Screening fitochimico ed attività estrogenica dei glicosidi totali di Cistanche Deserticola

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Astratto

Nel corso dei decenni, ci sono stati continui sforzi per migliorare la qualità della vita umana. La sindrome postmenopausale è una seria preoccupazione per il benessere della salute delle donne. La terapia ormonale è attualmente il cardine del trattamento per questa condizione. Tuttavia, questa terapia potrebbe portare all'abuso di estrogeni, portando a reazioni avverse ed effetti collaterali. Di conseguenza, la terapia ormonale non ha avuto successo nel miglioramento della sindrome postmenopausale.Cistanche deserticheè un'erba tonica classica nella medicina tradizionale cinese. Presenta una significativa attività estrogenica. I principali composti attivi di questa erba sono i glicosidi. In un precedente esperimento, sono stati identificati tre fattori importanti che contribuiscono alla resa totale di glicoside, resa di acteoside e attività estrogenica, vale a dire, concentrazione dell'eluente, pH e volume dell'eluente. In questo esperimento, è stato determinato un processo di purificazione ottimale utilizzando una metodologia di superficie di risposta di progettazione composita centrale per ottenere glicosidi da questa erba. Una concentrazione di eluente (etanolo) dell'85 percento e un volume di 25 BV a un pH di 11 sono risultati ottimali. Ventuno composti attivi sono stati identificati mediante un'analisi di spettrometria di massa a tempo di volo con cromatografia liquida/quadrupolo ad alte prestazioni. Questo studio fornisce preziose informazioni per ulteriori ricerche approfondite che valutano le attività estrogeniche dei glicosidi totali diCistanche desertiche.

Parole chiave: disegno centrale composito; Cistanche deserticola glicosidi totali; LC/Q-TOF-MS; tecnologia di purificazione; test di crescita uterina.

introduzione

Cistanche deserticheè una classica erba tonica commestibile. È stato menzionato per la prima volta nel classico delle erbe di Shen Nong e si è arruolato nel grado più alto. È un'erba calda e dolce. Ha numerose proprietà medicinali, come il nutrimento del fegato e dei reni, il rafforzamento dei muscoli e delle ossa e il miglioramento della regolazione immunitaria insieme ad attività antietà e antitumorali [1-4]. Dagli estratti di questa erba sono stati isolati e identificati alcuni composti naturali, i principali sono glicosidi feniletanoidi, lignanoidi, iridoidi, polisaccaridi e alcaloidi [5-8].

I farmaci ottenuti dalle piante medicinali contengono vari composti attivi, che sono i principali responsabili delle loro azioni terapeutiche. L'efficacia dello stesso farmaco ottenuto da diverse fonti vegetali può variare a causa delle differenze nel tipo e nella quantità di principi attivi in ​​esso presenti. Pertanto, è importante identificare e quantificare tutti i composti attivi presenti nei farmaci ottenuti dalle piante medicinali. Lo stesso vale per C. deserticola. La metodologia della superficie di risposta è un metodo sperimentale per studiare l'interazione tra diversi fattori contemporaneamente [9-10]. Può essere utilizzato per l'ottimizzazione dei parametri di estrazione per i fitofarmaci e la stima quantitativa dei composti attivi nei farmaci. Il design composito centrale (CCD) è uno dei progetti sperimentali utili nella metodologia della superficie di risposta. Rispetto ai modelli ortogonali e uniformi, il CCD ha una maggiore precisione e una migliore prevedibilità [11].

La sindrome postmenopausale può ridurre notevolmente la qualità della vita nelle donne. Normalmente, gli estrogeni sono usati per trattare questa condizione. Tuttavia, l'uso a lungo termine di estrogeni può portare ad abuso, causando così varie reazioni avverse ed effetti collaterali. Pertanto, è imperativo scegliere una terapia alternativa, preferibilmente un farmaco a base di erbe contenente estrogeni come ingrediente attivo per il trattamento della sindrome postmenopausale [12-13].

