itLingua
Casa / Conoscenza / Contenuto

Conoscenza

L'estratto di placenta suina aumenta i livelli di NAD cellulare nei cheratinociti epidermici umani Ⅱ

Jun 25, 2023

Discussione

Molti studi hanno dimostrato che ildiminuzione del NADdovuto all'invecchiamento è correlato con ildeclino funzionale dei tessutie ilsviluppo di malattie legate all'età e cancro11,22. Nell'epidermide, l'irradiazione UV, il fattore estrinseco più importante dell'invecchiamento cutaneo, provoca la deplezione di NAD einvecchiamento cronologico23. Poiché la pelle è costantemente esposta all'irradiazione UV nella vita quotidiana, l'applicazione topica di agenti che stimolano il NAD sembra essere un approccio ragionevole per prevenire la riduzione del NAD e proteggere la pelle dai danni UV. In effetti, è stato dimostrato che il potenziamento del NAD nella pelle previene il cancro della pelle indotto dai raggi UV e l'immunosoppressione nei topi24. Jacobsson et al. riferito che i derivati ​​topici dell'acido nicotinico aumentavano il contenuto di NAD della pelle e miglioravano la funzione di barriera25.

KSL12

Clicca qui per ottenere Cistanche, le migliori erbe antietà

Buy Cistanche

Inoltre, diversi studi clinici hanno dimostrato che l'applicazione topica del precursore NAD NAM si riducesegni di invecchiamento cutaneo26,27. Questi dati in vivo e clinici supportano la possibilità che livelli elevati di NAD prevenganodanni alla pelle e ritardare l'invecchiamento. Abbiamo anche precedentemente riportato che il mantenimento di livelli adeguati di NAD è essenziale per la protezione delle cellule epidermiche umane dallo stress UV21. In questo studio, abbiamo dimostrato che il PPE migliora i livelli di NAD intracellulare nei cheratinociti. Abbiamo anche scoperto che i suoi ingredienti attivi hanno un LMW inferiore a 3 kDa, che è efficace sia per i modelli di coltura dell'epidermide sia monostrato che 3-dimensionale. Questi risultati suggeriscono che i principi attivi del PPE potrebbero essere assorbiti per via transdermica e quindi evidenziano la sua potenziale applicazione come agente topico per aumentare i livelli di NAD nella pelle.

cistanche anti-aging herbs

Figura 3. La frazione attiva di LMW-PPE contiene diversi precursori NAD. (A) LMW-PPE (1 mg) è stato separato e monitorato alla lunghezza d'onda multipla (200-600 nm) mediante HPLC. (B) Gli eluenti sono stati raccoltiper 2 min e testato per l'attività di recupero del NAD in ogni frazione. (C) La frazione 3 è stata analizzata utilizzando LC-MS/SM. Tutti i composti sono stati rilevati in modalità ioni positivi.


image


Tabella 1. Contenuto precursore NAD di DPI.

Nella pelle, la carenza di NAD riduce la funzione delle principali vie metaboliche energetiche, come la glicolisi e la fosforilazione ossidativa. La glicolisi è indispensabile per mantenere un equilibrio tra la proliferazione e la differenziazione dei cheratinociti28. L'esposizione ai raggi UV diminuisce i livelli di NAD e quindi può accelerare questo squilibrio. È stato osservato che il rapporto tra differenziazione e proliferazione è notevolmente aumentato nella pelle esposta al sole rispetto alla pelle protetta dal sole29. Tan et al. hanno scoperto che il trattamento con FK866 ha accelerato la differenziazione e diminuito l'attività metabolica nelle NHEK e che il NAM ha invertito questi eventi indotti da FK866- ripristinando i livelli di NAD cellulare28.

cistanche anti-aging herbs


Figura 4. Il PPE topico mostra l'attività di recupero del NAD ma non influisce sull'attività metabolica cellulare, in RHE. (A) Illustrazione schematica del modello RHE. (B) PPE (2 mg/mL) è stato applicato al lato dello strato corneo di RHE e incubato per 48 ore in presenza o in assenza di FK866 (5 nM). I livelli totali di NAD nei tessuti sono stati determinati utilizzando un kit di analisi NAD plus/NADH. (C) PPE (0, 1, 2 o 10 mg/mL) o 1% TX-100 (come controllo positivo) è stato applicato al lato dello strato corneo di RHE e incubato per 48 ore . L'attività metabolica cellulare è stata determinata mediante saggio MTT. **P<0.01, the comparison to the control.

