Poli- e oligosaccaride Ulva Sp. Le frazioni dell'estrazione assistita da enzimi modulano il metabolismo 2

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3. Discussione

Il nostro scopo principale è quello di valutare le potenziali attività biologiche delle frazioni poli-e oligosaccaridiche di Ulon sp. ottenuto dopo un innovativo processo di Estrazione Assistita da Enzimi (EAE), che è noto per migliorare la resa di estrazione [5] e consentire un significativo arricchimento della frazione ulva rispetto alla macerazione [36], sul metabolismo dei fibroblasti dermici della pelle umana in cultura.

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È stato svolto un focus sull'espressione delle componenti della matrice extracellulare cutanea (ECM) coinvolte nella via anabolica (in particolare collageni di tipo I e Ⅲ, GAG e TIMP-1) e nella via catabolica (MMP-1) a livello proteomico e trascrittomico. In questo lavoro, abbiamo ipotizzato che, a causa dell'elevata composizione in carboidrati e acidi uronici delle frazioni, l'attività sia correlata alla composizione degli ulvani (poli e oligosaccaridi). Tuttavia, gli autori non dovrebbero trascurare che il polisaccaride ulvans dell'Uloa sp. le pareti cellulari sono strettamente legate alle proteine, che sono anche note per promuovere la produzione in vitro di collagene totale e acido ialuronico nei fibroblasti dermici umani [39]. Pertanto, gli autori suggeriscono che queste attività potrebbero essere correlate a una sinergia tra ulvani e proteine, anche se in questo manoscritto l'attenzione è concentrata sugli ulvani. 3.1.Azione delle frazioni di Uloa poli-e oligosaccaridi da EAE sul metabolismo dei fibroblasti ECM

Studi precedenti hanno dimostrato che le frazioni di Uloa sp.Estratto di Cistanche Anti Radiazioni(ulvani grezzi e ulvani a basso peso molecolare) hanno la capacità di modulare la normale proliferazione dei fibroblasti dermici umani [36-38]. I nostri risultati hanno indicato che sia le frazioni poli-oligosaccaridiche da EAE hanno indotto un aumento significativo dell'attività metabolica dei fibroblasti (fino a più 68 per cento). Questi risultati hanno confermato i precedenti dati preliminari pubblicati degli autori [36] e il lavoro precedente sull'estratto idrolizzato di Uloa pertusa a 250 ug/mL che ha indotto una significativa proliferazione di fibroblasti pre e senescenti [38]. L'aumento dell'attività metabolica non è stato accompagnato dall'effetto citotossico delle frazioni (valutato dal test LDH), il che significa che i risultati della bioattività delle frazioni di poli- e oligosaccaridi Uloa da EAE non sono influenzati da un effetto citotossico nell'intervallo delle concentrazioni testate. Il nostro risultato è in accordo con studi precedenti che evidenziano gli ulvani come composti non citotossici su diversi tipi cellulari (linee cellulari di macrofagi, cellule intestinali, fibroblasti, cellule di topo e cellule di Vero)[13,14,4]

cistanche può antinvecchiamento

Come accennato nell'introduzione, i collageni di tipo I e III e i GAG interagiscono insieme per stabilire una rete molecolare per l'assemblaggio dell'ECM nel derma. Pertanto, in questo studio, la sintesi proteica e l'espressione del livello di mRNA dei componenti principali dell'ECM del derma (collagene di tipo I e Ⅲ e GAG ​​solfati e non) sono stati studiati in presenza di poli- e oligosaccaride Ullon sp. frazioni da EAE. Inoltre, l'MMP-1, un enzima chiave coinvolto nella degradazione del collagene di tipo I (via del catabolismo dell'ECM) e il suo inibitore tissutale TIMP-1 coinvolto nella sua regolazione sono stati valutati anche a livelli di proteine ​​e mRNA.