In un esperimento preliminare, le strutture di vari composti naturali ottenuti da C. deserticola sono state identificate mediante spettrometria di massa (MS) [14]. È stato confermato che i glicosidi sono i principali composti attivi con attività estrogenica significativa [14-15]. Per sviluppare un principio attivo estrogenico sicuro ed efficace in un nuovo farmaco, è necessaria un'indagine approfondita sul TGCD dopo la purificazione. In questo studio, il CCD è stato utilizzato per la prima volta per ottimizzare la purificazione dei glicosidi totali di C. deserticola (TGCD). Successivamente, il test di crescita dell'utero è stato utilizzato per valutare le attività estrogeniche dello stesso glicoside. Per l'analisi qualitativa dei composti di TGCD dopo la purificazione è stata utilizzata la cromatografia liquida ad alte prestazioni/spettrometria di massa a tempo di volo quadrupolo (HPLC/Q-TOF-MS). Questo processo è stato applicato per dimostrare esplicitamente la presenza di vari composti attivi con attività estrogenica nel TGCD. Questo può fornire contemporaneamente la base per il suo uso clinico nella sindrome postmenopausale in sostituzione degli estrogeni.

Procedura sperimentale

Strumenti

Sistema HPLC Agilent 1290 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA), sistema LC/MS quadrupolo Agilent serie 6530 (Q-TOF) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) e HPLC chimico{ {5}}Le workstation D sono state utilizzate come strumenti cromatografici per l'elaborazione dei dati. Per l'intero studio è stata utilizzata acqua ultrapura Milli-Q. Bilancia analitica elettronica AR1140 (Ohaus International Ltd.); lettore di micropiastre 680 (Bio-Rad Corporation); e la centrifuga ad alta velocità 64R (Beckman Coulter Allegra) sono state utilizzate per la preparazione del campione.

Droghe e prodotti chimici

C. deserticola è stata acquistata dal mercato della droga e identificata dal Prof. Zhang Delian (Università di Commercio di Harbin, Cina). Il dietilstilbestrolo standard (puro al 99%, lotto n. 60518) è stato acquistato dal Dr. Ehrenstorfer (Germania). Altri standard acteoside (111530-200505) ed echinacoside (111670-200503) sono stati ottenuti dall'Istituto nazionale per il controllo dei prodotti farmaceutici e biologici, Pechino, Cina. La purezza di ogni standard era > 98 percento. Acetonitrile (ACN), metanolo e acido formico (grado MS) sono stati acquistati da Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL, USA). L'acqua ultrapura è stata ottenuta da Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd. (Hangzhou, Cina). Tutti i reagenti disponibili in commercio erano di grado analitico.

Preparazione dei glicosidi totali della soluzione di purificazione di C. deserticola

Dopo l'immersione in etanolo al 75% per 12 ore, la polvere grezza di C. deserticola (100 g) è stata estratta con 800 ml di etanolo al 75% (v/v) a 80 gradi per 150 minuti a riflusso. È stato quindi filtrato attraverso un filtro a due piani e successivamente estratto con 800 mL di etanolo al 75% due volte per altri 150 minuti. Successivamente i filtrati sono stati riuniti e concentrati sotto vuoto a 45 gradi. L'estratto è stato ottenuto rimuovendo il solvente. All'estratto è stata aggiunta una certa quantità di acqua distillata per ottenere una concentrazione di 0,5 g/mL, che è stata utilizzata per schermare il processo di purificazione.

Per l'adsorbimento mediante resina macroporosa AB-8, il pH della soluzione del campione di prova è stato regolato su 11. In primo luogo, è stata utilizzata acqua distillata 2 BV per lavare via le impurità. Quindi, l'eluente ad una concentrazione di 25 BV 85 percento di etanolo è stato eluito e raccolto. Infine, l'eluente purificato raccolto è stato fuso. All'estratto è stata aggiunta una certa quantità di acqua distillata per ottenere una concentrazione di 1,5 g/mL, che è stata utilizzata per la somministrazione intragastrica. Per il controllo positivo, è stata preparata una soluzione di dietilstilbestrolo (20 ug/mL) con polvere di dietilstilbestrolo.

