Lesione del podocita dovuta all'interazione tra Tlr8 e il suo ligando endogeno MiR-21 nell'ostruzione e nel suo rene collaterale

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disfunzione erettile cistance correlato al rene

Mentre la malattia renale cronica è prevalente negli adulti, la nefropatia ostruttiva (ON) è stata segnalata sia nei pazienti giovani che in quelli anziani. In ON, le lesioni tubulointerstiziali (TIL) sono state ampiamente studiate, ma le lesioni glomerulari (GL) sono state ampiamente trascurate. Qui, mostriamo un nuovo meccanismo alla base dello sviluppo di GL in ON nei topi giovani e meno giovani. I TIL si sviluppano prima dei GL a causa dell'infiltrazione di cellule infiammatorie nel tubulointerstizio, ma i GL si sviluppano in seguito all'attivazione del recettore Toll-like 8 (Tlr8) nonostante l'assenza di cellule infiammatorie che si infiltrano nel glomerulo. Le proteine ​​TLR8 e interleuchina 1 beta (IL1b) colocalizzano con la riduzione dei marcatori della funzione dei podociti (PFM), indicando l'attivazione della segnalazione TLR8 nei podociti feriti. Inoltre, i livelli glomerulari e sierici di miR-21, un ligando endogeno per Tlr8, erano più elevati nel modello murino ON rispetto al controllo sham. L'espressione glomerulare di Tlr8 è correlata positivamente con miR-21 e le citochine a valle Il1b e Il6 e negativamente correlata con PFM (Nphs1 e Synpo). Mostriamo anche la colocalizzazione delle proteine ​​TLR8 e IL1b con la riduzione dei PFM sia ostruiti checollateralerenidi topi giovani e meno giovani. Inoltre, i risultati dello studio in vitro hanno rivelato una maggiore espressione di Tlr8 e delle sue citochine a valle nei glomeruli darenidopo il trattamento con miR- 21 mimic rispetto al controllo. In conclusione, la sovraespressione di Tlr8 può fungere da meccanismo plausibile alla base dello sviluppo di GL in ON attraverso la lesione dei podociti.

Parole chiave: malattia renale cronica,nefropatia ostruttiva, podocita, TLR8, rene ostruito e collaterale

INTRODUZIONE

Malattia renale cronica (CKD), uno dei principali problemi di salute pubblica, è prevalente nell'8% -13% della popolazione generale (1). È frequente nelle persone anziane a causa dell'invecchiamento della società. La nefropatia ostruttiva (ON) è di grande interesse per i medici, poiché è stata segnalata in pazienti di diverse fasce di età. ON è curabile e reversibile, a differenza di altre CKD (2, 3). Nei bambini, si verifica in uno dei 1500 individui e la sua prevalenza raggiunge l'1% -5% nei paesi sviluppati (4, 5). Negli adulti, la prevalenza di ON varia da 5 su 1000 a 5 su 10000 individui. Inoltre, la prevalenza di ON unilaterale cronica è di circa lo 0,5%, mentre quella di ON unilaterale acuta e bilaterale cronica è di circa lo 0,1% (4-7).

L'ON può portare a danno renale acuto o CKD, che comporta una progressiva diminuzione della funzione renale e alterazioni delle strutture renali di durata superiore a 3 mesi (8, 9). L'ostruzione ureterale unilaterale (UUO) è una strategia ampiamente utilizzata per studiare l'ON cronica. L'ON in un rene UUO è caratterizzato da ipertrofia, idronefrosi, reclutamento di cellule infiammatorie nell'area interstiziale, morte di cellule tubulari per ipossia e deposito di collagene nel tubulointerstizio, seguite dallo sviluppo di fibrosi tubulointerstiziale (TF) (10).