I risultati hanno rivelato che le frazioni Ulva sia poli che oligosaccaridiche da EAE hanno migliorato la sintesi di collagene totale a 1000 ug/mL (fino a più 2 percento valutato con il test Red sirius e risultati significativi ad eccezione di DEP-AD PP-UE). Questi risultati differiscono da uno studio precedente in cui i van grezzi e gli ulvani a basso peso molecolare non hanno effetti significativi sulla sintesi totale del collagene [37]. Tuttavia, i nostri risultati sono in accordo con il lavoro precedente, che ha mostrato che le preparazioni di polisaccaridi ricchi di L-ramnosio (ROP) da ceppi di polmonite di Klebsiella stimolano la sintesi del collagene[45]. Infatti, i fibroblasti dermici umani contengono un sito di lectina in grado di riconoscere -L-ramnosio [46]. In questo modo, la frazione ramnosica della frazione ulva può essere riconosciuta dal fibroblasto dermico umano e quindi promuovere la sintesi del collagene. In particolare, la sintesi del collagene di tipo I è stata aumentata per tutte le frazioni in ELISA (significativo per UE e DS-UE) e nei saggi Western blot (NS). Questo risultato è in accordo con la letteratura precedente sugli estratti idrolizzati di Ulva pertusa [38] e sui galattofucani depolimerizzati(<10kda)from saccharina="" longicruris[47]="" which="" respectively="" increased="" the="" synthesis="" of="" type="" i="" pro="" and="" mature="" collagen.="" in="" our="" study,="" steady-state="" levels="" of="" col1al="" and="" col1a2="" were="" reduced="" after="" exposure="" to="" poly-and="" oligosaccharide="" ulva="" fractions(significant="" for="" col1a1="" at="" 1000="" ug/nnl="" for="" all="" fractions).expression="" in="" coordinated="" manner="" of="" col1al="" and="" col1a2="" genes="" complies="" with="" the="" fact="" they="" are="" both="" subunits="" of="" type="" i="" collagen="" protein="" [48].="" regulation="" between="" type="" i="" collagen="" protein="" production="" and="" mrna="" are="" different="" at="" the="" same="" observation="" time="" of="" 48="" h,="" which="" suggests="" a="" different="" potential="" time="" response="" regulation="" between="" protein="" and="" mrna[49].="" nevertheless,="" protein="" is="" the="" functional="" unit="" in="" ecm="" and="" exhibits="" an="" important="" increase="" after="" treatment="" with="" ulvans-derived="" eae="" fractions.="" col3a1="" mrna="" level="" expression="" was="" increased="" (significantly="" for="" ue="" and="" ds-ue="" at="" 1000="" ug/ml)="" and="" correlated="" to="" an="" ns="" increase="" of="" type="" iii="" collagen="" synthesis="" evaluated="" by="" wb.="" moreover,="" the="" results="" showed="" that="" polysaccharide="" uloa="" fractions="" from="" eae="" (ue="" and="" ds-ue)="" boosted="" significantly="" gags(sulfated="" and="" non-sulfated)="" synthesis="" at="" 1000="" ug/ml,="" while="" both="" oligosaccharide="" fractions="" had="" no="" effect.="" our="" observations="" are="" in="" partial="" accordance="" with="" the="" work="" of="" adrien="" etal.="" (2017)="" in="" which="" the="" increase="" in="" hyaluronic="" acid="" production="" in="" fibroblasts="" occurred="" with="" both="" ulvans="" extracts="" (crude="" and="" low="" molecular="" weight="" ulvans)="" [37].="">cistanche erbaInfatti, nel nostro studio, gli ulvani a basso peso molecolare non hanno avuto alcun effetto sulla produzione di GAG (compreso l'acido ialuronico di GAG non solfati).

Poiché l'invecchiamento cutaneo è caratterizzato da uno squilibrio dei componenti della ECM (diminuiti livelli di collagene di tipo I e II e GAG), le frazioni poli e oligosaccaridiche ottenute da Uloa sp. dopo il trattamento con EAE sono di interesse nelle strategie anti-invecchiamento, poiché stimolano i collageni di tipo I e III e la sintesi dei GAG.

