule wild-type (WT) e KO, con solo tracce di livelli dell'isoforma p110g presenti (Figura supplementare S1A).
Abbiamo distinto il PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)specificità dell'inibizione dell'F-actina utilizzando alpelisib (A), un inibitore selettivo di p110a, e GSK2636771 (G) e idelalisib (I), inibitori selettivi di p110b e p110d, rispettivamente (Figura supplementare S1A). Sebbene il trattamento con alpelisib abbia dato una riduzione simile della polimerizzazione dell'actina endosomiale rispetto a copanlisib (Figura 1d), GSK2636771 e idelalisib hanno avuto un piccolo effetto sull'accumulo di actina (Figura 1e). La classe I PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)gli inibitori non avevano una maggiore tossicità su OCRL KO rispetto alle cellule non modificate, sulla base del test MTT (Figura supplementare S1B).
1.2 Il knockdown di Alpelisib e p110a salva il fenotipo dell'actina nelle cellule HK2
Per i nostri studi successivi, ci siamo concentrati su alpelisib in quanto è il PI3K più selettivo e meno tossico(fosfoinositide 3-chinasi)inibitore sviluppato finora ed è attualmente utilizzato per trattare un'iperattivazione a mosaico di PI3K classe Ia nei bambini con sindrome PROS/CLOVES.22Alpelisib ha ridotto i cestini di actina nelle cellule OCRL KO HK2 in modo dose-reattivo (Figura 2a). Gli effetti sono stati osservati a un dosaggio di 10 mM non appena 4 ore dopo il trattamento, senza apparente tossicità (Figura supplementare S2). Per verificare se PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)l'inibizione da parte di alpelisib era la fonte della diminuzione della colorazione dell'actina, abbiamo specificamente ridotto il suo bersaglio, la subunità p110a, usando siRNA (Figura 2b). Rispetto al trattamento con un siRNA di controllo (scrambled in sequenza), il siRNA contro p110a ha prodotto un esaurimento del 78,3 ± 4,8 percento e del 68,9 ± 7,7 percento della proteina p110a nelle cellule WT e OCRL KO HK2, rispettivamente, riflesso da una significativa riduzione dei cestini di actina ( Figura 2c).
1.3 Livelli ridotti di PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 e PI(3)P in cellule HK2 trattate con alpelisib
Per esaminare in che modo i lipidi fosfoinositidici sono influenzati dal trattamento con OCRL KO e alpelisib, abbiamo colorato le cellule HK2 con anticorpi o domini proteici contro PI(3,4,5)P3, PI(3)P e PI(4,5)P2, utilizzando condizioni di fissazione ottimizzate per la membrana plasmatica o colorazione intracellulare.24,25PI(3,4,5)P3 ha una localizzazione diffusa sulla membrana plasmatica e il trattamento con alpelisib (10 mM) ha indotto una forte diminuzione della colorazione per PI(3,4,5)P3 sia nelle cellule WT che OCRL KO, poiché atteso dal suo meccanismo d'azione e specificità per la classe IA PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)p110a (Figura 3a). Si prevede che PI(3,4,5)P3 venga defosforilato progressivamente man mano che le membrane vengono endocitate e trasferite negli endosomi.14,26,27Fissando le cellule in modo tale da preservare la PI(3)P intracellulare,25abbiamo scoperto che i punti PI(3)P sono stati ridotti anche dal trattamento con alpelisib (in modo dose-reattivo evidente da concentrazioni fino a 10 mm per il 16-ora di trattamento) sia nelle cellule WT che OCRL KO (Figura 3b e Figura supplementare S2C). Come previsto, il KO di OCRL nelle cellule HK2 ha indotto un marcato aumento dei livelli di PI(4,5)P2 sia sulla membrana plasmatica (Figura 3c) che intracellulare (Figura 3d), rispetto alle cellule WT.10,28Il trattamento con alpelisib ha ridotto notevolmente l'elevazione di PI(4,5)P2 generata da OCRL KO in entrambi i compartimenti, mentre non ha avuto alcun effetto sulle cellule WT (Figura 3c e d). È stato riportato che Alpelisib inibisce la PI {4}}chinasi b con una concentrazione inibitoria del 50 percento di 0,5 mM,19che è una possibile fonte della riduzione di PI(4,5)P2. Collettivamente, i nostri dati hanno suggerito che alpelisib inibisce l'assemblaggio dell'actina sugli endosomi OCRL KO tramite un effetto bispecifico sui livelli di PI(4,5)P2 e PI(3)P.