In base al rapporto di purificazione ({0}}.6), una certa quantità di estratto (equivalente a 1 g di C. deserticola) è stata trasferita in un matraccio tarato da 10 ml, disciolto in una soluzione di metanolo al 50 percento (v/v) in un bagno ad ultrasuoni per 5 minuti e diluito a 10 ml. La soluzione medicinale è stata ottenuta dopo filtrazione del surnatante attraverso una membrana filtrante da 0,45 μm. Acteoside ed echinacoside (1 mg ciascuno) sono stati miscelati e disciolti completamente in una soluzione di metanolo al 50% (v/v) di 10 mL. Infine, la soluzione standard è stata filtrata attraverso un filtro Millipore da 0,45 μm prima dell'analisi.

Condizioni LC-MS

La separazione cromatografica è stata eseguita in un sistema HPLC (Agilent 129{{10}}), dotato di un sistema di erogazione del solvente quaternario, un degasificatore sotto vuoto e un rilevatore di serie di fotodiodi. L'analisi MS/MS è stata eseguita in un sistema Agilent-1290 HPLC/6530 Q-TOF-MS, dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray in modalità di ioni positivi e negativi. Per la separazione è stata utilizzata una colonna Waters Symmetry shield RP C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) (Waters Corporation, Milford, MA, USA). La fase mobile comprendeva una soluzione acquosa di acido formico allo 0,2 percento (v/v) (A) e ACN (B), ed è stata pompata a una portata di 0,5 mL/min. Il volume di iniezione di ciascun campione era di 10 μL. Il programma di eluizione del gradiente era il seguente: 5-23% B per 0-35 min, 23-25% B per 35-65 min e 25-5% B per 65-70 min. La temperatura della colonna è stata mantenuta a 30 gradi. I cromatogrammi sono stati monitorati e registrati a 330 nm. La pressione del gas di atomizzazione è stata impostata a 30 Psi e la tensione capillare era di 3,5 kV. La portata di gas secco era di 8 L/min ad una temperatura di 30 gradi. La temperatura del gas della guaina è stata fissata a 400 gradi ad una portata di 12 L/min. L'energia di collisione è stata impostata a 10–20 eV per le scansioni a bassa energia ea 30–50 eV per le scansioni ad alta energia. I dati degli spettri di massa sono stati registrati nell'intervallo di scansione di 50-1000 Da in modalità di scansione di ioni positivi e negativi. In questo studio, è stato effettuato un confronto rapido ed efficiente tra TGCD e gli standard nelle stesse condizioni LC-MS.

Test di crescita dell'utero

Ciò è stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. Tutte le procedure sperimentali sono state riviste e approvate dal Comitato Etico Animale dell'Università di Commercio di Harbin, Cina.

Topi Kunming femmine immaturi (circa 21 giorni dalla nascita, svezzati) del peso di 12 ± 2 g, sono stati acquistati dal Centro per animali da laboratorio della base dell'industria biologica nazionale di Changchun (Changchun, Cina). I topi sono stati alloggiati in una stanza a temperatura controllata (22 ± 2 gradi) con cibo e acqua ad libitum. La sperimentazione animale è stata avviata dopo cinque giorni di acclimatamento. I topi hanno digiunato per una notte con acqua ad libitum prima della somministrazione intragastrica della soluzione in esame.

I topi sono stati divisi casualmente in 22 gruppi, con 10 animali in ciascun gruppo. Sono stati somministrati farmaci sperimentali dello stesso volume due volte al giorno (mattina e sera) per quattro giorni come segue:

Gruppo 1: glicosidi totali intragastrici della soluzione di purificazione di C. deserticola (20 mL/kg), (volume della soluzione/peso del topo),

Gruppo II: acqua distillata intragastrica (gruppo di controllo negativo) e

Gruppo III: dietilstilbestrolo intragastrico (20 ug/mL) (gruppo di controllo positivo).