Tuttavia, i nostri risultati hanno anche evidenziato un aumento della sintesi, dell'attività e dell'espressione genica di MP-1 in presenza di frazioni derivate da EAE di poli-e oligosaccaridi Uloa. L'aumento dei livelli di mRNA di MMP-1 è stato correlato all'aumento della sintesi di MMP-1 in presenza di frazioni EAE derivate da Ulon e significativamente per le frazioni di polisaccaridi (UE e DS-UE). L'aumento di MMP La sintesi dell'enzima -1 è anche correlata a un aumento non significativo dell'attività MMP-1 in presenza delle frazioni. Il nostro risultato differisce dalla letteratura precedente poiché gli estratti idrolizzati di Uloa pertusa hanno inibito l'espressione e la secrezione di MMP-1 nei fibroblasti senescenti[38], oppure i polisaccaridi contenenti fucosio (denominati fucoidani) inibiscono l'espressione di MMP indotta da UVB-1 nei fibroblasti della pelle umana [50]. Tuttavia, il nostro risultato è in accordo con lo studio di FRioux et al. (2013), poiché i galattofucani grezzi (638-1529 kDa) hanno aumentato l'attività catalitica totale MMPs (incluso MMP-1) dei fibroblasti trattati per 6 giorni[47]. I nostri dati sull'aumento del livello di MMP sono anche in accordo con il lavoro di Andres et al. (2006), poiché i RROP (preparazioni di oligo e polisaccaridi ricchi di ramnosio da ceppi di Klebsiella pneumonia e K. planticola) sovraregolano l'espressione di MMP-9 [45]La sintesi di MMP potenziata-1 normalmente si traduce in una diminuzione dell'ECM quantità di componenti come il collagene di tipo I a causa dell'attività degradativa delle MMP-1, ma questo non è stato evidenziato nel nostro studio, poiché si è verificato un aumento del collagene di tipo I. Inoltre, le frazioni derivate da Uloa EAE non hanno avuto alcun impatto (aumento o diminuzione di NS) sul livello di espressione dell'mRNA e sulla produzione proteica di TIMP-1, un inibitore tissutale di MP-1 (ad eccezione di DEP-HD PP- UE con un significativo aumento proteico,p<0.05,at 1000="" μg/ml）.it="" appears="" that="" the="" anabolic/catabolic="" balance="" of="" ecm="" could="" be="" in="" favor="" of="" collagen="" synthesis="" despite="" mmp-1="" synthesis="" stimulation="" and="" activity.="" in="" this="" study,="" the="" authors="" thus="" showed="" that="" both="" poly-="" and="" oligosaccharide="" fractions="" derived="" from="" ulloa="" sp.="" after="" eae="" treatment="" are="" promoting="" fibroblast="" metabolism="" activity,="" ecm="" protein="" synthesis,="" and="" skin="" matrix="" renewal="" and="" remodeling,="" which="" is="" of="" interest="" for="" dermo-cosmetic="" applications="" in="" anti-aging="">

3.2. Ruolo dell'abbondanza ulva, della composizione del solfato e del peso molecolare nella modulazione dei fibroblasti ECM

È noto che la caratteristica strutturale degli ulvani che comprende il suo grado di solfatazione, modello di solfatazione, composizione di monosaccaridi, legami glicosidici, grado di ramificazione e peso molecolare influiscono sulla sua attività biologica [10,1,37,40,44,51 ].

Precedenti studi hanno dimostrato che il peso molecolare di composti bioattivi come polisaccaridi o proteine ​​sembra essere un fattore chiave per il suo effetto sulla proliferazione dei fibroblasti e sulla modulazione dell'ECM [37,39,47]. Nel nostro studio, le frazioni di polisaccaridi, UE e DS-UE, ad alto peso molecolare (Mw > 670 kDa) hanno aumentato la proliferazione dei fibroblasti. Sebbene le frazioni oligosaccaridiche (Mw<10 kda)="" also="" raise="" fibroblast="" proliferation,="" a="" dep-ad="" pp-ue="" fraction="" with="" lower="" molecular="" weight="" (mw="" of="" 1.5="" kda)="" has="" lower="" activity="" than="" dep-hd="" pp-ue="" (mw="" of="" 8="" kda).="" similar="" results="" were="" obtained="" on="" fibroblasts="" treated="" with="" rrops,="" since="" lower="" rrops="" exhibited="" similar="" or="" lower="" proliferation="" activity="" compared="" to="" higher="" mw="" rrops[45].="" polysaccharide="" fractions="" treatment="" also="" enhanced="" gags="" synthesis,="" total="" and="" especially="" type="" i="" and="" iii="" collagen="" synthesis,="" mp-1="" synthesis="" by="" human="" skin="" fibroblasts,="" whereas="" oligosaccharide="" fractions="" (low="" molecular=""><10 kda)="" and="" in="" particular="" dep-ad="" pp-ue="" (1.5="" kda)="" have="" lower="" capacities.="" only="" dep-hdpp-ue="" stimulated="" significatively="" total="" collagen="" synthesis="" and="" mp-1="" synthesis,="" while="" dep-ad="" pp-ue="" with="" lower="" molecular="" weight="" had="" no="" significant="" boost="" effect.="" these="" results="" are="" in="" accordance="" with="" work="" of="" kidgell="" et="" al.="" (2020)="" where="" higher="" molecular="" weight="" ulvan="" fractions="" elicited="" a="" greater="" biological="" activity="" (immunomodulatory="" response)="" compared="" to="" lower="" mw="" van="" fractions[44].="" these="" results="" are="" also="" in="" agreement="" with="" work="" of="" bodin="" et="" al.="" (20),="" since="" enzymatic="" hydrolyzed="" proteins="" from="" uloa="" intestinalis="" did="" not="" stimulate="" ecm="" material="" biosynthesis="" (collagen="" and="" hyaluronic="">