La TF è una caratteristica importante della malattia renale allo stadio terminale e un importante determinante del danno renale progressivo (11). La TF è stata ampiamente studiata nei modelli ON, ma i dati relativi al danno glomerulare, in particolare alle anomalie della barriera emato-urinaria (BUB), sono scarsi (8, 9, 12). Inoltre, gli studi hanno studiato le lesioni tubulointerstiziali (TIL) nel rene collaterale in ON unilaterale, ma le lesioni glomerulari (GL) sono state ampiamente trascurate (12). Numerosi rapporti hanno rivelato il coinvolgimento dei capillari peritubulari nella progressione dei TIL in ON sperimentale (13, 14). Tuttavia, il glomerulo e il capillare glomerulare drenano rispettivamente nei segmenti tubolari del nefrone e dei capillari peritubulari. Pertanto, suggeriamo che la glomerulonefrite possa interessare anche il tubulointerstizio. I nostri studi precedenti hanno evidenziato il contributo del danno alle cellule intrinseche glomerulari, principalmente podociti, al GL e al successivo sviluppo di TIL in un modello murino di malattie autoimmuni a causa della sovraespressione di diversi recettori Toll-like (TLR) (15-18).

L'endotelio capillare glomerulare e i podociti sono importanti guardiani che comprendono BUB. Tra questi due epiteli, i podociti sono continuamente esposti a segnali di pericolo, inclusi i ligandi TLR come i pattern molecolari associati al pericolo (DAMP) o i pattern molecolari associati ai patogeni (PAMP), a causa della loro localizzazione unica nei glomeruli (15). Pertanto, si ritiene che l'interazione tra i TLR nei podociti e i loro ligandi endogeni contribuisca al danno dei podociti in condizioni non infettive. Nel presente studio, ci siamo concentrati sullo sviluppo di GL sia nei reni ostruiti che in quelli collaterali di topi giovani e vecchi, poiché l'ON si trova spesso negli esseri umani sia giovani che anziani. Abbiamo chiarito che GL è stato sviluppato in ON a causa della lesione dei podociti attraverso la sovraespressione di Tlr8 nei podociti dei reni sia ostruiti che collaterali di topi giovani e vecchi.

MATERIALI E METODI

Dichiarazione etica e stabulazione sperimentale degli animali Tutti gli esperimenti che utilizzano animali da laboratorio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Facoltà di Medicina Veterinaria dell'Università di Hokkaido (approvazione n. 16- 0124). Gli autori hanno seguito la guida approvata per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Università di Hokkaido, Facoltà di Medicina Veterinaria (approvata dall'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International). I topi C57BL/6N di sei settimane sono stati acquistati da Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Giappone) e mantenuti in condizioni prive di agenti patogeni specifici in un ambiente chiaro-scuro 1:1. Ad animali da esperimento sono stati forniti cibo e acqua da bere ad libitum.

Disegno sperimentale Abbiamo utilizzato sia topi giovani (9 settimane) che vecchi (12 mesi). I topi di ogni gruppo di età (n=4) sono stati sottoposti a un'operazione simulata (gruppo di controllo) o a UUO (2, 7, 11 e 21 giorni) per stabilire un rene modello ON, come descritto nel nostro studio precedente (13).

Preparazione del campione I topi sono stati anestetizzati in profondità con una miscela di agenti anestetici come precedentemente descritto (16) ed eutanasia mediante lussazione cervicale. I campioni di sangue sono stati raccolti attraverso l'arteria femorale per l'analisi dei marker sierici. Sia l'UUO che i reni collaterali sono stati raccolti e tagliati a fette sottili. Le fette di rene sono state fissate con il 10 percento di formalina tampone neutra (NBF), il 4 percento di paraformaldeide (PFA) e il 2,5 percento di glutaraldeide (GTA) rispettivamente per studi di microscopia istopatologica, immunoistochimica ed elettronica.

Immunoistochimica e immunofluorescenza I blocchi di paraffina fissati con NBF sono stati tagliati a uno spessore di 2 mm e colorati con acido periodico Schiff-ematossilina (PAS-H) per esaminare l'istopatologia renale. L'immunorilevamento dei marcatori cellulari è stato eseguito come precedentemente riportato (16) per le cellule B (B220), le cellule T (CD3), l'endotelio capillare (CD31), IL1b, i macrofagi (Iba1), i podociti (podocina e sinaptopodina) e TLR8. Le condizioni di colorazione sono elencate nella Tabella 1.

