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Plumbagin sopprime la melagenesi indotta da MSH nelle cellule di melanoma di topo B16F10 inibendo l'attività della tirosinasi, parte 2

May 09, 2023

3. Discussione

Plumbagin è un metabolita secondario di origine vegetale e mostra diverse funzioni biologiche, tra cui attività antinfiammatorie, antitumorali, antiallergiche e antibatteriche [8,9]. Tuttavia, non era noto se la plumbagin avesse un effetto inibitorio sulla melanogenesi legata all'iperpigmentazione e al melanoma. In questo studio, abbiamo dimostrato che la plumbagin sopprime fortemente la melanogenesi nelle cellule di melanoma B16F10 e questo lavoro potrebbe fornire un'opportunità per lo sviluppo di cosmetici per la cura della pelle basati sulle attività antinfiammatorie, antiallergiche, antibatteriche e anti-melanogenesi della plumbagin.

Secondo studi pertinenti, la cistanche è un'erba comune conosciuta come "l'erba miracolosa che prolunga la vita". Il suo componente principale è il cistanoside, che ha vari effetti come la promozione della funzione antiossidante, antinfiammatoria e immunitaria. Il meccanismo tra cistanche e sbiancamento della pelle risiede nell'effetto antiossidante dei glicosidi cistanche. La melanina nella pelle umana è prodotta dall'ossidazione della tirosina catalizzata dalla tirosinasi e la reazione di ossidazione richiede la partecipazione dell'ossigeno, quindi i radicali liberi dell'ossigeno nel corpo diventano un fattore importante che influenza la produzione di melanina. Cistanche contiene cistanoside, che è un antiossidante e può ridurre la generazione di radicali liberi nel corpo, inibendo così la produzione di melanina.

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Poiché la sovraregolazione della melanogenesi è spesso osservata nel melanoma maligno con livelli di tirosinasi sovraespressi nel sangue così come nei tessuti tumorali, è evidente che la melanogenesi è un potenziale bersaglio per la chemioterapia dei melanomi maligni [1]. Nel presente studio, abbiamo scoperto che la plumbagina sopprime direttamente l'attività della tirosinasi indipendentemente dal meccanismo trascrizionale associato alla melanogenesi (Figura 6). Pertanto, i nostri risultati suggeriscono che la plumbagin può essere un potenziale componente di una strategia preventiva e terapeutica per la gestione del melanoma maligno. In effetti, sono stati riportati gli effetti anti-melanoma, chemiosensibilizzanti e radiosensibilizzanti del plumbagin sulla terapia del melanoma [17-21].

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In studi precedenti che si occupavano degli effetti antitumorali e antinfiammatori della plumbagin, in modelli in vitro sono stati utilizzati circa 5–10 µM di plumbagin (superiore alla concentrazione utilizzata in questo studio) [17,22 ,23]. Pertanto, abbiamo studiato l'effetto tossico della plumbagin nelle cellule proliferative, inclusi i normali cheratinociti (HaCaT) e le cellule epiteliali del cristallino (B3), che possono essere danneggiate dai cosmetici per la cura della pelle. I nostri risultati hanno dimostrato che concentrazioni inferiori, circa 0,5–1 µM di plumbagin, non sono tossiche per i normali cheratinociti e le cellule epiteliali del cristallino, ma sono sufficientemente efficaci da ridurre l'attività della tirosinasi e la sintesi di melanina. Inoltre, abbiamo anche scoperto che la plumbagin sopprime più efficacemente la melanogenesi rispetto a 1 mM di arbutina o 0,2 mM di acido kojico, che sono noti agenti sbiancanti per la pelle. Questi risultati suggeriscono che il plumbagin è sicuro per l'uso come componente per lo sviluppo di cosmetici sbiancanti per la pelle.

Nel presente studio, abbiamo studiato gli effetti inibitori della plumbagin sulla reazione dell'enzima tirosinasi utilizzando saggi di attività della tirosinasi cellulare e senza cellule basati sull'ossidazione della L-DOPA. Tuttavia, non abbiamo suggerito un preciso meccanismo molecolare su come la plumbagin inibisce l'attività della tirosinasi. Questo meccanismo dovrebbe essere ulteriormente studiato per determinare se la plumbagin interagisce direttamente con la tirosinasi e inibisce la sua attività ossidasica o se ha effetti indiretti che portano a una diminuzione dell'attività della tirosinasi.