Gli autori hanno sottolineato che la migliore bioattività sulla sintesi dei GAG è stata attribuita alle frazioni ad alto peso molecolare di polisaccaridi solfati arricchite in ulvani grezzi. Ciò potrebbe essere correlato alla composizione intrinseca degli ulvani nei solfati e al suo peso molecolare, poiché l'oligosaccaride Ulva sp. le frazioni, parzialmente completamente prive di solfati, non hanno capacità di stimolare la sintesi dei GAG.crescita del pene cistancheUn altro studio su Ulku sp. ha mostrato l'importanza del grado di solfatazione ulvana sull'attività biologica poiché la frazione di Alvan solfata chimicamente, il contenuto di solfato raddoppiato dal polisaccaride nativo, l'attività anticoagulante fortemente aumentata [10] Inoltre, DS-UE ha aumentato maggiormente la modulazione ECM per quanto riguarda GAG, collagene totale e di tipo I e Ⅲ sintesi, rispetto a UE. Questa migliore bioattività potrebbe essere collegata alla maggiore abbondanza di ulvani e al maggiore contenuto di gruppi solfati nella frazione dializzata rispetto alle altre frazioni.

I nostri dati hanno mostrato che il poli-e oligosaccaride Uloa sp. le frazioni hanno mostrato diverse attività metaboliche, che possono essere attribuite all'abbondanza di ulvano, al suo grado di solfatazione e alla struttura chimica. Questo lavoro ha anche evidenziato una migliore attività per i furgoni ad alto peso molecolare che mostrano gruppi di solfato. Il fatto che le frazioni polisaccaridiche ricche di ulvani grezzi (cioè non depolimerizzati) abbiano avuto l'effetto maggiore sul metabolismo dei fibroblasti ECM è l'ideale per gli studi futuri e le sue potenziali applicazioni future nella cura dermocosmetica, poiché la lavorazione minima riduce i costi e i tempi di produzione.

4. Materiali e metodi

4.1.Materiale macroalgale

Alga verde, Ulva sp. (Chlorophyta, Ulvales, Ullvaceae), è stato acquistato dalla spiaggia intertidale Landrezac (47 gradi 30 gradi 17,9" N grado 2 grado 42 gradi 37,1" O) a Sarzeau (Bretagna, Francia) il 28 maggio 2018 durante il pomeriggio con la bassa marea. Il materiale è stato lavato con acqua del rubinetto, macinato a un diametro di 3 mm, congelato a-25 gradi , liofilizzato (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode am Harz, Germania) e conservato in una stanza temperatura al buio.

4.2. Produzione e caratterizzazione di frazioni poli-e oligosaccaridiche

In un precedente lavoro di Fourniere et al. (2019), è stata descritta la produzione dettagliata di frazioni di poli e oligosaccaridi dall'estrazione assistita da enzimi (EAE) (vedere la Figura 9 e la Tabella 3)[36].

Per riassumere brevemente, l'endoproteasi Protamex[(Novozymes, Bagsverd, Danimarca) è stata utilizzata al 6% (p/p) su Uloa sp essiccato. alga marina. L'idrolisi enzimatica è stata eseguita per 3 ore a 50 gradi. Quindi, l'estratto acquoso è stato sottoposto a precipitazione etanolica (1:5, v Fisher Scientific, Illkirch, Francia) a 4 gradi per 244 h al fine di ottenere la frazione ricca di ulvani grezzi (UE).

Quindi, la frazione DS-UE è stata prodotta dopo la dialisi di una frazione ricca di Evans grezzo (10 mg/mL) per 7 giorni a 4 gradi (cut-off 12-14 kDa, Spectra/Por94 Dialysis Membrane, Spectrum Laboratories, Fisher Scientific ,Illkirch, Francia).

Sono state eseguite due procedure di depolimerizzazione (depolimerizzazione radicale mediante H-OZ e depolimerizzazione con resina a scambio ionico) su soluzione di precipitato etanolico da una frazione ricca di ulvani grezzi (25 mg/mL). Per la depolimerizzazione radicalica, perossido di idrogeno (8 percento, v/v). , Fisher Scientific, Illkirch, Francia) è stato miscelato alla soluzione per 24 ore a 50 gradi e il prodotto è stato sottoposto a dialisi per 48 ore a 4 gradi (cut-off di 500-1000 Da, Biotech CE Tubing , Spectra/Por@, Fisher Scientific, IIllkirch, Francia). Per la depolimerizzazione acida, la resina Amberlite" FPC23H (equivalenti a 10 ml, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) è stata miscelata alla soluzione per 24 ore a 80 gradi e il prodotto è stato neutralizzato con NaOH (0,1 e 1 M) prima di subire 48 ore dialisi a 4 gradi (cut-off di 500-100 Da, Biotech CE Tubing, Spectra/Por", Fisher Scientific, Illkirch, Francia).benefici della salsa cistancheQueste due procedure hanno portato a frazioni oligosaccaridiche denominate DEP-HD PP-UE e DEP-AD PP-UE rispettivamente per H2OZ e la procedura di resina acida.