Figura 4|Alpelisib allevia i difetti di actina di Oral in colture di Ocrl umanizzatoY/-PTC del mouse (m PTC). (a) Micrografie confocali a proiezione Z di massima intensità rappresentativa di OcrlY/þ o OcrlY/-m PTC trattati con dimetilsolfossido (DMSO) o 10 mM di alpelisib per 16 ore e quindi fissati con il fifisso di formaldeide al 4% e immunomarcati per actina (falloidina) (bianco) e 40,6-diamidino{5}}fenilindolo (DAPI) (blu), con quantificazione del grado in cui le fibre di stress sono presenti in ciascuna condizione, mostrando che le fibre di stress perse in OcrlY/-Le m PTC vengono salvate dal trattamento con alpelisib. Le linee indicano le medie ± SEM e i punti dati indicano ciascuna regione di imaging: N=5 regioni di imaging per condizione (ognuna contenente circa 15-20 cellule). La significatività è stata valutata mediante la normale 1-analisi della varianza (ANOVA) con il test di confronto multiplo di Holm-Sidak, **P=0.001, confronti multipli; Ocrl Y/þ DMSO rispetto a OcrlY/-DMSO **
P=0.002, ocrlY/-DMSO contro ocrlY/-alpelisib **P=0.004, OcrlY/þ DMSO rispetto a OcrlY/- alpelisib P=0.50 (non significativo [ns]). Barre=20mm. (b) Rendering di superfici 3D rappresentative ad alto ingrandimento di Ocrl m PTC trattati con DMSO o 10 mM di alpelisib per 16 ore e quindi fissati con il fifix di formaldeide al 4% e immunomarcati per l'antigene 1 dell'endosoma precoce (EEA1) (viola), actina ( falloidina, gialla) e DAPI (blu) e quantificazione che illustra il salvataggio della sovrapposizione actina-endosomiale da parte di alpelisib. Viste con ingrandimento inferiore che indicano panoramiche di (continua)
Figura 4|(continua) queste regioni sono mostrate nella figura supplementare S4B e nei film supplementari S1–S3. Le linee indicano media ± SEM. N=42, 47 e 45 campi selezionati casualmente per OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/-þ DMSO e OcrlY/-þ condizioni di alpelisib, rispettivamente, in ciascun caso raggruppate da 4 reni di topo per condizione. La significatività è stata testata da Kruskal-Wallis (KW) ANOVA con il test di confronti multipli di Dunn: complessivo ***P < 0.001,="" confronti="" multipli;="" ocrly/þ="" dmso="" rispetto="" a="">Y/-DMSO e OcrlY/-DMSO contro ocrlY/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" rispetto="" a="">Y/-alpelisib P > 0.99 (ns). Barre=1 mm. (c) Micrografie confocali rappresentative di OcrlY/þ o OcrlY/-m PTC trattate con DMSO o 10-mM alpelisib e quindi fissate con il fix di Golgi ed etichettate utilizzando la sonda m Ch-2xFYVE PI(3)P (magenta) e DAPI (ciano), con quantificazione di il numero di punti PI(3)P-positivi rilevati nelle cellule. N=188, 177, 246 e 206 cellule da OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, OcrlY/-þ DMSO e OcrlY/-þ alpelisib, rispettivamente; le cellule sono state raggruppate da 3 reni orali per gruppo. Test KW: globale ***P < 0.001,="" confronti="" multipli;="" ocrly/þ="" dmso="" rispetto="" a="">Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO rispetto a OcrlY/þ alpelisib e OcrlY/-DMSO contro ocrlY/-alpelisib, tutti ***P < 0.001.="" barre="20" mm.="" (d)="" micrografie="" confocali="" rappresentative="" di="" ocrly/þ="" o="">Y/-m PTC trattati con DMSO o 10 mM di alpelisib per 16 ore, quindi fissati con il fifisso di formaldeide al 4% e immunomarcati per fosfatidilinositolo (PI) 4,5-bisfosfato [PI(4,5) P2] (giallo) e DAPI (ciano), con quantificazione del numero di PI(4,5)P2-puncta positivi, che mostra un aumento di PI(4,5)P2 puncta in OcrlY/-cellule, che viene ridotta dal trattamento con alpelisib. N=477, 444, 423 e 494 da OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, OcrlY/-þ DMSO e OcrlY/-þ alpelisib, rispettivamente; le cellule sono state raggruppate da 3 reni orali per gruppo. Test KW: globale ***P < 0.001,="" confronti="" multipli;="" ocrly/þ="" dmso="" rispetto="" a="">Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO rispetto a OcrlY/þ alpelisib e OcrlY/-DMSO contro ocrlY/-alpelisib, tutti ***P < 0.001.="" barre="20" mm.="" per="" ottimizzare="" la="" visualizzazione="" di="" questa="" immagine,="" consultare="" la="" versione="" online="" di="" questo="" articolo="" su="">
1.4 Alpelisib riduce i fosfoinositidi intracellulari e allevia i difetti citoscheletrici in OcrlY/-m PTC
Successivamente abbiamo testato se alpelisib avesse gli stessi effetti nelle cellule primarie delle cellule PT derivate dal modello murino umanizzato con deficit di Ocrl (OcrlY/-), che riassume la polimerizzazione anormale dell'actina e il difetto endocitico osservati nelle cellule derivate dal paziente.10,11Le PTC del mouse (m PTC) espresse in modo simile alla classe I PI3K(fosfoinositide 3-chinasi) subunità regolatorie alle cellule HK2 sia in WT che in OcrlY/-topi e hanno mostrato un profilo di tossicità simile verso alpelisib quando valutato mediante saggi MTT (Figura supplementare S3). L'imaging mediante microscopia confocale ha rivelato una sorprendente interruzione della normale architettura della fibra di stress F-actina in m PTC di OcrlY/-rispetto ai topi OcrlY / þ, probabilmente a causa del trasferimento delle proteine regolatrici dell'actina dalle loro normali posizioni cellulari agli endosomi, poiché grandi assiemi di actina circondano questi organelli e si pensa che siano l'origine del difetto di traffico.10,29Trattamento di ocrlY/- m PTC con alpelisib (10 mM) hanno ripristinato l'architettura della fibra di stress (Figura 4a).