Nel presente studio, abbiamo scoperto che il PPE ha ripristinato l'esaurimento del NAD indotto da FK866-. Pertanto, determinare se il PPE può sostenere la differenziazione e la proliferazione nell'epidermide impoverita di NAD può fornire una migliorecomprensione della suameccanismo antietà.

cistanche anti-aging herbs

Recentemente, Aioi et al. hanno mostrato che l'uso topico di DPI riduce notevolmente le rughe del viso e migliora l'idratazione della pelle17. Il nostro precedente test clinico ha mostrato che l'applicazione topica della crema PPE ha portato a un miglioramento significativoparametri anti-invecchiamento cutaneo, ad esempiorughe,idratazione della pelle, cedevolee occhiaie (dati non pubblicati). I risultati di questo studio possono contribuire alla comprensione del meccanismo sottostante mediante il quale il PPE riduce le rughe e migliora l'idratazione della pelle. Un precedente rapporto ha mostrato che i livelli di NAD totale intracellulare sono positivamente correlati con l'espressione di componenti della matrice extracellulare, come procollagene ed elastina, nei fbroblasti della pelle umana30. Il trattamento dei fibroblasti con PPE determina un aumento della produzione di collagene di tipo I17. In combinazione con questi fatti, il PPE può promuovere la produzione di collagene aumentando il contenuto di NAD all'interno dei fibroblasti, il che può portare all'attenuazione delle rughe cutanee osservate negli studi clinici. L'idratazione della pelle è strettamente associata alla funzione barriera dello strato epidermico. Diversi studi hanno suggerito che il NAD è un cofattore essenziale per il mantenimento della funzione di barriera cutanea. Mining et al. ha mostrato che la deacetilasi SIRT1 NAD-dipendente regola l'espressione della filaggrina, che svolge un ruolo fondamentale come proteina precursore di fattori idratanti naturali nell'integrità della barriera cutanea31. Inoltre, uno studio clinico ha dimostrato che l'applicazione topica di un agente potenziatore del NAD ha ridotto notevolmente la perdita di acqua transepidermica, insieme ad un aumento dello spessore dello strato corneo nella pelle fotodanneggiata25. Questi rapporti suggeriscono che il PPE può migliorare la funzione di barriera cutanea aumentando i livelli di NAD cellulare nell'epidermide, probabilmente portando a una migliore idratazione della pelle osservata negli studi clinici.


Negli ultimi anni, i booster NAD si sono dimostrati utili per migliorare gli effetti antiossidanti e antinfiammatori. Nei modelli murini diabetici e settici, la somministrazione di NR ha ridotto significativamente l'infiammazione cerebrale indotta da una dieta ricca di grassi e ha prevenuto rispettivamente lo stress ossidativo endoteliale indotto dai lipopolisaccaridi 32,33. Simile a NR, l'integrazione di NMN nei topi anziani ha dimostrato di invertire il profilo di espressione dell'mRNA pro-infiammatorio nell'unità neurovascolare e di migliorare la funzione cardiovascolare diminuendo lo stress ossidativo34,35. Inoltre, uno studio clinico condotto su uomini anziani ha rivelato che la NR orale riduce i livelli di citochine infiammatorie circolanti36. Presi insieme, questi studi in vivo e clinici supportano l'idea che l'applicazione di agenti potenziatori del NAD fornisca effetti antiossidanti e antinfiammatori. L'attività SIRT potenziata è stata suggerita come uno dei meccanismi plausibili mediante i quali questi booster NAD esercitano effetti antinfiammatori e antiossidanti. È noto che i DPI hanno effetti antiossidanti e antinfiammatori15; tuttavia, fino ad oggi è stata condotta un'esplorazione meccanicistica relativamente limitata. Il presente studio fornisce almeno una spiegazione parziale degli effetti dei DPI.