Tutte le frazioni sono state liofilizzate (Alpha 1-4LSC, Martin Christ Gefriertrocknungsanla-gen GmbH, Osterode am Harz, Germania) e conservate a 4 gradi prima dell'analisi. Caratterizzazione di queste frazioni: distribuzione del peso molecolare dei polisaccaridi mediante cromatografia ad esclusione dimensionale ad alta pressione (HPSEC, UHPLC Ultimate 300, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), composizione biochimica, composizione di monosaccaridi mediante cromatografia a scambio anionico ad alte prestazioni con amperometrico pulsato rilevamento (HPAEC-PAD, Dionex" ICS-5000* DC, Thermo Fisher Scientific, Illkirch, Francia) e spettrometria di massa di volo con desorbimento laser assistito da matrice (MALDI-TOF, Bruker, Billerica, Waltham, MA , USA) sono stati condotti anche in uno studio precedente [36].

4.3.Cultura cellulare

I campioni di fibroblasti cutanei umani sono stati forniti da "Laboratoire Interactions Ep-itheliums Neurones" (LIEN, EA 4685), Brest, Francia. Campioni dermici umani sono stati ottenuti da biopsie cutanee di donatori sani sottoposti a chirurgia addominoplastica. Lo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki e tutti i pazienti hanno firmato un modulo di consenso informato. Le raccolte di campioni hanno aderito al comitato degli accordi locali ("Comite de protection des personnes" Ouest VI) e referenziate sotto DC 2016-2833.

Fibroblasti dermici umani normali (NHDF) sono stati coltivati ​​in terreno eagle modificato di Dulbecco (DMEM, Lonza, Basilea, Svizzera) con l'10 percento (v/v) di siero bovino fetale (FBS, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francia ), una soluzione antibiotica all'1% (v/v)(Penicillina, Streptomicina 10,000 U/mL, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francia) e antimicotico all'1% (v/v)(Fungizone, amfotericina B, Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francia), in un incubatore a temperatura controllata con il 5% di CO2 a 37 gradi (Forma Steri-Cyclei160, Thermo Fisher Scientific Langenselbold, Germania). Le cellule sono state subcoltivate mediante tripsinizzazione (0,05 percento) e soluzione di EDTA (acido etilendiamminotetraacetico)((Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francia) dopo aver raggiunto la confluenza. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti tra il 3° e l'8° passaggio.

Le cellule sono state seminate su 96-micropiastre a pozzetti a una densità di 400 cellule/pozzetto per i test WST-1 e LDH (lattato deidrogenasi) su 12-piastre a pozzetti, a una densità di 5{{8 }} cellule/pozzetto per la colorazione Red sirius e Blue Alcian e il test RT-qPCR e su 6-piastre a pozzetti a una densità di 200.000 cellule/pozzetto per i test ELISA e Western blot.

In tutti gli esperimenti, dopo aver raggiunto l'80 percento di confluenza, le cellule sono state incubate in DMEM con il 2 percento di FBS in assenza o presenza delle frazioni di poli- e oligosaccaridi per 48 ore a 50 e 1000 ug/mL.

4.4.Saggio di proliferazione cellulare WST-1

Il test WST-1, in vitro, si basa sulla conversione del sale di tetrazolio WST-1 (4-[3-(4-lodofenil){{5 }}(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disolfonato) in formazano (colorante arancione) dalle deidrogenasi mitocondriali cellulari. Il cambiamento di colore è direttamente proporzionale alla vitalità e alla proliferazione delle cellule nella coltura.

Dopo 48 h di incubazione, il mezzo è stato rimosso e 100 ul di reagente WST-1 (kit di proliferazione cellulare WST-1, Roche Diagnostics, Meylan, Francia; diluizione 1:40 in DMEM con 2% FBS) sono stati aggiunto in ogni pozzo. Dopo 45 minuti di incubazione a 37 gradi con il 5% di CO2, l'assorbanza è stata misurata a 450 contro 630 nm con un lettore di micropiastre (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlandia). 4.5.Saggio di citotossicità LDH

Il test di citotossicità LDH si basa sulla misurazione della lattato deidrogenasi (LDH), che è un enzima citosolico stabile che viene rilasciato durante la lisi cellulare. L'LDH rilasciata nei supernatanti di coltura viene misurata tramite la conversione di un sale di tetrazolio (iodonitrotetrazolio violetto) in un prodotto di formazano rosso.cistanche tubulosa dosaggio redditLa quantità di formazano rosso misurata è proporzionale al numero di cellule lisate.