Come viene utilizzato l'inibitore della fosfoinositide 3-chinasi alpelisib per la sindrome di Lowe/malattia di Dent?
Come il problema principale inSindrome di Lowe e malattia di Dent2 è il ridotto traffico endosomiale e la conseguente degradazione della megalina, abbiamo cercato di distinguere l'actina endosomiale dalle fibre di stress. Abbiamo raccolto z-stack confocali a scansione laser in tutte le cellule, ricostruito il modello di colorazione nei rendering di superfici 3D e utilizzato la forma/parametri delle dimensioni per identificare le strutture dell'actina puntata e il grado in cui si sovrapponevano alle strutture endosomiche (Figura supplementare S4 e filmati S1 –S3). Questa analisi ha rivelato che il trattamento con alpelisib ha ridotto la polimerizzazione aberrante dell'F-actina negli endosomi colorati con EEA1, distinta dall'architettura della fibra di stress (Figura 4b). Le m PTC derivate da OcrlY/-i topi hanno mostrato cambiamenti significativi nella colorazione intracellulare per PI(3)P (diminuito) e PI(4,5)P2 (aumento), rispetto a m PTCs da topi WT OcrlY/þ (Figura 4c ed). Trattamento di m PTC da OcrlY/- i topi con alpelisib hanno determinato una significativa riduzione della colorazione intracellulare di PI(3)P e PI(4,5)P2 (Figura 4c ed).
1.5 Alpelisib migliora l'assorbimento endocitico in OcrlY/-m PTC
Successivamente abbiamo valutato se l'effetto di alpelisib sui difetti citoscheletrici e vescicolari osservati in m PTC ha comportato cambiamenti nella capacità di assorbimento endocitico. Per differenziare l'effetto di alpelisib sul legame e/o sull'internalizzazione del ligando, le m PTC sono state prima incubate con albumina sierica bovina (BSA) marcata, per indurre il legame della sonda con i recettori endocitici, e quindi incubate con un mezzo di crescita, per seguire l'internalizzazione dell'albumina (Figura 5a). L'OcrlY/-le cellule hanno mostrato un legame inferiore alla membrana plasmatica dell'albumina sierica bovina 488-di Alexa insieme a una ridotta interiorizzazione dell'albumina rispetto alle cellule OcrlY/þ. Il trattamento con alpelisib ha salvato sia il legame che l'assorbimento dell'albumina nell'OcrlY/-cellule, con un salvataggio complessivo del 50% dell'assorbimento endocitico (Figura 5b e c). Questi dati sono stati supportati dalla misurazione dell'assorbimento totale di albumina (Figure supplementari S5a e b). Abbiamo notato che il rapporto di albumina sierica bovina interiorizzato/legato di Alexa 488- è rimasto simile tra le diverse condizioni (Figura 5d), il che implica che il ridotto assorbimento di albumina è dovuto principalmente a un legame alterato piuttosto che a un processo di interiorizzazione difettoso.
1.6 Alpelisib migliora la disfunzione del PT e l'endocitosi mediata dai recettori in OcrlY/- topi
Abbiamo testato il potenziale effetto terapeutico di alpelisib sulla disfunzione del PT in vivo. I topi orali sono stati somministrati con veicolo o alpelisib (50 mg/kg di peso corporeo al giorno) mediante sonda gastrica per 6 settimane (Figura 6a). Questo regime è stato scelto in base a precedenti studi in vivo che hanno dimostrato efficacia e sicurezza.22,30In linea con la somministrazione di alpelisib nota per causare insulino-resistenza e iperglicemia,22il trattamento con alpelisib ha portato a un aumento significativo della glicosuria sia in Ocrl Y/þ che in OralY/-topi, che potrebbero essere considerati un biomarcatore per il dosaggio del farmaco (Tabella Supplementare S1). Dopo 6 settimane di trattamento con alpelisib, OcrlY/-i topi hanno mostrato una significativa riduzione dell'escrezione urinaria delle proteine LMW CC16 (-34 percento) e dell'albumina (-38 percento), rispetto ai controlli trattati con veicolo (Figura 6b e c), mentre il volume di l'urina e altri parametri non sono stati influenzati (Tabella Supplementare S1). I topi trattati con Alpelisib di entrambi i genotipi hanno mostrato una riduzione simile del tasso di crescita rispetto ai topi di controllo, come descritto in precedenza.22Tuttavia, sia i topi veicolo che quelli trattati hanno guadagnato peso corporeo, indicando che il farmaco non influisce gravemente sullo sviluppo postnatale (Figura 6d e Tabella Supplementare S1).
Per verificare se l'effetto di alpelisib sulla proteinuria LMW riflettesse il recupero dell'endocitosi mediata dal recettore nelle cellule PT, abbiamo seguito l'assorbimento in vivo della b-lattoglobulina marcata con Cy5- in un rene di topo. Ocrl trattato con AlpelisibY/-i topi hanno mostrato un salvataggio significativo dell'assorbimento di b-lattoglobulina etichettato con Cy5-, vicino all'entità dell'internalizzazione osservata nei topi OcrlY/þ trattati con veicolo (Figura 6e). Ciò è stato rispecchiato da un significativo salvataggio nell'espressione del recettore endocitico megalina nelle cellule PT, come osservato dall'immunomarcatura e dal western blotting dei lisati renali di Ocrl trattato con alpelisibY/-topi; si noti che non vi è stato alcun cambiamento nell'espressione del marcatore PT AQP1 (Figura 6f e g e Figura supplementare S5C e D). Questi dati mostrano che il PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)inibitore alpelisibinduce un sostanziale miglioramento del macchinario endocitico PT e riduce la proteinuria LMW in un modello murino umanizzato per la sindrome di Lowe.