Istoplanimetria PAS-H e sezioni renali immunocolorate sono state convertite in vetrini virtuali utilizzando Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Giappone). Le cellule positive sono state contate da 20 glomeruli o 20 focolai selezionati casualmente dal tubulointerstizio con un ingrandimento di 400x utilizzando il software NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Anche le immagini di 20 glomeruli da sezioni colorate con PAS-H sono state catturate a 400x da ciascun topo utilizzando un microscopio a fluorescenza All-in-One BZ-X710 (Keyence, Osaka, Giappone). L'area e le dimensioni del mesangia glomerulare sono state misurate dalle immagini catturate utilizzando un analizzatore BZ-X (Keyence).

Isolamento del glomerulo per l'estrazione dell'RNA e la coltura I glomeruli da reni operati con sham e UUO sono stati isolati come descritto in precedenza (16). In breve, i topi sono stati profondamente anestetizzati e perfusi attraverso il ventricolo sinistro con 40 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contenente Dynabeads (8 × 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Il rene è stato asportato

e tagliato a pezzetti. Le cellule sono state quindi digerite con collagenasi A (1 mg/ml; Roche, Basilea, Svizzera) e desossiribonucleasi I (100 U/ml; Life Technologies) in HBSS a 37 gradi per 30 minuti. La sospensione contenente il tessuto digerito è stata pressata delicatamente attraverso un colino cellulare di 100- mm (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) utilizzando un pestello appiattito. La sospensione cellulare risultante è stata centrifugata a 200 × g per 5 minuti e il pellet cellulare è stato risospeso in 2 ml di HBSS. I glomeruli contenenti Dynabeads sono stati raccolti utilizzando un concentratore di particelle magnetiche (Life Technologies) e utilizzati per l'isolamento dell'RNA.

Trascrizione inversa e PCR in tempo realeL'RNA totale è stato isolato dai glomeruli utilizzando un kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Germania). Il cDNA è stato sintetizzato dall'RNA totale mediante trascrizione inversa utilizzando l'enzima della trascrittasi inversa ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Giappone) e primer dT casuali (Promega). Il cDNA è stato utilizzato nella PCR in tempo reale con il master mix Brilliant III SYBR Green QPCR e Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA). L'espressione genica glomerulare è stata normalizzata all'espressione di Actb. Le coppie di primer utilizzate sono mostrate nella Tabella 2.

Trascrizione inversa e PCR in tempo reale basata su TaqManL'RNA totale, compreso il microRNA (miRNA) nei glomeruli isolati, è stato isolato utilizzando un kit miRNeasy (Qiagen). Primer RT a ciclo stelo specifico per miRNA, trascrittasi inversa, buffer di trascrizione inversa, dNTP e inibitore della RNasi sono stati utilizzati per trascrivere inversa l'RNA totale secondo le istruzioni del produttore (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). La PCR in tempo reale è stata eseguita con il cDNA risultante utilizzando primer TaqMan specifici per miR-21- e sonde specifiche (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) e Mx3000P (Agilent Technologies).

Trattamento in vitro di glomeruli isolati con imitazioniI glomeruli sono stati isolati da sham-operated e UUOrenidopo 11 giorni di ostruzione. Il terreno del Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) (Fujifilm Wako, Giappone) contenente 300 glomeruli è stato distribuito in ciascun pozzetto di una 96-piastra di coltura per pozzetti (TPP, Trasadingen, Svizzera) e trattati con PBS, controllo negativo e miR-21 mimic (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Corea del Sud) a 1 pmol/ µL per 4 ore a 37 gradi in 5% di CO2. L'espressione di Tlr8 e delle sue citochine a valle è stata misurata come descritto nella sezione precedente.

Microscopia elettronica a scansionePer microscopia elettronica a scansione di routine (SEM), piccolarene fettesono stati fissati con GTA al 2,5% per 4 ore e post-fissati con tetrossido di osmio all'1% per 1 ora, seguiti da trattamento con acido tannico all'1% per 1 ora. I campioni sono stati quindi fissati con tetrossido di osmio all'1% per 1 ora e trattati con acido tannico 0,5% e 1% rispettivamente per 10 minuti e 1 ora.Renefettesono stati disidratati con alcol di grado crescente, trasferiti in 3-metil butilacetato e infine asciugati con un essiccatore a punto critico HCP-2 (Hitachi, Tokyo, Giappone). I campioni sono stati sottoposti a polverizzazione ionica e quindi esaminati al microscopio elettronico a scansione S-4100 a una tensione accelerata di 12 kV.