Il test LDH (CytoTox96@, Promega, Madison, WI, USA) è stato eseguito secondo le istruzioni del fornitore. Il controllo positivo (rilascio massimo di LDH) è stato eseguito aggiungendo 10 ul di soluzione di lisi 10×(Triton X-100 allo 0,8 percento) per 45 minuti prima di aggiungere il reagente CytoTox969. Dopo l'incubazione, 50 μL di surnatante di coltura cellulare sono stati trasferiti su una nuova micropiastra 96- (non sterile). Quindi, sono stati aggiunti 50 μL di reagente CytoTox96 gradi. La micropiastra è stata incubata per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Quindi, la reazione è stata interrotta con l'aggiunta di 50 μL di "Stop solution". Il rilascio di LDH è stato misurato mediante quantificazione dell'assorbanza con un lettore di micropiastre a 490 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlandia).

4.6.Colorazione al blu di Alcian per la quantificazione dei glicosaminoglicani

La colorazione blu di Alcian è un metodo di colorazione che consente di quantificare due tipi di glicosaminoglicani (GAG): solfati (eparan solfato, cheratan solfato, condroitin solfato e dermatan solfato) e non solfati (acido ialuronico). La soluzione di blu di Alcian a pH 1 colora i GAG solfati, mentre la soluzione a pH 2,5 colora i GAG non solfati.

Al termine dell'incubazione, il mezzo di coltura è stato rimosso e le cellule sono state risciacquate due volte con PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Irance). Quindi, le cellule sono state risciacquate per 5 minuti con 0.1N HCl(pH1, Fisher Scientific, Illkirch, Francia) o con acido acetico 3M (pH2.5, Fisher Scientific, Illkirch, Francia) al fine di ridurre il pH e rivelano rispettivamente glicosaminoglicani solfati e non solfati. Quindi, le cellule sono state colorate con Alcian Blue all'1% (8GX, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) in una soluzione di HC10.1N (pH1) o in una soluzione di acido acetico al 3% (pH2.5) per 30 minuti. Le cellule sono state risciacquate due volte con acqua di rubinetto per 5 minuti, asciugate sotto il cofano e risciacquate con acqua distillata per 5 minuti. Quindi, il colorante legato è stato solubilizzato con una soluzione di guanidina cloridrato 6M (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) per 5 minuti sotto agitazione a temperatura ambiente. La soluzione colorata è stata trasferita in una nuova 96-micropiastra e la lettura dell'assorbanza è stata eseguita a 600 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlandia).

4.7.Colorazione rossa di Sirius per la quantificazione del collagene totale

La procedura di colorazione Red Sirius permette di quantificare il collagene totale. Il rosso Picrosirius, un forte colorante anionico lineare comprendente sei gruppi solfonati, si associa lungo le fibre di collagene cationico.

Dopo l'incubazione, il mezzo di coltura è stato rimosso e le cellule sono state risciacquate due volte con PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Francia). Quindi, 1 ml di soluzione di Bouin Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) è stato aggiunto in ciascun pozzetto e le cellule sono state colorate per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi, le cellule sono state risciacquate due volte con acqua distillata e asciugate sotto il cofano. Le cellule sono state colorate con 1 ml di soluzione di Red Sirius (Sirius Red 80 in soluzione acquosa di acido picrico saturato, Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) per 1 ora. Dopo la colorazione, la soluzione è stata rimossa e le cellule sono state risciacquate successivamente con acqua distillata e HC10,01N per rimuovere il colorante non legato. Il colorante legato è stato solubilizzato con NaOH0.1N per 30 minuti. La soluzione colorata è stata trasferita in una nuova 96-micropiastra a pozzetti ed è stata eseguita una lettura dell'assorbanza a 550 nm (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlandia). 4.8.Il collagene di tipo I e gli MMP-1 ELISA

Dopo l'incubazione, le cellule sono state lavate due volte con PBS 1X (Fisher Scientific, Illkirch, Francia). I fibroblasti sono stati lisati in tampone RIPA (test di radioimmunoprecipitazione) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) integrato con cocktail di inibitori della proteasi (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) a 4 gradi per 1 ora. Le cellule sono state raschiate e i campioni sono stati agitati su vortice per 30 minuti e centrifugati (12,{7}}xg per 30 minuti a 4 gradi). I supernatanti contenenti proteine ​​​​intracellulari sono stati raccolti e quindi conservati a{10}} gradi fino all'analisi per la determinazione delle proteine ​​e l'analisi Western blot. La concentrazione proteica è stata determinata mediante Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) utilizzando come standard l'albumina di siero bovino (BSA).