È noto che il PPE contiene abbondanti proteine ​​che promuovono la crescita cellulare come laminina, citochine e fattori di crescita. Studi recenti, incluso il nostro, hanno implicato che i livelli di NAD cellulare siano associati alla crescita cellulare nei cheratinociti epidermici21,28. Quindi, abbiamo ipotizzato che alcune di queste proteine ​​potrebbero contribuire all'aumento del contenuto di NAD. Tuttavia, contrariamente alle nostre aspettative, abbiamo scoperto che una porzione contenente molecole a basso peso molecolare inferiore a 3 kDa promuoveva la produzione di NAD nei cheratinociti. È interessante notare che il frazionamento della porzione PPE mediante HPLC ha rivelato che la produzione di NAD è stata osservata solo nella frazione 3. Abbiamo anche scoperto che i precursori di NAD, come NMN, NR e NAM, erano presenti in questa frazione, suggerendo che potrebbero spiegare l'effetto di DPI sulla produzione di NAD, almeno in parte. Tuttavia, poiché ogni costituente contenuto nel PPE è stato rilevato a concentrazioni molto basse, sembra difficile spiegare che questi costituenti da soli siano responsabili della capacità del PPE di promuovere il contenuto di NAD nei cheratinociti. Rapporti recenti hanno dimostrato che le forme ridotte di questi precursori NAD, NRH e NMNH, hanno una maggiore capacità di produrre NAD rispetto a NR e NMN37-40. Sebbene siano necessarie ulteriori analisi per determinare se il PPE contenga NRH e NMNH, la capacità di potenziamento del NAD del PPE osservata in questo studio può essere attribuita a più potenziatori del NAD, inclusi NMN, NR, NMNH, NRH e altri precursori NAD sconosciuti.

cistanche best anti-aging herbs

In conclusione, i nostri risultati aprono la possibilità di utilizzare il PPE per migliorare varie malattie e sintomi aumentando i livelli intracellulari di NAD, un cofattore essenziale coinvolto in varie reazioni biochimiche cellulari.



Materiali e metodi

Preparazione dei DPI. Il PE è stato isolato dalla placenta suina congelata. Dopo aver rimosso ogni traccia di sangue e cordone ombelicale, la placenta suina è stata lavata, omogeneizzata e sottoposta a tre cicli di congelamento-scongelamento. L'omogenato di tessuto è stato centrifugato a 120 × g per 1 minuto e il supernatante è stato raccolto e utilizzato come PPE. Per calcolare il contenuto solido secco, il DPI è stato concentrato ed essiccato a 105 gradi per 5 ore. Dopo il raffreddamento nella stanza

temperatura in un essiccatore, il peso è stato misurato con una bilancia di precisione. Il contenuto solido secco di PPE era di 10,98 mg/mL.

best anti-aging herbs

Colture cellulari.

Gli NHEK (neonati/maschi, Termo Fisher Scientifc, Waltham, MA, USA) sono stati coltivati ​​in terreno EpiLife™ contenente 60 μM di calcio integrato con integratore per la crescita di cheratinociti umani (entrambi di Termo Fisher Scientifc) a 37 gradi in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 . Il mezzo è stato cambiato a giorni alterni fino a quando la coltura ha raggiunto circa il 50% di confluenza, dopodiché è stato cambiato ogni giorno. Le cellule sono state attraversate quando hanno raggiunto l'80-90% di confluenza. Gli NHEK non sono stati utilizzati oltre il passaggio 5.



Quantificazione del NAD e saggio di recupero.