Analisi statisticaI valori sono espressi come media ± errore standard (se). I risultati sono stati analizzati statisticamente utilizzando un test U di Mann–Whitney non parametrico (P < 0.05).="" il="" test="" di="" kruskal-wallis="" è="" stato="" utilizzato="" per="" confrontare="" tre="" o="" più="" popolazioni="" e="" sono="" stati="" eseguiti="" confronti="" multipli="" utilizzando="" il="" metodo="" di="" scheffe="" una="" volta="" osservate="" differenze="" significative="" (p=""><{6}}.05). la="" correlazione="" tra="" i="" due="" parametri="" è="" stata="" analizzata="" utilizzando="" il="" test="" del="" coefficiente="" di="" correlazione="" del="" rango="" di="" spearman="" (p=""><>

RISULTATI

TIL e GL nei reni ostruiti di giovani topiPer prima cosa abbiamo esaminato TIL e GL nei reni operati con la simulazione e UUO di topi giovani soggetti a ostruzione per diversi periodi di tempo. Mentre i reni operati con la simulazione mostravano un tubulointerstizio normale (Figura 1A), i reni ostruiti dopo 2 giorni di UUO mostravano TIL ed erano caratterizzati dalla dilatazione dei tubuli; alcuni tubuli contenevano anche calchi urinari. Tali lesioni aumentavano con l'avanzamento dell'ostruzione (Figura 1A). GLs, principalmente glomerulosclerosi, sono stati osservati nella fase avanzata a 21 giorni dopo l'UUO e caratterizzati dalla deposizione di materiali periodici acido-Schiff (PAS)-positivi. La struttura glomerulare era normale sia nei reni simulati che nei primi UUO (2, 7 e 11 giorni) (Figura 1B). Il numero di cellule glomerulari tendeva ad aumentare fino al giorno-11 successivo all'ostruzione e tendeva a diminuire il giorno{13}} nei reni UUO (Figura 1C). L'accumulo mesangiale glomerulare tendeva ad aumentare da 7 giorni dopo l'ostruzione (Figura 1D).

era assente al centro dei glomeruli dei reni UUO a 21 giorni dopo l'ostruzione (Figura 1F). La reazione a catena della polimerasi ha rivelato una significativa diminuzione dei PFM (Nphs1 e Synpo) nei reni UUO 21 giorni dopo l'ostruzione (Figura 1G). Inoltre, l'analisi SEM ha rivelato i normali processi del piede podocitario (PFP) nei reni operati con la simulazione; tuttavia, l'annullamento della PFP e le strutture simili a microvilli sono stati segnalati nei reni UUO 21 giorni dopo l'ostruzione (Figura 1H). Insieme, questi risultati suggeriscono il verificarsi di una lesione dei podociti nel rene ostruito 21 giorni dopo l'ostruzione.

Cellule immunitarie infiltranti sono assenti nel rene ostruito Abbiamo precedentemente dimostrato che la lesione dei podociti è correlata con cellule immunitarie infiltranti nel glomerulo (13, 16, 18). Pertanto, abbiamo esaminato l'infiltrazione di cellule B e T, nonché macrofagi in TIL e GL di reni simulati e UUO (Figura 2). Numerosi linfociti B, T e macrofagi infiltranti sono stati osservati nei TIL dei reni UUO in tutti i giorni successivi all'ostruzione, ma erano quasi assenti o pochi nei glomeruli sia dei reni fittizi che UUO (Figure 2A-E). Il numero di cellule B, T e macrofagi era molto basso nel glomerulo (dati non mostrati) ma significativamente più alto nel

tubulointerstitium dei reni del giorno 2-, 7-, 11- e 21- rispetto a quello del rene fittizio (Figura 2F). Pertanto, le cellule immunitarie infiltranti possono contribuire allo sviluppo di TIL nel rene ostruito. Tuttavia, altri fattori possono essere correlati allo sviluppo di GL.