Il surnatante di coltura cellulare è stato raccolto e centrifugato per rimuovere i detriti cellulari (200 × g per 10 minuti a 4 gradi) e conservato a -80 gradi fino all'analisi.

Le misurazioni del collagene di tipo I e dell'MMP-1 sono state valutate in terreni di coltura con kit Abcam (ab210966 kit ELISA SimpleStep Human Pro-Collagen I alpha 1 e ab215083 kit ELISA SimpleStep MMP1 umano, Cambridge, MA, USA) secondo le istruzioni del produttore . L'assorbanza è stata misurata a 450 nm con un lettore di micropiastre (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlandia). I risultati sono stati normalizzati con le concentrazioni di proteine ​​cellulari precedentemente determinate. 4.9.Macchia occidentaleL'estrazione di campioni proteici è stata descritta nella precedente Sezione 4.8. I campioni proteici con tampone Laemmli (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) sono stati bolliti per 5 minuti a 95 gradi e quindi centrifugati a 16,{8}}×g per 1 minuto. Uguali quantità di proteine ​​(10 ug) sono state caricate in pozzetti di gel TGX Stain-Free del 7,5% o 4-15% (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia), insieme a Precision Plus Protein "Unstained Protein standard (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) Il gel è stato eseguito a 200 V per 30 minuti (PowerPac"Basic con Mini-PROTEAN Tetra System, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia). Il trasferimento di proteine ​​dal gel a una membrana mini PVDF (fluoruro di polivinilidene) (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) è stato eseguito con un sistema di trasferimento Turbo Trans-Blot (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) ). La membrana è stata bloccata con 3% di BSA Gigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia) o 5% di latte in polvere scremato in TBST (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) per 1 ora a temperatura ambiente e lavato con TBST. La membrana è stata sondata con collagene di tipo I (Novotec, Reuver, Paesi Bassi), collagene di tipo III (Novotec, Reuver, Paesi Bassi), MMP-1 (EnoGene, New York, NY, USA) o TIMP{{43 }}(RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA) anticorpi; quindi, è stato lavato più volte con TBST e incubato per 1 ora a temperatura ambiente con anticorpi secondari coniugati con perossidasi (Jackson ImmunoResearch, Ely, Regno Unito). Quindi, il substrato ECL occidentale di chiarezza (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) è stato applicato per 5 minuti alle membrane e la rivelazione è stata eseguita utilizzando ChemiDoc XRS plus Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia). Il livello di proteine ​​è stato quantificato utilizzando il software ImageLab v6.01.1.

4.10.Zimografia

La zimografia è stata eseguita per analizzare la forma attiva della collagenasi MMP-1 secondo Inance et al. (2017) metodo adattato [52].

I gel SDS-PAGE (10 percento di poliacrilammide, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) sono stati copolimerizzati con 1 mg/mL di collagene di tipo I coda di ratto Gibco, Fisher Scientific, Illkirch, Francia). i campioni (5 ug) sono stati miscelati con tampone campione non riducente (Tris HCl 62,5 mM pH 6,8,20 glicerolo percento, SDS 4 percento, blu di bromofenolo 0,01 percento), centrifugati 1 minuto a 4 gradi, caricati in pozzetti del gel, insieme a Precision Plus Protein" All Blue Standards (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia), e quindi sottoposto a elettroforesi a 110 V a 4 gradi per 2 ore Il gel è stato lavato due volte in Triton X al 2,5%{{26 }} (v/v) per 15 minuti ogni volta al fine di rimuovere SDS Quindi, il gel è stato incubato in Zymogram Development Buffer (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) per 48 ore a 37 gradi. Dopo l'incubazione , il gel è stato colorato per 1 ora con una soluzione allo 0,5% di Coomassie Blue R{36}} (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) (p/v) e quindi decolorato in 40% di metanolo e 10% di acido acetico glaciale soluzione (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, Francia). L'attività MMP-1 è stata rilevata come una banda chiara su uno sfondo di gel colorato con Coomassie Blue. La quantificazione è stata eseguita su ChemiDoc XRS più Molecular Imager (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) con il software Image Lab versione 6.01.1 (Bio-Rad). 4.11. Isolamento dell'RNA e RT-PCR in tempo reale

Dopo 48 h di incubazione, l'RNA totale è stato estratto con TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e cloroformio (Acros Organics, Fisher Scientific, Illkirch, Francia), precipitato con isopropanolo (Fisher Scientific, Illkirch, Francia), lavato con etanolo 75 percento, essiccato sotto il cofano prima della risospensione in acqua trattata con DEPC (dietilpirocarbonato) (Fisher Scientific, Ilkirch, Francia). La quantità di RNA e il livello di purezza (tra 1,8 e 2.0) sono stati stimati con la misurazione dell'assorbanza su un lettore di micropiastre (Varioskan Lux, Thermo Fisher Scientific, Vantaa, Finlandia) a 260 e 280 nm utilizzando la piastra TM a goccia (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Un microgrammo di RNA totale è stato trattato con DNaseI (iScript Dnase Master Mix, Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) per 5 minuti a 25 gradi per rimuovere i contaminanti del DNA. L'enzima è stato inattivato per 5 minuti a 75 gradi.