Figura 5|Alpelisib migliora l'assorbimento endocitico di Ocrl umanizzatoY/-PTC del mouse (m PTC). (a) Schema che illustra l'esperimento di inseguimento del polso utilizzato per esaminare il legame e l'interiorizzazione dell'albumina di siero bovino (BSA) di Alexa 488- in m PTC. Le cellule sono state esposte ad Alexa 488-BSA (0.2 mg/ml) per 1 ora a 4 gradi per consentire alla BSA di legarsi ai recettori della superficie cellulare (impulso) e quindi riscaldate a 37 gradi nel mezzo cellulare per 20 minuti prima della fissazione per consentire l'internalizzazione del ligando (chase). (b) Micrografie confocali rappresentative di OcrlY/þ o OcrlY/-m PTC trattati con dimetilsolfossido (DMSO) o 10 mM di alpelisib per 16 ore e sottoposti all'esperimento di inseguimento di impulsi Alexa 488-BSA (verde), prima di essere fissati ed etichettati per 40,6-diamidino{ {6}}fenilindolo (DAPI) (blu). La fase dell'impulso dell'esperimento è mostrata nel pannello superiore per ciascuna condizione, con l'inseguimento di seguito. Barre=20 mm. (c) Quantificazione della superficie cellulare Alexa 488-BSA (i) e Alexa {9}}BSA internalizzato (ii), valutate come intensità di fluorescenza FL medie per cellula. Alpelisib salva il legame e l'interiorizzazione della BSA salvati osservati in OcrlY/-cellule. N=209, 228, 186 e 196 cellule per OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, OcrlY/ DMSO e OcrlY/-condizioni di alpelisib, rispettivamente in (i) e N{0}}, 183, 199 e 233 cellule per OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ alpelisib, OcrlY/-DMSO e OcrlY/-condizioni di alpelisib, rispettivamente in (ii), in ogni caso raggruppate da 2 reni di topo per condizione; ogni punto dati rappresenta l'intensità media della fluorescenza FL in una singola cella. La significatività è stata verificata mediante l'analisi della varianza (ANOVA) di Kruskal-Wallis (KW) con il test di confronti multipli di Dunn: per (i) BSA della superficie cellulare, globale ***P < 0.001,="" confronti="" multipli:="" ocrly/þ="" dmso="" contro="">Y/-DMSO e OcrlY/-DMSO contro ocrlY/-alpelisib ***P < {{0}}.001;="" ocrly/þ="" dmso="" rispetto="" a="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.60" (non="" significativo="" [ns]);="" per="" (ii)="" bsa="" internalizzato,="" nel="" complesso="" ***p="">< 0,001,="" confronti="" multipli:="" ocrly/þ="" dmso="" rispetto="" a="">Y/-DMSO e OcrlY/-DMSO contro ocrlY/-alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" rispetto="" a="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.66" (ns).="" (d)="" quantificazione="" del="" rapporto="" tra="" la="" superficie="" cellulare="" alexa="" 488-="" bsa="" e="" le="" intensità="" di="" fluorescenza="" fl="" di="" alexa="" 488-bsa="" interiorizzate,="" che="" non="" mostrano="" differenze="" significative="" nei="" rapporti="" tra="" ciascuna="" condizione.="" ciascun="" punto="" rappresenta="" la="" media="" del="" rapporto="" in="" un="" campo="" contenente="" circa="" 15–20="" celle="" (n="13," 13,="" 10="" e="" 11="" campi="" selezionati="" casualmente="" per="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="">Y/-DMSO e OcrlY/-condizioni di alpelisib, rispettivamente, in ciascun caso raggruppate da 2 reni di topo per condizione). La significatività è stata testata da KW ANOVA con i test di confronto multiplo di Dunn: P=0 complessivo.46 (ns), confronti multipli: OcrlY/þ DMSO rispetto a OcrlY/-DMSO e OcrlY/-DMSO contro ocrlY/-alpelisib P > 0.99 (ns); OcrlY/þ DMSO rispetto a OcrlY/þ alpelisib P=0.84 (ns). Per ottimizzare la visualizzazione di questa immagine, consultare la versione online di questo articolo su www.kidney-international.org.