4. Materiali e Metodi

4.1. Reagenti e Anticorpi

Plumbagin, -MSH (M4135), arbutina (A4256), acido cogico (K3125), L-DOPA (333786) e tirosinasi (T3824) purificati dai funghi sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anticorpi contro MITF (#12590), p-AKTS473 (#4060), p-AKTT308 (#13038), p-CREB (#9198), p-ERK1/2 (#4370), ERK1/2 (#9102), H2AX (#9718), PARP (#5625) e caspase-3 (#9665) sono stati acquistati da Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). La tirosinasi (sc-7833) e -tubulina (sc-9104) sono state acquistate da Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA).

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4.2. Saggio di coltura cellulare e vitalità cellulare

Le cellule B16F10 (cellule di melanoma di topo), B3 (cellule epiteliali del cristallino umano) e HaCaT (cheratinociti umani) sono state coltivate nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero bovino fetale e 25 mM di glucosio. Le cellule sono state incubate in un'atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di CO2 a 37°C. Per misurare la vitalità, le cellule sono state incubate con varie concentrazioni di plumbagin sciolte in dimetilsolfossido (DMSO) per 48 o 72 ore. Dopo l'incubazione, le cellule in coltura sono state lavate con PBS e quindi incubate con una soluzione colorante cristalvioletto allo 0,5% per 20 minuti a temperatura ambiente. Per misurare la densità ottica, le cellule colorate sono state incubate con una soluzione di sodio dodecil solfato (SDS) all'1% per 15 minuti a temperatura ambiente e la densità ottica di ciascun pozzetto è stata quindi misurata a 570 nm (OD570) utilizzando un lettore di assorbanza (BioTek, Winooski, VT, USA).

4.3. Immunoblotting

Le cellule in coltura sono state lisate utilizzando 1% di IGEPAL (ottilfenossipolietossietanolo), 150 mM di NaCl, 50 mM di Tris-HCl (pH 7,9), 10 mM di NaF e un cocktail di inibitore della proteasi nel tampone di lisi. I campioni di proteine ​​​​sono stati separati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e le proteine ​​​​separate sono state quindi trasferite su una membrana di polivinilidene difluoruro (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, USA). Le membrane sono state incubate durante la notte con anticorpi primari (1:1000) a 4 °C e quindi incubate con anticorpi secondari coniugati con HRP (1:10.000) per 1 ora a temperatura ambiente. Le proteine ​​​​sono state visualizzate utilizzando un kit ECL Prime (GE Healthcare Pittsburgh, PA, USA).

4.4. Misurazione del contenuto di melanina intracellulare ed extracellulare

Il contenuto di melanina è stato determinato e quantificato utilizzando un metodo precedentemente descritto con una leggera modifica [2,24]. Per l'analisi del contenuto di melanina, le cellule B16F10 sono state coltivate in DMEM privo di rosso fenolo contenente il 10% di siero bovino fetale. Le cellule B16F10 sono state coltivate con trattamento -MSH in assenza o presenza di plumbagin per 3 o 4 giorni. Le cellule o i terreni in coltura sono stati raccolti e i pellet sono stati sciolti in NaOH 1N contenente il 10% di DMSO a 80 °C per 1 ora. Il contenuto di melanina è stato misurato utilizzando un lettore di assorbanza a 475 nm (OD475) e il contenuto di melanina è stato quindi normalizzato alla concentrazione di proteine ​​cellulari.

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4.5. Isolamento dell'RNA e RT-PCR quantitativa

L'RNA totale è stato estratto dalle cellule B16F10 utilizzando TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA) e 2 μg di RNA totale sono stati utilizzati per la sintesi del cDNA utilizzando un kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA). La PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Le sequenze dei primer PCR (50-30) erano le seguenti: TCAAGTTTCCAGAGACGGGT e CATCATCAGCCTGGAATCAA per MITF; ATAGGTGCATTGGCTTCTGG e TCTTCACCATGCTTTTGTGG per TYR; CATTTCCAG CTGGGTTTCTC e TGGTCTGGTGAATCCTTGGAA per TYRP1.