La quantità di NAD è stata misurata utilizzando il NAD plus /NADH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Giappone) secondo le istruzioni del produttore. In breve, 1.0× 105 NHEK sono stati seminati in 12-pozzetti. Dopo 24 ore, le cellule sono state trattate con PPE a diverse opzioni di concentrato (0, 0.25, 0,5 e 1 mg/mL) e coltivate per 1–24 ore in presenza o in assenza di 5 nM FK866 (AdooQ Bioscience, Irvine, CA, USA). Le cellule sono state lisate con il tampone di estrazione NAD plus /NADH fornito e ultrafiltrate utilizzando un dispositivo di filtro centrifugo Ultracel-10 K (Merck, Darmstadt, Germania). Per calcolare la concentrazione di NADH, metà dei filtrati sono stati incubati a 60 gradi per 60 minuti per decomporre NAD più . Tutti i filtrati sono stati sottoposti alla reazione enzimatica a 37 gradi per 1 ora. Quindi, l'assorbanza dei campioni è stata misurata a 450 nm utilizzando un lettore di piastre Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Svizzera). Il contenuto di NAD plus è stato calcolato sottraendo il contenuto di NADH dal contenuto totale di NAD. I livelli di NAD plus /NADH sono stati normalizzati alle rispettive concentrazioni proteiche determinate utilizzando il dosaggio proteico Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific).


Saggio MTT. Le NHEK sono state seminate in una piastra a {{0}}pozzetti a 0.5× 105 cellule per pozzetto e incubate per 24 ore. Le cellule sono state quindi trattate con PPE (0,5, 1, 2 e 5 mg/mL) o 0,2% di TX-100 per 24 ore. Le cellule sono state incubate

con 300 μL di soluzione MTT (Thermo Fisher Scientific) da 1 mg/mL a 37 gradi e 5% di CO2 per 3 ore. Dopo aver lavato tre volte con PBS, il formazan infiltrato negli NHEK è stato estratto con 200 μL di dimetilsolfossido a temperatura ambiente per 2 ore. L'assorbimento ottico a 560 nm è stato determinato utilizzando un lettore di lastre Infnite 200 Pro (Tecan).


Ultrafiltrazione dei DPI. Il PPE (500 μL) è stato applicato a un filtro centrifugo Ultracel -3 K (Merck Millipore) e centrifugato a 16.100 × g a 4 gradi per 60 min. I filtrati sono stati utilizzati come frazione LMW di PPE. Per recuperare i residui sul filtro, i dispositivi filtranti sono stati posti capovolti in una nuova provetta da centrifuga e centrifugati a 1000×g a 4 gradi per 5 min. I residui sono stati ricostituiti con 500 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e utilizzati come frazione HMW di PPE.


Frazionamento HPLC. Per il frazionamento di LMW-PPE, abbiamo utilizzato un sistema a gradiente HPLC dotato di un iniettore di campioni a caricamento siringa, pompe doppie, un rilevatore multi-UV MD-2010 (Jasco, Tokyo, Giappone) e
una colonna a fase inversa C 18 (Inertsil ODS -3, 5 μm, 4,6 × 250 mm, GL Science, Tokyo, Giappone). Per un'elevata riproducibilità, è stata utilizzata una colonna analitica per il frazionamento piuttosto che una colonna preparativa. Te solventi per HPLC
erano 0,05% di acido trifluoroacetico in acqua (A) e acetonitrile di grado HPLC (B). Cento microlitri di LMW-PPE sono stati applicati alla colonna HPLC e separati utilizzando il seguente gradiente a una velocità di flusso di 1 mL/

min: mantenere l'100 percento di solvente A da 0 a 10 min, quindi un gradiente lineare dallo 0 percento B in 10 min al 95 percento B in 30 min. Gli eluenti sono stati raccolti in provette campione ogni 2 minuti e asciugati utilizzando un evaporatore centrifugo CVE -3100 (EYELA, Tokyo, Giappone). I residui sono stati ricostituiti con 100 μL di PBS e filtrati attraverso una membrana da 0,22 μm prima di utilizzare il test di recupero NAD.


Analisi dei precursori NAD.