Figura 6|Alpelisib migliora la funzione del tubulo prossimale (PT) dei topi OcrlY/L, ripristinando l'assorbimento del ligando e l'espressione della megalina. (a) Configurazione sperimentale. I topi orali sono stati trattati per 6 settimane con una dose orale giornaliera di carbossimetilcellulosa 1% (veicolo) o alpelisib (50 mg/kg di peso corporeo). L'ultimo giorno del trattamento, ai topi è stata iniettata b-lattoglobulina marcata con Cy5- (N=6 OcrlY/-o 8 ocrlY/-topi per gruppo). (b–d) I valori D mostrati indicano la variazione media da BL a D42 per la condizione ± SEM. (b) la proteina 16 delle cellule Clara (CC16), (c) la produzione urinaria di albumina (entrambi entro 15 ore) e (d) la massa corporea è stata misurata in topi OcrlY/- trattati con veicolo o alpelisib al momento indicato. Ogni punto rappresenta 1 mouse. La significatività è stata valutata mediante 2-t-test di Student accoppiato a coda; in (b) CC16 (continua)
Figura 6|(continua) variazione dell'output rispetto alla linea di base; þ veicolo, P=0.9802 (non significativo [ns]), þ alpelisib, *P=0.0334; in (c) variazione della produzione di albumina rispetto alla linea di base; þ veicolo, P=0.0502 (ns), þ alpelisib, ***P ¼ 0,0006; in (d) variazione della massa corporea rispetto al basale; þ veicolo, ***P < 0,0001,="" þ="" alpelisib,="" **p="0.0083." (e)="" micrografie="" confocali="" rappresentative="" che="" mostrano="" la="" b-lattoglobulina="" (magenta)="" marcata="" con="" cy5-15="" minuti="" dopo="" l'iniezione="" nella="" vena="" della="" coda="" ed="" etichettata="" per="" 40,6-diamidino-2-fenilindolo="" (dapi)="" (ciano),="" oltre="" alla="" quantificazione="" dei="" corrispondenti="" segnali="" fluorescenti="" fl="" dai="" reni="" di="" topo="" ocrl="" (n="412," 500="" e="" 588="" tubuli,="" rispettivamente,="" per="" il="" veicolo="" ocrly/þþ,="">Y/-þ veicolo e OcrlY/-þ alpelisib) per 3 topi per gruppo di trattamento. L'assorbimento di b-lattoglobulina viene salvato dal trattamento con alpelisib. Barre ¼ 20 mm. Nelle quantificazioni, ogni punto rappresenta l'intensità della fluorescenza FL normalizzata dall'area del tubulo; i dati tracciati indicano la media ± SEM. La significatività è stata valutata dal test di Kruskal-Wallis (KW) seguito dal test di confronto multiplo di Dunn; ***P < 0,001,="" confronti="" multipli;="" ocrly/þþ="" veicolo="" rispetto="" a="">Y/-þ veicolo e OcrlY/-þ veicolo contro OcrlY/-þ alpelisib, entrambi ***P < 0.001.="" (f)="" analisi="" western="" blotting="" e="" densitometria="" dei="" livelli="" di="" megalina="" in="" lisati="" renali="" interi="" da="" topi="" orali.="" l'a-tubulina="" è="" stata="" utilizzata="" come="" controllo="" del="" carico.="" l'espressione="" megalina="" ridotta="" in="">Y/-viene salvato da alpelisib. Nella quantificazione dell'analisi densitometrica, ogni punto rappresenta 1 topo (N=4 OcrlY/þþ veicolo e OcrlY/-þ veicolo e N=3 ocrlY/-þ topi alpelisib); le linee indicano media ± SEM. La significatività è stata valutata da 2-test t di Student con coda spaiata: veicolo OcrlY/þþ rispetto a OcrlY/-þ veicolo; **P ¼ 0.0057, ocrlY/-þ veicolo contro OcrlY/- þ alpelisib, *P=0.0246. (g) Micrografie confocali rappresentative con inserti ad alto ingrandimento e quantificazione dell'intensità della megalina (giallo) in AQP1þ PT (magenta) dai reni orali sono state anche etichettate per DAPI (ciano) che illustrano il salvataggio dei livelli di megalina dopo il trattamento con alpelisib. Barre=20 mm. Nelle quantificazioni, ogni punto rappresenta l'intensità della fluorescenza FL normalizzata dall'area del tubulo; i dati tracciati indicano la media ± SEM; N=142, 191 e 266 tubuli, rispettivamente, per il veicolo OcrlY/þþ, OcrlY/-þ veicolo e OcrlY/-þ alpelisib per 3 topi per gruppo di trattamento. La significatività è stata valutata mediante l'analisi della varianza KW seguita dal test di confronto multiplo di Dunn; complessivo ***P < 0.001,="" confronti="" multipli;="" ocrly/þþ="" veicolo="" rispetto="" a="">Y/-þ veicolo e OcrlY/-þ veicolo contro OcrlY/-þ alpelisib, entrambi ***P < 0.001.="" per="" ottimizzare="" la="" visualizzazione="" di="" questa="" immagine,="" consultare="" la="" versione="" online="" di="" questo="" articolo="" su="">
Come viene utilizzato l'inibitore della fosfoinositide 3-chinasi alpelisib per la sindrome di Lowe/malattia di Dent?
2. DISCUSSIONE
Attualmente non esiste un trattamento per alleviare l'endocitosi difettosa che causa la disfunzione del PT inSindrome di Lowe e malattia di Dent2. I nostri risultati rivelano che alpelisib allevia il fenotipo aberrante dell'actina riducendo i livelli di PI(4,5)P2 e PI(3)P, causando un sostanziale miglioramento del meccanismo endocitico e della capacità di assorbimento nei sistemi cellulari e un modello murino umanizzato per Sindrome di Lowe/malattia di Dent 2. Questi risultati supportano il legame tra lipidi fosfoinositidici, polimerizzazione dell'actina e traffico endocitico, con rilevanza immediata per cellule epiteliali altamente attive coinvolte in processi omeostatici cruciali (Figura 7). Data la mancanza di terapie efficaci e l'apparente sicurezza di questa classe di PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)inibitori, alpelisib è un candidato promettente per il reimpiego di farmaciSindrome di Lowe e malattia di Dent.
La proteinuria LMW è la caratteristica più coerente riscontrata nei pazienti conSindrome di Lowe e malattia di Dent2 a causa di mutazioni inattivanti in OCRL.4Queste proteine LMW possono essere facilmente rilevate e quantificate, offrendo un fedele biomarcatore di endocitosi difettosa mediata da recettori nelle cellule PT.1 La proteinuria LMW è particolarmente rilevante, poiché viene rilevata in modo più coerente e spesso prima rispetto ad altri soluti (p. es., glucosio, fosfato, amminoacidi) facenti parte della classica "sindrome di Fanconi renale", almeno nei disturbi congeniti della via endolisosomica.1Qui, mostriamo che alpelisib salva la capacità di assorbimento endocitico apicale delle cellule PT in vitro e in vivo, a causa dei livelli ripristinati del recettore della megalina sulla membrana plasmatica. Questo effetto si riflette in significative riduzioni della perdita urinaria di proteine LMW (CC16 e albumina) in OcrlY/-topi trattati con alpelisib per 6 settimane. Questi effetti di alpelisib sono stati osservati in m PTC, che mantengono la loro differenziazione apicale e sono particolarmente adatti per studiare l'endocitosi mediata da recettori in fisiologia e malattia.9 In particolare, abbiamo ottenuto m PTC da un modello murino umanizzato che esprime INPP5B umano in OcrlY/-; Inpp5b-/-background, che ci permette di indagare le conseguenze specifiche della perdita di attività OCRL.11,23
Il salvataggio dell'endocitosi da parte di alpelisib è spiegato dal suo effetto sul macchinario dell'actina, chiaramente evidenziato nelle cellule OCRL KO HK2 e nelle m PTC. Le nostre osservazioni quindi confermano ed estendono studi precedenti che mostrano il legame tra il controllo dell'equilibrio del fosfoinositide e la F-actina nella via endosomiale precoce nei pazienti con OCRL e nelle cellule KO.7,10La perdita funzionale dell'attività OCRL compromette la degradazione di PI(4,5)P2, che, a sua volta, porta a un mancato rivestimento delle vescicole rivestite di clatrina con conseguente organelli endosomiale aberranti in vari tipi cellulari, comprese le cellule PT.7-10Abbiamo recentemente dimostrato che l'eccesso di F-actina diminuisce il riciclo della megalina del recettore multiligando sulla membrana apicale delle cellule PT, causando endocitosi difettosa e proteinuria LMW.11
I nostri dati indicano che il meccanismo d'azione di alpelisib sull'actina endosomiale deriva da un effetto bispecifico dell'inibizione di alpelisib: primo sulla produzione di PI(3,4,5)P3 e la sua conversione in PI(3)P, e secondo sulla produzione di PI(4,5)P2. La diminuzione dei livelli di PI(4,5)P2 contrasta direttamente il deficit di OCRL ed è in accordo con il lavoro precedente per alleviare l'eccesso di actina e aumentare l'efflusso endocitico mediante una riduzione dei livelli di fosfatidilinositolo 4-fosfato 5-chinasi , un enzima che genera PI(4,5)P2.10Alpelisib ha una concentrazione inibitoria di 0,5 mM del 50% sulla PI(4,5)P2 che genera la chinasi PI4Kb, che potrebbe essere responsabile, o potrebbe derivare da effetti più generali sull'equilibrio del fosfoinositide risultanti dalla combinazione di OCRL Trattamento KO e alpelisib. Abbiamo identificato quella classe IA PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)l'inibizione da parte di alpelisib è rilevante per l'inibizione dell'actina poiché la deplezione mediata da siRNA di p110a inibisce l'accumulo di actina in modo simile al trattamento con alpelisib e copanlisib (che non è segnalato per inibire i PI4K). Nelle cellule RPE abbiamo precedentemente osservato che il siRNA di INPP4A, che converte PI(3,4)P2 in PI(3)P, inibisce l'assemblaggio dell'actina nelle cellule OCRL KO, fornendo un percorso dall'inibizione di PI(3,4,5) Produzione di P3 a una diminuzione del PI(3)P endosomiale. Abbiamo dimostrato che alcuni PI(3)P rimangono, presumibilmente il pool prodotto all'inizio dell'endosoma dalla classe III PI3K, Vps34 perché abbiamo scoperto che il traffico endosomiale è migliorato piuttosto che soppresso dal trattamento con alpelisib. La complessa coregolazione del metabolismo del PI e la sua rilevanza per l'inattivazione dell'OCRL è stata anche evidenziata in un recente studio in cui le funzioni non catalitiche della fosfoinositide 3- fosfatasi PTEN attivano la degradazione del PI(4,5)P2 tramite PLCXD, alleviando i fenotipi cellulari e l'assorbimento di ligandi in un modello di pesce zebra.31
L'attenuazione del fenotipo dell'actina mediante livelli ridotti di PI(4,5)P2 e PI(3)P mediante il trattamento con alpelisib concorda con l'azione sinergica di PI(4,5)P2 e PI(3)P nel reclutamento di SNX9 per l'attivazione il macchinario dell'actina negli endosomi Ocrl,14suggerendo una corrispondenza molto efficace della specificità di alpelisib per manipolare la regolazione molecolare dell'attivazione dell'actina a livello degli endosomi. A sua volta, come precedentemente dimostrato, il ridotto assemblaggio dell'actina endosomiale, a sua volta, porta a un miglioramento dell'endocitosi PT nelle cellule carenti di OCRL.10Sarà necessaria un'ulteriore caratterizzazione per comprendere meglio se la regolazione dell'actina attraverso il metabolismo del fosfoinositide sia la vera fonte dell'effetto terapeutico che osserviamo con alpelisib nell'OcrlY/-modello di topo. Perché classe I PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)regolare i percorsi che controllano la crescita cellulare, la proliferazione, la sopravvivenza, il metabolismo e l'autofagia,32non si può escludere che il salvataggio endocitico sia dovuto ad effetti direttamente su PI(3,4,5)P3 e all'effetto combinato su altre vie modulate da PI3K di classe I. È inoltre necessario ulteriore lavoro per verificare se PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)gli inibitori potrebbero anche alleviare le manifestazioni neurologiche e cliniche dei pazienti che presentano mutazioni OCRL.4
La recente esperienza di alpelisib in pazienti pediatrici con sindrome PROS/CLOVES suggerisce che il farmaco ha il potenziale per essere ben tollerato. Alpelisib viene assunto per via orale, mira selettivamente all'isoforma di PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)classe I e mostra un profilo di tossicità minore rispetto agli inibitori pan-PI3K. Poiché alpelisib non blocca completamente PI3K(fosfoinositide 3-chinasi)attività, mantenendo così le funzioni della via di segnalazione, può essere particolarmente adatto per un uso a lungo termine. È interessante notare che l'iperglicemia derivante dall'uso di alpelisib può essere gestibile con cambiamenti nella dieta.22Poiché la disfunzione del PT è la prima manifestazione di malattia renale osservata nei bambini piccoli con malattia di Dent 2 e sindrome di Lowe, il trattamento precoce di tale disfunzione del PT, che porta a miglioramenti nel profilo metabolico e nella crescita, potrebbe quindi rallentare la progressione verso la malattia renale cronica e quindi avere un impatto significativo sulla durata e sulla qualità della vita.33Sebbene le manifestazioni patologiche della mutazione OCRL siano particolarmente ampie, studi recenti basati su ampie coorti di pazienti genotipizzati con sindrome di Lowe della malattia di Dent 2 non hanno evidenziato effetti significativi del tipo di mutazione o della posizione della mutazione sulla sopravvivenza renale.34Collettivamente, i nostri dati evidenziano il potenziale per riproporre alpelisib per il trattamento della disfunzione PT nella sindrome di Lowe/malattia Dent 2, fornendo così una base per un'implementazione rapida ed economica negli studi clinici sull'uomo.
3. METODI
3.1 I dettagli completi possono essere trovati nei Metodi Supplementari.
Le cellule HK2 sono state trattate con copanlisib, alpelisib, GSK2636771 o idelalisib alle concentrazioni indicate per 16 ore se non diversamente indicato. Le proteine sono state estratte utilizzando metodi standard da cellule o tessuti renali e il western blotting è stato eseguito utilizzando anticorpi pubblicati o disponibili in commercio. Il knockdown di siRNA è stato eseguito utilizzando 2 trasfezioni 72 e 24 ore prima dell'analisi. Abbiamo utilizzato OcrlY/þ abbinato per età e sesso; Inpp5b- /-; e ocrlY/-; Inpp5b-/- compagni di cucciolata di topo che ospitano l'espressione BAC-INPP5B. Le colture primarie di m PTC sono state generate dai reni raccolti da topi Ocrl di 8 settimane e la capacità endocitica di m PTC orali è stata valutata misurando l'assorbimento di albumina. I trattamenti con Alpelisib sono stati di 10 mM per 16 ore se non diversamente indicato. L'assorbimento di albumina in m PTC è stato valutato utilizzando un protocollo "pulse-chase" per valutare il legame apicale e l'assorbimento risultante. Le m PTC sono state colorate durante la notte con l'appropriato anticorpo primario e per 45 minuti con opportuni anticorpi secondari coniugati con fluoroforo FL e/o Alexa{9}} falloidina. La colorazione PI(3)P su m PTC è stata eseguita utilizzando la sonda di dominio FYVE. L'analisi dell'immagine è stata eseguita con CellProfifiler, utilizzando pipeline personalizzate per misurare la sovrapposizione di actina/EEA1 e il numero di puncta, e con ImageJ per misurare l'intensità dell'immunofluorescenza e i bordi rilevati per calcolare il punteggio della fibra di stress. I dati quantitativi sono stati espressi come media ± errore standard della media. Per gli esperimenti in vivo, i topi di 6 settimane di età sono stati trattati con veicolo o alpelisib 50 mg/kg di peso corporeo. L'urina è stata raccolta ogni 14 giorni e gli animali sono stati sacrificati dopo 42 giorni di trattamento, con prelievo di sangue e reni. La capacità endocitica PT dei topi orali è stata esaminata misurando l'assorbimento di b-lattoglobulina.
4. INFORMATIVA
JLG ha un finanziamento da AstraZeneca per una borsa di studio nel suo laboratorio. SPJ fa parte dei comitati consultivi e detiene la partecipazione azionaria di Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics e Adrestia Therapeutics ed è un partner scientifico per Ahren Innovation Capital. Tutti gli altri autori non hanno dichiarato interessi concorrenti.