La trascrizione inversa è stata eseguita su 1 ug di RNA totale, precedentemente trattato con DNasi I, utilizzando iScript Reverse Transcription (RT) Supermix (Bio-rad, Marnes-La-Coquette, Francia). I passaggi seguiti per la sintesi del cDNa sono stati 5 minuti a 25 gradi ,20 minuti a 46 gradi e 1 minuto a 95 gradi.

I controlli del non modello sono stati inclusi negli esperimenti di PCR. La qPCR è stata eseguita in 96-piastre a pozzetti per un volume totale di 20 μL contenenti 1 μL di 1∶15 campioni di cDNA diluiti da RT, 1 μL di primer (vedere Tabella 4, Bio-Rad, Marnes -La-Coquette, Francia), 10 μL di iTaq Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) e 8μL di acqua priva di nucleasi. Le condizioni di amplificazione erano 2 minuti a 95 gradi seguiti da 40 cicli di 5 secondi a 95 gradi e 30 secondi a 60 gradi e terminavano con 5 secondi a 95 gradi e 5 secondi a 65 gradi prima del protocollo per la curva di fusione: aumento di 0,5 gradi da 65 gradi a 95 gradi. Gli esperimenti PCR sono stati eseguiti sul sistema CFX 96 (Bio-Rad, Marnes-La-Coquette, Francia) e i risultati sono stati raccolti dal software Bio-Rad CFX Manager v3.1 (Marnes-La-Coquette, Francia). Le quantità di mRNA sono state normalizzate all'mRNA di RPL13A e l'analisi dell'espressione genica relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2-AACt.

4.12. Analisi statistica

Tutti i valori sono stati espressi come media di n esperimento ± errore standard (SE).

Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando Addinsoft (2020). La valutazione della distribuzione normale dei dati è stata valutata utilizzando il test di Shapiro-Wilk. Differenze significative tra i campioni di controllo e sperimentali sono state analizzate dal test t di Student (indipendente, a due code), quando si verificava la distribuzione normale, e dal test di Mann-Whitney, quando la distribuzione normale veniva rifiutata. Differenze significative rispetto al controllo secondo il test statistico sono indicate da asterischi(*p<><0.01 and=""><0.001). differences="" that="" are="" not="" statistically="" significant="" are="" named="" "ns"="" in="" the="" text="" and="" are="" characterized="" by="" the="" absence="" of="" asterisks="" on="" the="">

5. Conclusioni

Questo lavoro dimostra che le frazioni di poli e oligosaccaridi, arricchite in ulvani, recuperate dopo la nuova tecnologia verde EAE dall'alga verde Uloa sp., influenzano la proliferazione dei fibroblasti, la sintesi proteica ECM, il rinnovamento della matrice e il rimodellamento. Potrebbero emergere potenziali applicazioni nelle strategie cosmetiche antietà poiché l'invecchiamento cutaneo è caratterizzato da una diminuzione della sintesi di collagene. Pertanto, il rinnovamento della matrice cutanea è vantaggioso in questo contesto. Così, ulvans, da Ulva sp. frazioni ottenute dopo EAE, sono biologicamente attive sul metabolismo dei fibroblasti cutanei dermici umani. Gli autori suggeriscono che questa attività è una funzione dell'abbondanza ulvana, della composizione del solfato e del peso molecolare delle frazioni. Gli autori ipotizzano che queste molecole ricche di ramnosio solfato corrispondano a molecole di segnalazione, che sono riconosciute dai siti di lectina dei fibroblasti di membrana e successivamente stimolano la loro attività metabolica sia dal punto di vista anabolico che catabolico. Tuttavia, sono necessarie ulteriori indagini per valutare a fondo il meccanismo molecolare attivato dal poli-e oligosaccaride Ulou sp. frazioni a livello di fattori di trascrizione, la capacità di penetrazione di ulvani ad alto e basso peso molecolare in modelli di espianti cutanei 3D o ex vivo e confermano questi risultati della modulazione dell'ECM con frazioni derivate da Uloa EAE in questi modelli per un target anti-invecchiamento.

Questo articolo è tratto da Mar. Drugs 2021, 19, 156. https://doi.org/10.3390/md19030156 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs