Immunità preesistente delle cellule T al SARS-CoV-2 nei controlli sani non esposti in Ecuador, rilevata con un test di rilascio dell'interferone-gamma COVID-19

ASTRATTO

Contesto: gli studi sulle risposte immunitarie delle cellule T contro SARS-CoV-2 sono importanti per comprendere lo stato immunitario di individui o popolazioni. Qui, utilizziamo un test di stimolazione del sangue intero semplice, economico e rapido - un test di rilascio dell'interferone-gamma (IGRA) - per studiare l'immunità delle cellule T al SARS-CoV-2 nei pazienti convalescenti COVID-19 e contatti sani non esposti da Quito, Ecuador. Metodi: la produzione di interferone-gamma (INF-g) è stata misurata nel sangue eparinizzato di soggetti convalescenti e non esposti dopo stimolazione per 24 ore con la proteina SARS-CoV-2 Spike S1, la proteina Receptor Binding Domain (RBD) o la proteina Nucleocapsid (NP), rispettivamente. La presenza di anticorpi proteici IgG-RBD in entrambi i gruppi di studio è stata determinata con un ELISA "in-house". Risultati: come misurato con la produzione di INF-g, l'80% dei pazienti COVID-19 convalescenti, tutti sieropositivi per IgG-RBD, ha avuto una forte risposta delle cellule T.

Tuttavia, inaspettatamente, il 44% dei controlli sani non esposti, tutti IgG-RBD sieronegativi, ha avuto una forte risposta delle cellule T virus-specifiche con il COVID-19 IGRA, probabilmente a causa della precedente esposizione ai comuni coronavirus che causano il raffreddore o altri antigeni virali o microbici. Conclusione e discussione: l'elevata percentuale di soggetti sani non esposti con un'immunità preesistente suggerisce che è probabile che una parte della popolazione ecuadoriana abbia cellule T reattive SARS-CoV-2. Dato che la tecnica IGRA è semplice e può essere facilmente ampliata per indagini in cui è necessario un numero elevato di pazienti, questo COVID-19 IGRA può servire a determinare se la risposta delle sole cellule T rappresenta l'immunità protettiva al SARS-CoV -2 infezione in uno studio basato sulla popolazione. © 2021 Gli Autori. Pubblicato da Elsevier Ltd per conto della Società Internazionale per le Malattie Infettive.

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introduzione

La risposta immunitaria all'infezione da SARS-CoV-2 coinvolge non solo la produzione di anticorpi, ma l'infezione innesca anche una risposta delle cellule T nei pazienti (Lipsitch et al., 2020, Ni et al., 2020). In generale, la determinazione della presenza e dell'entità di una specifica risposta delle cellule T di memoria a questa infezione da coronavirus viene eseguita con un test ELISPOT stabilendo il numero di linfociti che producono IFN-g dopo la stimolazione con antigeni o peptidi specifici della malattia (Ni et al., 2020, Pai et al., 2014, Abate et al., 2013, Braun et al., 2020, Grifono et al., 2020, LeBert et al., 2020, Sekine et al., 2020).

Per questa tecnica, le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) vengono isolate dal sangue eparinizzato fresco mediante centrifugazione in gradiente di densità; la secrezione di citochine da parte dei singoli linfociti T è quantificata al microscopio o con un apparato speciale – il lettore di piastre ELISPOT. Il test ELISPOT è una tecnica "solo per laboratori di ricerca" che è molto laboriosa, tecnicamente impegnativa, relativamente costosa e non può essere facilmente utilizzata in un laboratorio clinico o applicata in studi basati sulla popolazione. A causa dei costi, delle infrastrutture e dei requisiti di laboratorio necessari per eseguire il test, il suo utilizzo in contesti con risorse limitate come l'Ecuador potrebbe essere minimo.

Le risposte immunitarie cellulari possono anche essere determinate con un test più semplice: un test di rilascio di interferone-gamma (IGRA). Questo saggio, un esame del sangue in vitro, quantifica le citochine secrete dalle cellule T (ad es. interferone gamma (IFN-g); tuttavia, possono essere quantificate anche altre citochine come TNF o IL-2) dopo stimolazione del sangue intero (non solo i linfociti isolati) con antigeni specifici (Pai et al., 2014, Abate et al., 2013). La citochina secreta IFN-g viene misurata con un test ELISA, una tecnica prontamente disponibile nella maggior parte dei laboratori, ei risultati vengono letti con un lettore di piastre ELISA. Gli IGRA hanno trovato applicazione nel laboratorio clinico e sono utilizzati per determinare un'infezione latente da Mycobacterium tuberculosis (MTB) e per misurare l'immunità cellulo-mediata specifica del citomegalovirus (CMV) e predire l'infezione da CMV nei riceventi di trapianto (Pai et al. , 2014, Abate et al., 2013). Questi test IGRA sono stati ampiamente valutati e, confrontati con il test ELISPOT, hanno dimostrato di mostrare capacità simili per la previsione dell'infezione da MTB o CMV. Inoltre, sono disponibili e ampiamente eseguiti diversi test commerciali e con marchio FDA o CE per rilevare l'immunità contro TB o CMV.

Nel presente studio, esploriamo l'uso di un IGRA COVID-19 e valutiamo l'entità del rilascio di IFN-g nei pazienti COVID-19 convalescenti e nei controlli naïve COVID-19 sani in risposta a specifici antigeni del virus SARS-CoV-2: la proteina RBD; la parte S1 della proteina Spike; o la proteina Nucleocapsid (N). Inoltre, determiniamo la presenza di anticorpi IgG specifici per SARS-CoV-2 in quei partecipanti con un ELISA "interno" (Amanat et al., 2020, Guevara et al., 2021). Mostriamo che una percentuale significativa di donatori non esposti possiede cellule T reattive SARS-CoV-2 e discutiamo questi risultati.

materiale e metodi

Pazienti COVID-19 convalescenti, controlli sani e ambiente

Questo studio è stato condotto a Quito, in Ecuador, nel settembre 2020. Non sono stati utilizzati metodi statistici per predeterminare la dimensione del campione. La Tabella 1 mostra le caratteristiche dei 32 pazienti in questo studio: tredici pazienti COVID-19 convalescenti, tutti con sintomi/segni COVID-19 non gravi e diagnosi RT-PCR positiva nel giugno 2020; e 17 controlli sani non esposti. Questi controlli sani erano stati estremamente cauti durante la pandemia, evitando il contatto con altre persone, e non avevano riferito nessuno dei tipici segni e sintomi del COVID-19 per tutta la durata della pandemia, come febbre, tosse persistente, o una perdita dell'olfatto o del gusto. Inoltre, in questo studio sono stati inclusi due portatori asintomatici di SARS-CoV-2. Questi due soggetti non hanno mai mostrato sintomi o segni di malattia COVID-19; tuttavia, la tecnica RT-PCR è stata eseguita su di loro come requisito per un permesso di lavoro nel giugno 2020 e ha portato a diagnosi positive.

Sierologia

Sierologia e IGRA per tutti i pazienti e i controlli sono stati eseguiti durante le ultime due settimane di settembre 2020, tre mesi dopo la diagnosi RT-PCR dei pazienti convalescenti. Per determinare la presenza di anticorpi IgG specifici per il coronavirus nel nostro gruppo di studio, è stato utilizzato un SARS-CoV-2 Receptor Binding Domain (RBD) IgG ELISA "interno" (9, 10).

Saggio di rilascio dell'interferone gamma (IGRA)

Per l'IGRA è stato prelevato un campione di sangue eparinizzato (4 mL) suddiviso in aliquote di 250 mL e stimolato rispettivamente con 2 mg/mL della proteina RBD (procedura di isolamento dal riferimento 9) o 2 mg/mL del Nucleocapside disponibile in commercio (N) o proteina Spike (S1) (ViroGen, numeri di catalogo: 00,221-V e 00,226-V rispettivamente). Per determinare la concentrazione ottimale degli antigeni per la stimolazione nell'IGRA è stata utilizzata una curva dose concentrazione-risposta con sangue di pazienti IGRA-positivi e IGRA-negativi. A 2 ug/mL, è stata trovata una risposta massima di IFN-g nel sangue di soggetti COVID-19 senza stimolazione nei controlli non infetti. Per ogni partecipante è stato incluso un controllo non stimolato (NIL) e abbiamo analizzato un campione di sangue da 250 ml con la fitoemoagglutinina mitogena (PHA), un controllo positivo per valutare il tasso di risposta delle citochine del campione di sangue. La stimolazione è stata realizzata in una 96-piastra ELISA a fondo piatto a 37°C per 24 ore. Il plasma è stato raccolto e la produzione di IFN-g è stata determinata con un ELISA di IFN-g umano (MaxTM Standard Set Biolegend cat. No. 430,101).

Risultati

L'ELISA RBD IgG ha mostrato che tutti i pazienti sintomatici COVID{{0}} (positivi per RT-PCR) erano positivi per gli anticorpi IgG contro la proteina RBD tre mesi dopo la diagnosi RT-PCR. I due pazienti asintomatici positivi alla RT-PCR e tutti i pazienti di controllo sani non esposti erano sieronegativi con questo test ELISA (vedere Tabella 1). I risultati della stimolazione del sangue intero nel test COVID-19 IGRA sono mostrati nella Figura 1. È stata riscontrata una forte induzione della produzione di IFN-g nell'80 percento dei pazienti sintomatici COVID-19 con tutti e tre gli antigeni, ma la proteina N e la proteina S erano i più potenti stimolatori di una risposta IFN-g (Figura 1 A, B, C). Anche i due pazienti asintomatici ma positivi alla RT-PCR (pazienti 14 e 15), entrambi senza anticorpi specifici per SAR-CoV-2, hanno mostrato una forte risposta immunitaria inducibile delle cellule T. Dei pazienti naïve al COVID-19, il 45% ha mostrato un'immunità inducibile a cellule T. La risposta in questi controlli sani non esposti con una risposta delle cellule T non era statisticamente significativamente diversa in grandezza dai pazienti convalescenti COVID-19 per nessuno degli antigeni stimolanti (valore p=0.271, 0,437, e 0,719 per le proteine ​​RBD, N e S1, rispettivamente).

Figura 1. Produzione di IFN-g dopo stimolazione del sangue intero di pazienti COVID-19 convalescenti e controlli sani non esposti con proteine ​​RBD, N o S1.

I risultati della stimolazione di pazienti convalescenti e controlli con, rispettivamente, la proteina RBD, N o S1 sono mostrati in Fig. 1A, B e C. In Fig. 1D, le risposte INF-g di ciascun paziente e ai tre gli antigeni sono raggruppati. I pazienti con infezione da COVID-19 confermata sono numerati da 1 a 15, di cui i pazienti 14 e 15 erano asintomatici. I soggetti di età compresa tra 16 e 33 anni sono pazienti naïve al COVID-19.

Dopo 24 ore di stimolazione, le concentrazioni di IFN-g nel plasma sono state determinate utilizzando un kit basato sul test dell'immunosorbente legato all'enzima IFN-g umano disponibile in commercio (Biolegend cat. No. 430,101). L'entità della stimolazione è stata espressa come densità ottica a 450 nm (OD450) per il sangue stimolato con l'antigene meno la OD450 per il sangue senza stimolazione dell'antigene. Una densità ottica di 1,0 corrispondeva a circa 400 pg/mL di IFN-g. La fitoemoagglutinina (PHA) è stata utilizzata come mitogeno a una concentrazione finale di 5 mg/mL nell'IGRA per valutare la qualità e la capacità di risposta del sangue. Tutti i pazienti ei controlli hanno mostrato una produzione massima della citochina con questo mitogeno con una densità ottica media (OD450) di 2,54 (SD=0.13), che rappresenta circa 1000 pg/mL di IFN-g. Non c'era alcuna differenza nel livello mediano di IFN-g nel sangue non stimolato di pazienti convalescenti e controlli sani (OD450=0.38, DS=0.14 rispetto a OD450=0.32. DS=0.16). Questi risultati non sono mostrati. In ciascun grafico è stata tracciata una linea orizzontale per rappresentare il valore limite per la stimolazione. Questo valore è stato determinato calcolando la media più due deviazioni standard della risposta di nove soggetti (pazienti 16, 18, 19, 22, 27-31) del gruppo di controllo con la più bassa produzione di INF-g dopo la stimolazione.

discussione e conclusioni

Utilizzando un'analisi del sangue intero facile da eseguire che valuta le risposte delle cellule T, abbiamo scoperto che la maggior parte dei pazienti convalescenti e una percentuale significativa di individui sani non esposti avevano una risposta delle cellule T specifica e forte determinata con la produzione di INF-g dopo la stimolazione con antigeni specifici SARS-CoV-2 (Figura 1). Diversi studi, tutti utilizzando il test ELISPOT, hanno riportato la presenza di una risposta delle cellule T nella maggior parte o in tutti i pazienti COVID-19 convalescenti (Braun et al., 2020, Grifono et al., 2020, LeBert et al. , 2020, Sekine et al., 2020, Moderbacher et al., 2020, Mateus et al., 2020, Peng et al., 2020).