Il quinto giorno, tutti i topi sono stati sacrificati. Gli uteri sono stati immediatamente rimossi e pesati e sono stati calcolati i coefficienti dell'utero.

analisi statistica

È stato utilizzato un t-test accoppiato a due code per identificare differenze statisticamente significative nei vari parametri nei diversi gruppi sperimentali. L'analisi è stata eseguita utilizzando il software statistico SPSS (SPSS per Windows v21.0, SPSS Inc., USA). Le differenze sono state considerate statisticamente significative a un livello di confidenza del 95% (p <>

risultati e discussione

Linearità e correlazione delle rese di acteoside e glicosidi totali

L'equazione di regressione lineare della resa dell'acteoside era y {{0}}x – 14,75 (dove x è la concentrazione dell'acteoside e y è la sua area di picco corrispondente) con un coefficiente di correlazione di r=1 nell'intervallo di concentrazione di 0,12−{{10}},72 mg/mL. Ciò indicava una curva di calibrazione lineare. L'equazione di regressione lineare della resa totale dei glicosidi era y=26.074x più 0,0866 (dove x è la concentrazione dei glicosidi totali e y è l'area del picco corrispondente) con un coefficiente di correlazione di r { {12}}.9982 nell'intervallo di concentrazione di 0,013-0,065 mg/mL. Ciò indicava anche una curva di calibrazione lineare.

Indagine metodologica

La precisione, la riproducibilità, la stabilità e il recupero dei campioni sono stati studiati nell'indagine metodologica. Nell'esperimento di precisione, la deviazione standard relativa (RSD) dell'acteoside e dei glicosidi totali era rispettivamente dell'1,43% e del 0.05%. Nell'esperimento di riproducibilità, l'RSD dell'acteoside e dei glicosidi totali era rispettivamente del 0,10 percento e dell'1,44 percento. Nell'esperimento di stabilità di 24 ore, l'RSD dell'acteoside e dei glicosidi totali era rispettivamente dello 0,14% e dello 0,90%. Nell'esperimento di recupero, il recupero dell'acteoside è stato del 100,50% con un RSD del 2,08%, mentre il recupero dei glicosidi totali è stato del 99,12% con un RSD dell'1,65%. Tutti i valori RSD erano inferiori al 3%. Questi risultati hanno dimostrato una buona precisione e riproducibilità. Inoltre, il campione è rimasto stabile per 24 h. Anche i risultati del recupero rientrano nell'intervallo consentito (95-105 percento). Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per la determinazione della resa in acteoside e glicosidi totali dopo la purificazione.

Indagine a fattore singolo di TGCD

La purificazione del TGCD mediante resina macroporosa può essere influenzata da molti fattori, come il tipo di resina, i fattori di adsorbimento statico (tempo di adsorbimento, concentrazione di perdita e pH della soluzione campione) e le condizioni di eluizione (velocità del flusso, volume e concentrazione). Utilizzando la capacità di adsorbimento e le velocità di desorbimento ed eluizione del TGCD come indici, la condizione sperimentale è stata determinata sulla base dei risultati di esperimenti a fattore singolo. Usando la resina ad adsorbimento macroporosa di tipo AB-8, sono state determinate le seguenti condizioni ottimali: 0.5 mg/mL di soluzione campione, pH di 10, tempo di adsorbimento statico di 8 h, 2 BV acqua distillata per il lavaggio delle impurità, 20 BV 80 percento di etanolo come eluente e una velocità di flusso di 0,5 BV/min. I risultati specifici sono mostrati nelle Figure 1-7.

CCD per l'ottimizzazione della tecnologia di purificazione TGCD

Sulla base dei risultati dell'indagine a fattore singolo, tre fattori che influenzano in modo significativo il metodo di purificazione sono stati selezionati come indici, vale a dire, pH della soluzione campione (x1), concentrazione dell'eluente (x2) e volume dell'eluente (x3). Secondo il principio del CCD, ogni fattore ha cinque livelli. I livelli massimo e minimo di questi vari fattori sono stati fissati in base ai risultati dell'esperimento preliminare. I livelli dei fattori sono mostrati nella tabella 1 e i risultati sperimentali sono mostrati nella tabella 2.