NMN, NR e NAM sono stati rilevati e quantificati mediante diluizione isotopica LC-MS/MS. Le analisi sono state eseguite utilizzando un sistema ACQUITY UPLC H-Class accoppiato con uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo TQS-micro (Waters, Milford, MA, USA) con ionizzazione elettrospray operata in modalità ioni positivi. Per separare ciascun campione è stata utilizzata una colonna Capcell Pak ADME HR (2 μm, 2,1×100 mm, Osaka Soda, Osaka, Giappone). Le fasi mobili A-B erano acqua-metanolo (contenente {{10}},1% di acido formico e 10 mM di formiato di ammonio). La condizione del gradiente era la seguente: 0–0,5 min (99 percento A), 0,5–3 min (99–60 percento A), 3–5 min (60–2 percento A) e 5–7 min (2 percento A). La portata era di 0,2 ml/min. La tensione capillare era di 0,75 kV, la temperatura della sorgente era di 150 gradi e la temperatura di desolvatazione era di 500 gradi. Il flusso di gas del cono era di 50 L/he il flusso di gas di desolvatazione era di 1100 L/h. Per quantificare ciascun precursore NAD, ai campioni è stato aggiunto NAM-13C6 a una concentrazione di 78 nM come standard interno. Gli ioni sono stati monitorati utilizzando il monitoraggio di reazioni multiple (MRM) con le seguenti transizioni: m/z 335→123 per NMN, m/z 255→123 per NR, m/z 123→80 per NAM e m/z 129→85 per NAM-13C6. NMN è stato acquistato da Oriental Yeast (Tokyo, Giappone). NR e NAM-13C6 sono stati ottenuti da Merck (Darmstadt, Germania). NAM è stato acquistato da Wako Pure Chemical Industries (Osaka, Giappone).



RE. Il modello RHE in vitro EpiDerm™ (EPI-200) è stato acquistato da MatTek (Ashland, MA, USA) e coltivato in terreno EPI-100-ASY (MatTek) a 37 gradi e 5% di CO2. Cento microlitri di PPE (1, 2 e 10 mg/mL) o 1% di TX-100 sono stati applicati al lato dello strato corneo dell'RHE. L'RHE è stato incubato per 48 ore in un terreno EPI-100-ASY in presenza o in assenza di FK866 (5 nM). Dopo l'incubazione, l'RHE è stato lavato tre volte con PBS. Per il test di recupero del NAD, i livelli totali di NAD in RHE sono stati quantificati utilizzando il NAD plus /NADH Assay Kit-WST. Per il test dell'attività metabolica cellulare, l'RHE è stato trasferito in una 24-pozzetto e incubato con 300 μL di 1 mg/mL di soluzione MTT (Thermo Fisher Scientific) a 37 gradi e 5% di CO2 per 3 ore. Dopo aver lavato tre volte con PBS, il formazan infiltrato in RHE è stato estratto con 2 mL di dimetilsolfossido a temperatura ambiente per 2 ore. L'assorbimento ottico a 560 nm è stato determinato utilizzando un lettore di lastre Infnite 200 Pro (Tecan). L'assorbanza con RHE trattato con TX-100 all'1% è stata utilizzata come controllo positivo per il test dell'attività metabolica cellulare.

Analisi statistica. I dati sono presentati come media ± errore standard della media di almeno tre esperimenti indipendenti. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software EZR versione 1.55 (Saitama Medical

Center, Jichi Medical University, Saitama, Giappone). Prima del confronto dei dati, la normalità della distribuzione è stata confermata dal test di Shapiro-Wilk. L'omogeneità delle varianze è stata valutata con il test F (due gruppi) e
Test di Bartlett (più gruppi). Le differenze tra più gruppi sono state determinate utilizzando ANOVA unidirezionale seguita dal test post hoc di Tukey. Il test t di Student è stato utilizzato per testare differenze significative tra i due
gruppi. La significatività statistica è stata fissata a p<0.05 and p<0.01. Asterisks and daggers indicate statistical significance compared to the control (*p<0.05, **p<0.01) and indicated (†p<0.05 and ††p<0.01) groups, respectively.
Approvazione etica. Non applicabile. Le placente suine prelevate e immediatamente congelate entro 3 ore dal parto spontaneo dei feti sono state acquistate da un allevamento di Hokkaido, in Giappone, con il consenso del proprietario. Nessun animale vivo è stato coinvolto in questo studio