5. RINGRAZIAMENTI
Questo lavoro è stato sostenuto da European Research Council Grant 281971, Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, Wellcome Trust Developing Concept Fund 209749/Z/17/Z, Isaac Newton Trust Research Grant 18.23 (j) a JLG e Wellcome Investigator Award 206388/Z/17/Z a SPJ e riconosciamo il finanziamento del Gurdon Institute da Wellcome Trust (092096) e CRUK (C6946/A14492). Siamo grati alla Cystinosis Research Foundation (Irvine, CA), alla Swiss National Science Foundation (sovvenzione per il progetto 310030_189044), al programma di ricerca clinica prioritario (KFSP) RADIZ (Rare Disease Initiative Zurigo) dell'UZH,
National Center of Competence in Research (NCCR) Kidney Control of Homeostasis (Kidney.CH) per il supporto e NIDDK/NIH e Lowe Syndrome Trust/UK per supportare lo sviluppo dei topi orali. Ringraziamo Robert L. Nussbaum (Invitae Corporation e UCSF, San Francisco, CA) e Maria Antonietta De Matteis (Istituto Telethon di Genetica e Medicina, Università Federico II di Napoli, Napoli, Italia) per aver fornito i fondatori della colonia di topi Oral;
ed Eric Olinger (UZH, Zurigo) per discussioni fruttuose. Ringraziamo Nadine Näegele e Daniela Nieri per aver fornito assistenza tecnica durante la raccolta e l'analisi delle urine; Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Parigi) per aver condiviso con noi il protocollo dettagliato per la preparazione di Alpelisib per il trattamento in vivo; e Renata Kozyraki e Pierre Verroust per aver fornito i reagenti. Ringraziamo anche il Centro per la microscopia e l'analisi delle immagini dell'Università di Zurigo (Zurigo, Svizzera) e la struttura di fisiologia integrativa dei roditori di Zurigo (ZIRP) per aver fornito l'attrezzatura per l'acquisizione di immagini e il supporto tecnico durante gli esperimenti in vivo.
Come viene utilizzato l'inibitore della fosfoinositide 3-chinasi alpelisib per la sindrome di Lowe/malattia di Dent?
6. MATERIALE SUPPLEMENTARE
File supplementare (PDF)
Metodi supplementari e riferimenti.
Tabella S1. Peso corporeo, urina e parametri ematici nel tempo in topi orali trattati con alpelisib o veicolo.
Figura S1. Espressione dell'isoforma p110 e saggi di citotossicità dose-risposta del farmaco nelle cellule HK2.
Figura 2. PI3Kinibitore alpelisibripristina la sovrapposizione actina-endosomiale e riduce i livelli di PI(3)P in modo dose-sensibile 4 ore dopo il trattamento farmacologico nelle cellule HK2.
Figura S3. Espressione dell'isoforma p110 e tossicità di alpelisib nelle mPTC di Ocrl.
Figura S4. Flusso di lavoro dell'analisi della sovrapposizione EEA1/actina in mPTC Ocrl.
Figura S5. Alpelisib ripristina l'assorbimento di albumina in OcrlY/-mPTC. L'espressione Aqp1 non è influenzata. File supplementare (Film)
Film S1. Rendering 3D di Imaris della sovrapposizione di EEA1/actina in OcrlY/þ mPTC trattati con DMSO. Rappresentazione del rendering 3D della superficie di una pila confocale di OcrlY/þ mPTC trattati con DMSO per 16 ore, quindi fissati con il fifisso di formaldeide al 4% e immunomarcati per EEA1 (viola), actina (falloidina; giallo) e DAPI (blu), illustrando poco associazione actina/endosomiale. Barra=5 mm.
Film S2. Rendering 3D Imaris di sovrapposizione EEA1/actina in OcrlY/-mPTC trattati con DMSO. Rappresentazione rappresentativa della superficie 3D di una pila confocale di OcrlY/– mPTC trattati con DMSO per 16 ore, quindi fissati con il fifisso di formaldeide al 4% e immunomarcati per EEA1 (viola), actina (falloidina; giallo) e DAPI (blu), illustrando il puntato actina che si associa vicino a strutture endosomiche. Barra=5mm.
Film S3. Rendering 3D Imaris di sovrapposizione EEA1/actina in OcrlY/- mPTC trattati con alpelisib. Rappresentazione rappresentativa della superficie 3D di una pila confocale di OcrlY/– mPTC trattata con 10 mM di alpelisib per 16 ore, quindi fissata con il fifix di formaldeide al 4% e immunomarcata per EEA1 (viola), actina (falloidina; giallo) e DAPI (blu) , che illustra il salvataggio delle strutture dell'actina puntata attorno agli endosomi. Barra=5 mm.
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Copyright ª 2020, Società Internazionale di Nefrologia. Pubblicato da Elsevier Inc. Questo è un articolo ad accesso aperto con licenza CC BY (HTTP:// creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
Institute, Università di Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QN, Regno Unito. E-mail: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; o Olivier Devuyst, Istituto di Fisiologia, Università di Zurigo, Zurigo, Svizzera. E-mail: olivier.devuyst@uzh.ch5 Questi autori hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.6Questi autori hanno co-diretto lo studio. Ricevuto l'8 agosto 2019; rivisto il 1 maggio 2020; accettato il 15 maggio 2020; pubblicato online il 9 settembre 2020