Tuttavia, per quanto riguarda una risposta delle cellule T in controlli sani non esposti, sono stati riportati tassi di risposta tra il 28 e il 50% (Doshi, 2020, de Vries, 2020, Lipsitch et al., 2020, Sagar et al., 2020) e diversi gli studi non riportano alcuna risposta delle cellule T nei pazienti di controllo naïve al COVID-19 (de Vries, 2020, Moderbacher et al., 2020, Schwarzkopf et al., 2021). La maggior parte di questi studi è stata eseguita con il test ELISPOT, ma in Italia e negli Stati Uniti è stato utilizzato anche un IGRA per rilevare la risposta delle cellule T SARS-CoV-2 (Petrone et al., 2020, Murugesan et al ., 2020). In entrambi gli studi è stata rilevata una risposta specifica delle cellule T nei pazienti convalescenti; tuttavia, l'IGRA non ha rilevato una risposta INF-g in soggetti sani non esposti.

L'immunità preesistente delle cellule T a SARS-CoV-2 in soggetti naïve al COVID-19 è stata esaminata in diverse pubblicazioni (Altmann e Boyton, 2020, Dosho et al., 2020, de Vries, 2020, Sette e Crotty, 2020). Il motivo per cui una specifica risposta delle cellule T COVID-19 potrebbe essere rilevata in un soggetto sano non esposto rimane poco chiaro ed è oggetto di speculazione. La maggior parte degli studi ELISPOT con soggetti naïve al COVID-19 ha utilizzato campioni di sangue umano prelevati prima che il virus SARS-CoV-2 fosse scoperto nel 2019, quindi prima di qualsiasi possibilità di esposizione. Per questo motivo, questi studi ELISPOT hanno concluso che la risposta delle cellule T in soggetti sani non esposti deriva probabilmente da un precedente contatto con i coronavirus circolanti del "raffreddore comune" (Grifoni et al., 2020, Matheus et al., 2020) o da una precedente esposizione all'influenza e/o virus CMV (Mahajan et al., 2020) o altri antigeni virali o microbici (Tan et al., 2020). Il nostro studio ha utilizzato sangue prelevato durante la pandemia da volontari che hanno dichiarato di non avere contatti, erano sieronegativi per l'antigene COVID-19 RBD e non avevano mai mostrato alcun segno o sintomo di COVID-19.

Pertanto non possiamo escludere che la risposta delle cellule T in alcuni dei nostri controlli sani "naïve" al COVID-19 provenga da infezioni asintomatiche da virus SARS-CoV-2. I pazienti 14 e 15 del nostro studio ne sono un esempio. Queste persone sono state classificate come pazienti COVID-19 a causa di una RT-PCR positiva; tuttavia, erano asintomatici e non hanno sviluppato una risposta anticorpale contro la proteina RBD, ma entrambi hanno mostrato una forte risposta delle cellule T.

È possibile che, dopo la colonizzazione SARS-CoV-2 del rinofaringe, il sistema immunitario di questi due pazienti asintomatici abbia lasciato loro una risposta di sole cellule T di memoria e non siano stati rilevati anticorpi specifici SARS-CoV-2 indotto. Un'altra spiegazione è che la risposta delle cellule T proviene da una precedente infezione simile alla corona e la risposta immunitaria delle cellule T preesistente ha protetto questi due pazienti dallo sviluppo di un modello di malattia più invasivo. Le cellule T cross-reattive preesistenti potrebbero essere significative nello spiegare alcune delle differenze nei tassi di infezione o nella patologia (Le Bert et al., 2020, Sagar et al., 2020). Per quanto riguarda la coorte di controlli naïve, abbiamo escluso che questo gruppo contenga un numero considerevole di individui infetti da SARSCoV-2 con infezione asintomatica non rilevata, fondamentalmente perché tutti gli integrandi del gruppo di controllo sono IgG sieronegativi per l'antigene RBD.