I glicosidi totali e le rese di acteoside sono stati determinati per ottimizzare il metodo di purificazione per TGCD. In primo luogo, le rese totali di glicosidi e acteoside sono state impostate in base ai criteri numerici di desiderabilità (d) tra {{0}}}-1. Quindi, è stata calcolata la desiderabilità complessiva (OD) [OD=(d1, d2, d3,....,dn)1/n, dove n è il numero indice]. Il software SPSS21.{{10}} e il software per esperti di progettazione sono stati utilizzati per la regressione lineare multipla e l'adattamento binomiale di variabili indipendenti e OD, con p < 0.05="" è="" stato="" considerato="" uno="" standard="" statisticamente="" significativo="" dell'equazione.="" l'equazione="" con="" un="" valore="" r="" maggiore="" (coefficiente="" di="" correlazione="" multipla)="" è="" stata="" selezionata="" come="" modello="" di="" adattamento="" migliore.="" l'equazione="" lineare="" multivariata="" è="" rappresentata="" come="" y="–" 1.02="" –="" 0.131x1="" più="" 0.034x2="" più="" 0.012x3="" (r="" {{="" 25}}.55,="" p="0.004)." l'equazione="" binomiale="" è="" y="–" 21,92173="" –="" 0,74079x1="" più="" 0,62914x2="" più="" 0,041161x3="" più="" 0,014972x1x2="" più="" 2,06050*10-4x1x3="" più="" 1,05698="" ×="" 10-3x2x{54}}.029589x{="" {56}}.78730="" ×="" 10-3x22="" -="" 2.89446="" ×="" 10-3x32="" (r="0.91," p="0.012)." dalle="" equazioni="" precedenti="" si="" può="" vedere="" che="" il="" coefficiente="" di="" correlazione="" dell'equazione="" di="" regressione="" lineare="" multivariata="" è="" inferiore.="" la="" correlazione="" tra="" le="" variabili="" indipendenti="" e="" dipendenti="" è="" molto="" bassa="" ed="" è="" stata="" considerata="" sfavorevole="" da="" utilizzare="" nel="" modello="">

Ma il coefficiente di correlazione dell'equazione binomiale era alto e si è rivelato un buon adattamento. Si è quindi scelto il modello binomiale. Sulla base di un'analisi completa della figura della superficie e della mappa del contorno combinata con i dati sperimentali (valore OD vicino a {{0}}.6), è stato ottenuto l'intervallo ottimale del metodo di purificazione. Dalla Figura 8, si può vedere che il valore OD massimo è stato generato quando il pH della soluzione campione (A) era compreso nell'intervallo 9-10 e la concentrazione dell'eluente (B) era nell'intervallo 79-85 percento . La Figura 9 mostra che il valore OD massimo è stato ottenuto quando il valore pH della soluzione campione (A) era compreso tra 9 e 10 e il volume dell'eluente (C) era compreso tra 20 e 25 BV. La Figura 10 mostra che il valore di OD massimo è stato ottenuto quando la concentrazione dell'eluente (B) era nell'intervallo 80-85 percento e il volume dell'eluente (C) era nell'intervallo 20-25 BV. Da un'analisi completa di questi dati, il pH della soluzione del campione, la concentrazione dell'eluente e il volume dell'eluente sono stati determinati rispettivamente nell'intervallo 9-10, 80-85 percento e 20-25 BV. Sulla base dell'equazione binomiale multivariata per risultati derivati ​​​​variabili e schema ottimale, il miglior metodo di purificazione TGCD è risultato essere a una concentrazione di eluente (etanolo) dell'85 percento e volume di 25 BV a un pH di 11. Il valore OD corrispondente era 0,8332 e la resa totale dei glicosidi era del 73,0339 percento. L'impressione visiva dalle figure 8-10 identifica il metodo migliore come quello in cui sono state considerate le interazioni tra i due fattori, sebbene il metodo migliore dedotto dalla formula riconosca quello in cui sono state incluse le interazioni tra i tre fattori. I due risultati differivano e il metodo di purificazione ottimale è stato considerato con una concentrazione di eluente (etanolo) dell'85 percento e un volume di 25 BV a un pH di 11.

Misurazione della crescita dell'utero

Il coefficiente dell'utero di ciascun gruppo è mostrato nella Tabella 3. Rispetto al gruppo di controllo negativo, i risultati degli altri gruppi erano significativamente diversi. È stato riscontrato che il TGCD ottenuto da 20 diversi metodi di purificazione esercitava tutti azioni estrogeniche.

Esperimento di conferma

I risultati completi del CCD e del test di crescita dell'utero hanno mostrato che il metodo di purificazione ottimale è stato considerato con una concentrazione di eluente (etanolo) dell'85 percento e un volume di 25 BV a un pH di 11. Durante il

processo di convalida, la resa media dei glicosidi totali è stata del 70,9150 percento. La deviazione media tra i valori previsti e quelli effettivi è stata del 2,1180 percento. Pertanto, si può suggerire che la prevedibilità e la credibilità sperimentale di questo modello siano buone.