4.6. Saggio di attività della tirosinasi cellulare

L'attività della tirosinasi cellulare è stata determinata utilizzando un metodo precedentemente descritto con modifica [25,26]. Le cellule B16F10 in coltura sono state incubate con -MSH in assenza o in presenza di plumbagin e le cellule sono state quindi lavate e lisate con PBS contenente l'1% di desossicolato di sodio e 0,5% di Triton X{{8} }. Dopo aver determinato la concentrazione proteica, 50 µg di proteine ​​sono stati incubati con 2,0 mM di L-DOPA e 0,1 M di PBS (pH 6,8) per 1 ora a 37 °C. L'ossidazione di L-DOPA è stata misurata a 475 nm (OD475) utilizzando un lettore di assorbanza. L'attività è stata misurata utilizzando la seguente formula: attività della tirosinasi ( percentuale )=(OD475 del campione/OD475 del controllo) × 100.

4.7. Saggio di attività della tirosinasi senza cellule

Per determinare l'effetto inibitorio della plumbagin sull'attività della tirosinasi, la tirosinasi del fungo purificata è stata incubata per 2 ore con una miscela di reazione contenente 0.1 M PBS (pH 6,8) e 2 mM L-DOPA in assenza o presenza di plumbagin . L'ossidazione di L-DOPA a dopacromo è stata misurata a 475 nm (OD475) con un lettore di assorbanza. L'attività è stata misurata utilizzando la seguente formula: attività della tirosinasi ( percentuale )=(OD475 del campione/OD475 del controllo) × 100.

4.8. Saggio di attività di scavenging radicale DPPH

Per determinare l'attività radical scavenging di plumbagin, è stata preparata e utilizzata una soluzione DPPH {{0}}.2 mM in metanolo. Ogni campione è stato diluito con acqua distillata a concentrazioni finali di 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 e 5 mg/mL (plumbagin) o { {13}}.005, 0.01, 0,05, 0,1, 0,2 e 0,5 mg/ml (vitamina C). Dopo la reazione, la densità ottica (OD) è stata misurata a 517 nm (OD517) utilizzando un lettore di assorbanza. L'attività di scavenging dei radicali liberi è stata calcolata utilizzando la seguente formula: attività di scavenging dei radicali DPPH ( percentuale )=10 − ((ODs/ODc) × 100), dove ODs rappresenta l'assorbanza dei campioni e ODc rappresenta l'assorbanza del controllo del veicolo.

4.9. Analisi statistica

Tutti i dati sono stati analizzati utilizzando un test t di Student non accoppiato per due confronti sperimentali e un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) con il test post hoc di Tukey per confronti multipli utilizzando Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). I dati sono presentati come media ± deviazione standard (SD). Le differenze tra i valori medi sono state considerate statisticamente significative quando il p-value associato era inferiore a 0.05.

5. Conclusioni 

I principali risultati di questo studio sono che plumbagin (i) sopprime la sintesi di melanina indotta da -MSH inibendo l'attività della tirosinasi; (ii) non influenza il meccanismo trascrizionale collegato al MITF e le cascate di trasduzione del segnale, inclusa l'attivazione di AKT e ERK1/2 associata alla melanogenesi; e (iii) non provoca tossicità nei cheratinociti normali (HaCaT) e nelle cellule epiteliali del cristallino (B3) quando la sua concentrazione era inferiore a 5 µM. Presi insieme, plumbagin abroga la sintesi di melanina indotta da MSH inibendo l'attività della tirosinasi indipendentemente dall'asse trascrizionale CREB-MITF. Questi risultati, quindi, suggeriscono un plumbagin prodotto naturale promettente e sicuro per ridurre l'iperpigmentazione utilizzandolo nello sviluppo di cosmetici sbiancanti per la pelle.

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Ringraziamenti:Questo lavoro è stato sostenuto dalla Konkuk University nel 2016.
Contributi dell'autore:Ji-Hong Lim ha ideato e progettato gli esperimenti; Taek-In Oh, Jeong-Mi Yun, Eun-Ji Park e Young-Seon Kim hanno eseguito gli esperimenti; Ji-Hong Lim, Taek-In Oh e Yoon-Mi Lee hanno analizzato i dati; Ji-Hong Lim e Yoon-Mi Lee hanno scritto il manoscritto.
Conflitto di interessi:Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

Abbreviazioni

-MSH ormone stimolante alfa-melanociti
TYR tirosinasi
L-DOPA L-3,4-diidrossifenilalanina
Fattore di trascrizione associato alla microftalmia MITF
TYRP1 proteina correlata alla tirosinasi 1
Proteina legante dell'elemento di risposta CREB cAMP
PKA protein chinasi A
ERK1/2 chinasi extracellulare regolata dal segnale 1/2

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