Un altro motivo è che la prevalenza dell'infezione in Ecuador è relativamente bassa. Al momento di questo studio, nel settembre 2020, l'Ecuador aveva riportato circa 200000 casi confermati di COVID-19 (circa l'1,1% della popolazione). Naturalmente, l'effettiva prevalenza dell'infezione avrebbe potuto essere molte volte superiore, ma anche così, è improbabile che il 45% di questo gruppo di controllo sia stato infettato e quindi che stiamo osservando una risposta delle cellule T specifica per un SARS-CoV{ {9}} infezione.

In conclusione, il ritrovamento di un'alta percentuale di soggetti sani non esposti con immunità preesistente a Quito, Ecuador, aumenta l'aspettativa che una parte significativa della nostra popolazione possa avere cellule T reattive al SARS-CoV-2 perché di una precedente esposizione a influenza, virus CMV o comuni coronavirus che causano il raffreddore. Le indagini future dovrebbero mirare a determinare se la risposta immunitaria preesistente è protettiva e/o può superare una malattia COVID-19 più grave o se contribuisce a una guarigione più rapida.

Importanza e limiti di questo studio

Il nostro studio ha dimostrato che il COVID-19 IGRA è un nuovo strumento utile e sensibile in grado di valutare l'esposizione ai coronavirus o la reattività incrociata a virus simili determinando il rilascio di IFN-g dopo la stimolazione con antigeni specifici del virus. La tecnica è semplice, relativamente economica e può essere utilizzata in un laboratorio clinico. Questo non è certamente il caso del saggio ELISPOT. Inoltre, il test IGRA può essere facilmente ampliato per studi e indagini basati sulla popolazione in cui è richiesto un numero elevato di pazienti. Insieme alla sierologia, l'IGRA può essere utilizzato per vagliare le risposte anticorpali e delle cellule T dei singoli pazienti per comprendere meglio l'immunità a livello di popolazione e determinare l'immunità preesistente negli individui sieronegativi.

Una limitazione importante del nostro studio è che il campione di studio non è rappresentativo della popolazione. Non sono stati utilizzati metodi statistici per predeterminare la dimensione del campione. Inoltre, il nostro saggio non ha distinto tra la produzione di IFN-g di cellule CD4 plus o CD8 plus, ma può essere considerata la stimolazione con peptidi definiti CD8( plus ) e CD4( plus ) (Grifoni et al., 2020, Peng et al. , 2020) ed è stato utilizzato negli IGRA descritti in Petrone et al., 2020 e Murugesan et al., 2020). Inoltre, l'induzione di altre citochine può essere misurata con questo IGRA (Petrone et al., 2020). Allo stesso modo, l'IGRA può essere impiegato per il follow-up della vaccinazione per determinare lo sviluppo della risposta delle cellule T negli individui vaccinati o può essere utilizzato per determinare se la presenza di cellule T della memoria cross-reattive è associata all'immunità protettiva e può diminuire le manifestazioni della malattia da infezione da SARS-CoV-2 (Sagar et al., 2020).

Approvazione etica e consenso alla partecipazione

Il sangue è stato raccolto dopo il consenso scritto informato. Il Comitato Etico del Ministero della Salute dell'Ecuador ha approvato il protocollo di studio 004-2020.

Conflitto d'interessi

Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

Contributi d'autore

Progettazione dello studio; JHW e GE; Raccolta dati ed esperimenti di laboratorio: GE, AG, JC, AMR e MMV; Analisi dei dati; JHW, GE e ET; Scrittura: JHW, GE e ET.

Ringraziamenti

Esprimiamo la nostra gratitudine a tutti i donatori e al personale sanitario coinvolto in questo lavoro, in particolare Sandra Vivero e Sandra Fonseca, per l'assistenza nella raccolta dei campioni. Questo studio è stato sostenuto da un fondo di ricerca dell'Universidad de las Américas. Il Sustainable Sciences Institute, San Francisco, California, USA, e la Fondazione "Por Todos" in Ecuador hanno fornito la proteina RBD e l'ELISA "in-house". Grazie a Howard E. Takiff e Flor Pujol (IVIC, Venezuela), Paulina E. Andrade (USFQ, Ecuador) e Lilly Verhagen (UMC, Paesi Bassi) per le loro proficue discussioni.

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