Espressione di diversi membri della famiglia TLR e citochine a valle nei reni operati e ostruiti da topi giovani Studi precedenti hanno rivelato una maggiore espressione di diversi TLR nei podociti di reni malati (15, 16, 19, 20). È interessante notare che i nostri dati hanno rivelato un'espressione significativamente più alta di Tlr8 e Tlr9 nei glomeruli isolati dal gruppo UUO 21-day rispetto ai glomeruli del gruppo sham (Figura 3A). Inoltre, abbiamo esaminato l'espressione delle citochine a valle dei membri della famiglia TLR nei glomeruli di gruppi sham e UUO 21-day e abbiamo riscontrato una significativa sovraregolazione nell'espressione dei geni che codificano sia per l'interleuchina 1 beta (Il1b) che per l'interleuchina 6 (Il6) nel gruppo UUO rispetto a quello nel gruppo sham (Figura 3B).

TLR8 co-localizzato con PFM Poiché l'espressione di Tlr8 e Tlr9 era alta nei glomeruli isolati dal rene ostruito, abbiamo esaminato la loro localizzazione mediante colorazione con immunofluorescenza. La proteina TLR8 non è stata rilevata nei reni operati con la simulazione (Figura 4A) ma è stata colocalizzata con la sinaptopodina PFM nel rene UUO (Figura 4B). Inoltre, non siamo riusciti a rilevare l'espressione della proteina TLR9 nel rene da topi simulati o UUO (dati non mostrati).

Produzione di IL1b da podociti nel rene ostruito di topi giovani Come mostrato nella Figura 3B, l'espressione di Il1b glomerulare (una citochina a valle della famiglia TLR) era significativamente più alta nel rene UUO a 21 giorni rispetto a quella nel rene sham. Pertanto, abbiamo esaminato la fonte di IL1b nei glomeruli dei reni UUO mediante colorazione con immunofluorescenza. L'espressione della proteina IL1b non è stata rilevata nei glomeruli dei reni fittizi ma è stata osservata nei glomeruli dei reni UUO (Figure 4C, D). Inoltre, IL1b è colocalizzato con podocina PFM (Figura 4D).

nell'UUOrenea 21 giorni di quello nella farsarene.Pertanto, abbiamo esaminato la fonte di IL1b nei glomeruli dei reni UUO mediante colorazione con immunofluorescenza. L'espressione della proteina IL1b non è stata rilevata nei glomeruli di shamrenima è stato osservato nei glomeruli di UUOreni(Figure 4C, D). Inoltre, IL1b è colocalizzato con podocina PFM (Figura 4D).

Aumento del livello del ligando Tlr8 endogeno putativo nei topi modello ON Uno studio precedente ha mostrato che miR-21 funge da ligando per TLR8 (21). Pertanto, abbiamo confrontato i livelli glomerulari e sierici di miR-21 tra i gruppi sham e UUO 21-day. È interessante notare che il gruppo UUO 21-giorno ha mostrato livelli significativamente più elevati di miR glomerulare-21 rispetto a quello del gruppo sham (P < 0.05),="" tuttavia,="" una="" tendenza="" crescente="" di="" mir="" sierico{="" {10}}="" è="" stato="" osservato="" nel="" primo="" gruppo="" rispetto="" al="" secondo="" (p="0.06)" (figura="">

Correlazione dell'espressione Tlr8 con il suo ligando miR-21 e PFM nell'ostruitoReneCome mostrato nella Tabella 3, abbiamo osservato una correlazione positiva significativa tra l'espressione glomerulare dell'mRNA di Tlr8 e il suo ligando endogeno (miR-21), nonché le citochine a valle Il1b e Il6. D'altra parte, era evidente una correlazione negativa tra l'mRNA di Tlr8 e le PFM Nphs1 e Synpo.