Identificazione di TGCD dopo purificazione

Sulla base del tempo di ritenzione e dei dati sulla SM, sono stati ipotizzati 21 costituenti naturali, tra cui campneoside 1, 2′-acetilacteoside, cistanoside A, cistanoside B, siringalide A 3'- - L-rhamnopyranoside, tubuloside A, tubuloside B, salidroside, cistanoside G, acido teniposide, decaffeoilacteoside, 8-acido epiloganico, echinacoside, cistanoside F, cistantubuloside B1, isoacteoside, acteoside, cis-acteoside, kankanoside E, osmanthuside B e cistanoside C. Il tempo di ritenzione, MS e MS/ Le informazioni sulla SM, la formula e i composti ipotizzati sono mostrati nella Tabella 4.

Q-TOF-MS è particolarmente adatto per l'identificazione strutturale di componenti molecolari complessi di farmaci e alimenti perché può fornire possibili composizioni elementari attraverso l'esatta massa molecolare e le caratteristiche strutturali degli ioni frammento. Per stabilire una caratterizzazione strutturale sistematica, per l'identificazione sono stati utilizzati anche Q-TOF-MS, dati MS, ricerca di database e letteratura di riferimento pubblicata. La formula molecolare di ciascun componente bersaglio è stata dedotta dallo ione genitore ed è stata abbinata ai composti noti. Questa formula potrebbe essere ulteriormente determinata dai relativi ioni frammento. Ad esempio, il picco 5 ha mostrato uno ione deprotonato predominante a m/z 654 (C30H38O16), che era identico alla composizione elementare del campneoside 1. La perdita di caffeoile è stata formata da un frammento di ione a m/z 493 e la perdita di La parte rha è stata formata da un frammento ionico a m/z 347.

Conclusione

Utilizzando una tecnologia LC-Q-TOF-MS, è stato sviluppato e completamente convalidato un metodo di analisi qualitativa semplice e robusto per TGCD. I dati di convalida per lo screening e l'identificazione dei composti naturali da TGCD sono stati soddisfacenti. Ventuno composti bioattivi del TGCD sono stati ipotizzati come segue: salidroside, cistanoside G, acido geniposidico, decaffeoilatteoside, campneoside 1, 8-acido epiloganico, 2'-acetilacteoside, cistanoside A, cistanoside B, siringalide A3′{{9 }}L-ramnopiranoside, echinacoside, cistanoside F, cistantubuloside B1, isoacteoside, acteoside, tubuloside A, cis-acteoside, kankanoside E, osmanthuside B, cistanoside C e tubuloside B. La caratterizzazione strutturale di questi composti può fornire una base sperimentale per il loro controllo di qualità e l'ulteriore applicazione clinica a causa della loro attività estrogenica. Ciò può offrire una nuova e migliorata opzione terapeutica per il trattamento della sindrome postmenopausale, evitando così gli effetti collaterali e le reazioni avverse della terapia con estrogeni.

Abbreviazioni

TGCDCistanche deserticheglicosidi totali LC/Q-TOF-MS cromatografia liquida/spettrometria di massa a tempo di volo quadrupolare

Metodologia della superficie di risposta RSM

Design composito centrale CCD

Spettrometria di massa MS HPLC/Q-TOF-MS Cromatografia liquida ad alte prestazioni/spettrometria di massa quadrupolare a tempo di volo

Acetonitrile ACN

Volume letto BV

OD desiderabilità generale

LC-MS cromatografia liquida-spettrometria di massa

Spettrometria di massa a tempo di volo a quadrupolo Q-TOF-MS

Medicina tradizionale cinese MTC

Deviazione standard relativa RSD

Ringraziamenti

Questo progetto è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81073015), Nature Scientific Foundation of Heilongjiang Province (ZD2017014), Piano di formazione per giovani talenti innovativi del College nella provincia di Heilongjiang (UNPYSCT- 2017209). Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi in merito alla pubblicazione di questo articolo.

Conflitto d'interesse

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

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