Riferimenti

1. Imai, Si. & Guarente, L. NAD plus e sirtuine nell'invecchiamento e nella malattia. Tendenze Cellulare Biol. 24, 464–471 (2014).
2. Chaleckis, R., Murakami, I., Takada, J., Kondoh, H. & Yanagida, M. La variabilità individuale nei metaboliti del sangue umano identifica le differenze legate all'età. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113, 4252–4259 (2016).
3. Massudi, H. et al. Cambiamenti associati all'età nello stress ossidativo e nel metabolismo NAD plus nel tessuto umano. PLoS UNO 7, e42357 (2012).
4. Camacho-Pereira, J. et al. Il CD38 determina il declino del NAD legato all'età e la disfunzione mitocondriale attraverso un meccanismo SIRT3-dipendente. Cell Metab. 23, 1127–1139 (2016).
5. Braidy, N. et al. Cambiamenti legati all'età nel NAD più stress ossidativo del metabolismo e attività sirt1 nei ratti Wistar. PLoS UNO 6, e19194 (2011).
6. Guest, J., Grant, R., Mori, TA & Croft, KD Cambiamenti nel danno ossidativo, infiammazione e [NAD (H)] con l'età nel liquido cerebrospinale. PLoS UNO 9, e85335 (2014).
7. Rajman, L., Chwalek, K. & Sinclair, DA Potenziale terapeutico delle molecole che potenziano il NAD: evidenza in vivo di Te. Cell Metab. 27, 529–547 (2018).
8. Metabolismo di Yaku, K., Okabe, K. & Nakagawa, T. NAD: implicazioni nell'invecchiamento e nella longevità. Invecchiamento Ris. Apocalisse 47, 1–17 (2018).
9. La via di biosintesi di Revollo, JR, Grimm, AA e Imai, SI Te NAD mediata dalla nicotinamide fosforibosiltransferasi regola l'attività di Sir2 nelle cellule di mammifero. J. Biol. Chim. 279, 50754–50763 (2004).
10. Yoshino, J., Baur, JA & Imai, SI NAD plus intermedi: Te biologia e potenziale terapeutico di NMN e NR. Cell Metab. 27.513–528 (2018).
11. Garrido, A. & Djouder, N. NAD plus deficit di malattie legate all'età e cancro. Tendenze Cancro 3, 593–610 (2017).
12. Pogozhykh, O., Prokopyuk, V., Figueiredo, C. & Pogozhykh, D. Placenta e derivati ​​della placenta nelle terapie rigenerative: studi sperimentali, storia e prospettive. Cellule Staminali Int. 2018, 4837930 (2018).
13. Kong, MH et al. Effetto dell'estratto di placenta umana sui sintomi della menopausa, affaticamento e fattori di rischio per le malattie cardiovascolari nelle donne coreane di mezza età. Menopausa 15, 296–303 (2008).
14. Yoshikawa, C. Effetto dell'estratto di placenta suina sulla produzione di collagene nei fibroblasti della pelle umana in vitro. Ginecolo. Ostetto. 03, 0–4 (2013).
15. Heo, JH, Heo, Y., Lee, HJ, Kim, M. & Shin, HY Effetti topici antinfiammatori e antiossidanti degli estratti di placenta suina sulla dermatite da contatto indotta da 2,4-dinitroclorobenzene. Complemento BMC. Alternativo. Med. 18, 331 (2018).
16. Tiwary, SK et al. Effetto del gel e della crema all'estratto placentare sulle ferite che non guariscono. J. Cura delle ferite 15, 325–328 (2006).
17. Aioi, A. et al. L'estratto di placenta suina riduce la formazione di rughe potenziando l'idratazione epidermica. J. Cosmeto. Dermatolo. Sci.

Appl. 11, 101–109 (2021).

Chiedere di più:


E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel: più 86 15292862950













Potrebbe piacerti anche