La stimolazione in vitro dei glomeruli con miR{{0}} Mimic attiva l'espressione di Tlr8 e delle sue citochine a valle L'espressione di Tlr8 tendeva ad aumentare (P=0.06) ma le sue citochine a valle (Ifng e Il1b) erano significativamente aumentate (P <0,05 e 0,01) nei glomeruli di topi sham dopo

trattamento con miR-21 mimic rispetto a quello nei glomeruli di topi trattati con PBS e mimic di controllo negativo (Figura 5A). Tuttavia, non è stata osservata alcuna correlazione significativa tra l'espressione di Tlr8 e le sue citochine a valle nei glomeruli di topi finti dopo il trattamento con imitazioni (Tabella 4). L'espressione di Tlr8 e delle sue citochine a valle era significativamente più alta nei glomeruli di UUOreni, in seguito al trattamento con miR-21 mimico rispetto a quelli nei glomeruli dell'UUOrenitrattati con PBS e mimica di controllo negativo (Figura 5B). È stata rilevata una correlazione significativa tra l'espressione di Tlr8 e le sue citochine a valle nei glomeruli dei reni UUO dopo il trattamento con mimic, indicativa della maggiore attivazione della via del fattore nucleare kappa B (NF-kB) mediata da Tlr8- e secrezione di citochine proinfiammatorie nel rene ostruito (Tabella 4).

Localizzazione TLR8 e lesione podocitaria nei reni collaterali di topi giovaniI reni simulati mostravano un glomerulo normale, mentre i reni collaterali presentavano ipertrofia glomerulare, aumento del numero di cellule glomerulari e dilatazione dei capillari glomerulari (Figura 6A). I glomeruli dei reni operati con la simulazione erano positivi per l'espressione della sinaptopodina e mancavano dell'espressione TLR8 (Figura 6B). D'altra parte, i reni collaterali hanno perso l'espressione della sinaptopodina al centro dei glomeruli ma hanno mostrato l'espressione di TLR8 lungo la velocità glomerulare (Figura 6C). Inoltre, la proteina TLR8 è stata co-localizzata con la sinaptopodina (Figura 6C). I reni operati con la simulazione hanno mostrato un'espressione normale di podocina ma nessuna espressione di IL1b nei glomeruli (Figura 6D). Tuttavia, i glomeruli all'interno del rene collaterale hanno perso l'espressione della podocina al centro ma avevano l'espressione di IL1b lungo la velocità glomerulare (Figura 6E). Inoltre, la proteina IL1b è stata colocalizzata con podocina (Figura 6E). L'analisi SEM ha rivelato PFP normali nei reni di topo operati con la simulazione, ma nei reni collaterali erano visibili la cancellazione della PFP e le strutture simili a microvilli (Figura 6F).

Localizzazione TLR8 e lesioni dei podociti nei reni ostruiti e collaterali dei topi anzianiI reni operati con la simulazione hanno mostrato una normale espressione di sinaptopodina ma non hanno rivelato alcuna colorazione per la proteina TLR8 all'interno dei loro glomeruli (Figura 7A). È interessante notare che sia i reni collaterali che quelli UUO hanno mostrato perdita di espressione di sinaptopodina al centro dei glomeruli ma hanno mantenuto l'espressione di TLR8 lungo la rete glomerulare (Figure 7B, C). La proteina TLR8 è stata colocalizzata con sinaptopodina nei reni collaterali e UUO (Figure 7B, C). Allo stesso modo, i reni operati con la simulazione mostravano una normale espressione di podocina ma non avevano espressione di IL1b nei loro glomeruli (Figura 7D). D'altra parte, sia i reni collaterali che quelli UUO hanno perso l'espressione della podocina al centro dei glomeruli ma hanno mostrato l'espressione di IL1b lungo la rete glomerulare (Figure 7E, F). È stato riscontrato che la colorazione positiva è colocalizzata con podocina nei glomeruli dei reni collaterali e UUO (Figure 7E, F). L'esame SEM ha rivelato PFP normali nei reni di topo sham-operati, cancellazione PFP e strutture simili a microvilli nei reni collaterali e UUO di vecchi topi (Figura 7G).

DISCUSSIONESU

la prevalenza è comune nei neonati e negli anziani (4-7). Quindi, abbiamo sottoposto topi giovani e meno giovani a UUO per imitare la condizione ON di individui di diverse fasce di età ed abbiamo esaminato TIL e GL. Nel rene ostruito, la progressione dei TIL era evidente in una fase iniziale dell'ostruzione (2 giorni); tuttavia, la progressione dei GL insieme alla lesione dei podociti è stata osservata in una fase successiva. Il rene collaterale mostrava contemporaneamente GL e danno podocitario. Questa osservazione indica che il danno podocitario si verifica sia nei reni ostruiti che in quelli collaterali, sebbene l'insulto iniziale possa variare. I nostri studi precedenti hanno evidenziato la correlazione tra danno podocitario e infiltrazione di cellule immunitarie nel glomerulo (13, 16, 18). Tuttavia, nel presente studio non è stata osservata infiltrazione di cellule immunitarie nei glomeruli di reni fittizi o ostruiti. Pertanto, abbiamo considerato il coinvolgimento di altri fattori nella lesione dei podociti nel rene ostruito. Abbiamo ipotizzato che i segnali di pericolo (DAMP o PAMP), di origine circolatoria o derivanti da epitelio tubulare danneggiato, possano contribuire alla lesione dei podociti in ON, a causa della sua posizione unica nel glomerulo. È importante sottolineare che l'interazione tra DAMP e TLR ha dimostrato di svolgere un ruolo importante nella patogenesi di malattie non infettive (15). Diversi membri della famiglia TLR sono espressi sulla membrana plasmatica cellulare o sulle vescicole intracellulari (22) e sono caratterizzati come sensori immunitari innati che riconoscono efficacemente DAMP o PAMP. Dopo l'attivazione da parte di DAMP o PAMP corrispondenti, i TLR hanno potenziato l'espressione delle citochine a valle attraverso la via NF-kB e hanno indotto il sistema di difesa dell'ospite (22). Inoltre, i DAMP trasmettono la presenza di danno tissutale alle cellule immunitarie o alle cellule intrinseche locali e di conseguenza aggravano il danno tissutale (23-26). È importante sottolineare che tutti i TLR attivano la via NF-kB che controlla l'espressione di un array di geni infiammatori delle citochine (27). Inoltre, l'attivazione dei TLR segnala alle loro vie a valle di attivare NF-kB, che è responsabile dell'infiammazione e legato alla patogenesi dei tessuti danneggiati (28). Shichita et al. hanno rivelato le interazioni patologiche tra ligandi endogeni e TLR2 o TLR4, che contribuiscono al danno cerebrale ischemico (25). Precedenti studi hanno anche dimostrato la capacità dei membri della famiglia TLR di indurre TIL nel rene (TLR2, 4, 5, 7 e 11) e GL (TLR1–6, 8 e 9) (17, 29–33 ). Nel presente studio, abbiamo riscontrato un danno podocitario nei reni ostruiti e collaterali e chiarito il

ruoli di diversi membri della famiglia TLR che possono contribuire al danno podocitario (15, 16, 19, 20). Come abbiamo ipotizzato, l'espressione glomerulare di Tlr8 e Tlr9 era maggiore nei glomeruli isolati dal rene UUO rispetto a quelli dei topi sham-operati. Inoltre, l'espressione glomerulare delle citochine infiammatorie correlate alla via NF-kB, inclusi Il1b e Il6, era più alta nel rene UUO a 21 giorni dopo l'ostruzione. Pertanto, abbiamo concluso che il percorso NF-kB mediato da TLR svolge un ruolo importante nella patogenesi di GL nel rene ostruttivo. A differenza di altri membri della famiglia TLR, TLR8 e TLR9 vengono rilevati negli endosomi delle cellule. TLR8 riconosce RNA a filamento singolo e RNA a doppio filamento corto da microrganismi e attiva la produzione di diverse citochine mediate da NF-kB (22). D'altra parte, TLR9 riconosce i DNA a doppio filamento e attiva la via NF-kB per produrre citochine a valle (16, 34). In questo studio, abbiamo riconosciuto solo la colocalizzazione della proteina TLR8 insieme alla sinaptopodina PFM nei glomeruli. I nostri studi precedenti hanno anche dimostrato che sia TLR8 che TLR9 colocalizzano con PFM e attivano la produzione di citochine infiammatorie mediata da NF-kB per indurre danno podocitario (15, 16). Inoltre, altri studi hanno mostrato la correlazione patologica tra vie mediate da TLR e danno podocitario in vitro (34, 35). Banas et al. ha rivelato l'interazione di TLR4 nei podociti con il sistema immunitario durante lo sviluppo di GL (35). Pertanto, i podociti possono contribuire alla sorveglianza immunitaria attraverso percorsi mediati da TLR. In questo studio, abbiamo mostrato sia l'espressione del gene TLR8 che la localizzazione delle proteine ​​nei podociti del rene ostruito, nonché la maggiore espressione delle citochine a valle nel glomerulo. Pertanto, concludiamo che le vie mediate da TLR8-contribuiscono allo sviluppo di GL attraverso la lesione dei podociti nel rene ostruito.

Uno studio precedente ha mostrato che miR-21, un ligando endogeno di TLR8, può raggiungere e legarsi a TLR8 negli endosomi cellulari, in cui può indurre l'attivazione mediata da TLR8- della via NFkB e la secrezione di citochine proinfiammatorie (21). Nel presente studio, abbiamo riscontrato livelli significativamente più elevati di miR glomerulare-21 nonché livelli elevati di miR sierico-21 nel rene UUO rispetto a quelli dei controlli fittizi e abbiamo dimostrato la sua correlazione con l'espressione glomerulare di Tlr8 . È interessante notare che i glomeruli dei reni UUO trattati con miR-21 mimici hanno mostrato una maggiore espressione di Tlr8 e delle sue citochine a valle rispetto a quelli nei glomeruli di topi sham trattati con miR-21 mimici, indicando una maggiore disponibilità di miR endogeno -21 da tessuti danneggiati nel rene ostruito e l'attivazione della sovraespressione di Tlr8 nei reni UUO è paragonabile a quella di una finta. Insieme, concludiamo che un volume maggiore di miR-21 nel rene ostruito raggiunge gli endosomi nei podociti e induce l'attivazione mediata da Tlr8- della via NF-kB e la secrezione di citochine proinfiammatorie. Queste citochine, a loro volta, partecipano allo sviluppo di GL attraverso la lesione dei podociti.

IL1b è una delle importanti citochine a valle della via NF-kB, prodotta principalmente dai podociti nel glomerulo in condizioni di malattia. Precedenti studi hanno dimostrato che IL1b induce danno podocitario riducendo le PFM (36, 37). Nel presente studio, abbiamo mostrato una maggiore espressione glomerulare di Il1b e la sua colocalizzazione con PFM, che ha mostrato un'espressione ridotta. Inoltre, l'espressione glomerulare di Il1b era correlata a Tlr8 e tendeva a correlare con l'espressione di PFM (Nphs1 e Synpo). Pertanto, questi risultati indicano che i fattori a valle di Tlr8, inclusi Il1b e Il6, possono causare danni ai podociti nel rene ostruito riducendo l'espressione di PFM.

Anche i reni collaterali di topi giovani hanno mostrato GL e perdita di PFM. Questo risultato è stato confermato da SEM, che ha rivelato una lesione podocitaria nel rene collaterale. Abbiamo anche riscontrato livelli più elevati di miR sierico-21 nel modello murino ON. Inoltre, la proteina IL1b co-localizzata con PFM. Questi risultati indicano che il siero miR-21 interagisce con TLR8 nei podociti del rene collaterale e attiva la produzione di citochine a valle, che a sua volta riduce la funzione dei podociti e il danno dei podociti. La lesione dei podociti è stata osservata anche nei reni ostruiti e collaterali di topi anziani attraverso un meccanismo simile a quello osservato nei topi giovani.

In conclusione (Figura 8), l'espressione glomerulare di miR-21 è elevata a seguito di ostruzione ureterale unilaterale, in cui interagisce con TLR8 nei podociti e induce la produzione di citochine a valle (Il1b e Il6) suggerendo l'attivazione della via NF-kB. Livelli più elevati di citochine riducono le PFM, con conseguente danno ai podociti e successivo sviluppo di GL. Livelli elevati di miR sierico-21 attivano il TLR8 nei podociti del rene collaterale e inducono i GL attraverso la lesione dei podociti. Pertanto, questo studio mostra chiaramente lo sviluppo di GL nei reni ostruiti e collaterali attraverso la lesione dei podociti in seguito alla sovraespressione di Tlr8.