L'AKT attivato dal precondizionamento controlla la tolleranza neuronale all'ischemia attraverso la via MDM2-p53Ⅱ

3. Discussione

I nostri risultati rivelano che l'attivazione mediata da IPC della via di segnalazione PI3K/AKT innesca l'IT neuronale controllando il complesso MDM2-p53 nei neuroni corticali primari. Per prima cosa abbiamo confermato l'efficienza del precondizionamento in termini di neuroprotezione [33,39-41] utilizzando un modello sperimentale IPC convalidato.

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Abbiamo scoperto che l'IPC sperimentale indotto da una breve (20 min) privazione di ossigeno e glucosio (OGD) seguita da 2 ore di riossigenazione ha portato a neuroprotezione, come dimostrato dalla prevenzione sia dell'apoptosi neuronale che dell'attivazione della caspasi-3 indotta da un prolungato OGD (90 min) seguito da 4 h di riossigenazione (OGD/R). Mostriamo che l'IPC riduce l'attivazione della caspasi -3 nei neuroni corticali, che è correlata a una minore apoptosi dopo un successivo e più grave insulto ischemico.

L'equilibrio tra segnali pro e antiapoptotici è fondamentale per garantire la sopravvivenza neuronale dopo l'ischemia [3,33,38,42-44]. Sebbene la rilevanza di tali eventi sia stata dimostrata nei modelli di ictus in vivo sia emorragico che ischemico [43,45], i meccanismi che regolano queste vie di segnalazione non sono ancora completamente compresi nel contesto della tolleranza ischemica. Il ruolo dell'AKT antiapoptotico e dei suoi percorsi correlati è stato ampiamente studiato nelle cellule tumorali [46,47] e nel tessuto cerebrale [38,48]; tuttavia, finora, il ruolo della via di segnalazione AKT/MDM2-p53 nella tolleranza neuronale mediata da IPC contro il danno ischemico rimane sfuggente.

Qui, abbiamo scoperto che l'attivazione della via di segnalazione PI3K/AKT causata dall'IPC promuove la fosforilazione di MDM2 a Ser166, che innesca la sua traslocazione nucleare e la stabilizzazione proteica, prevenendo l'apoptosi indotta da p53- tramite l'attivazione della caspasi-3 dopo l'ischemia. L'attivazione di AKT attraverso la fosforilazione promuove la sopravvivenza neuronale [24,49] e può contribuire all'induzione di IT [25,50]. I nostri risultati mostrano che l'abbondanza relativa della proteina AKT è invariata sotto stimoli ischemici o di precondizionamento. È interessante notare che abbiamo scoperto che la fosforilazione precoce mediata da PI3K di AKT a Ser473 previene la stabilizzazione di p53 indotta dall'ischemia nei neuroni precondizionati.

L'effetto non era dovuto a modifiche nei livelli di mRNA di p53 [33,34,44] ma a livelli ridotti di proteina p53 dovuti all'IPC prima dell'OGD/R. Poiché MDM2 è il principale regolatore della stabilizzazione di p53 ed è anche un bersaglio diretto di AKT, i nostri risultati sottolineano il ruolo della via di segnalazione AKT/MDM2-p53 nella tolleranza neuronale all'ischemia. L'mRNA di MDM2 aumenta rapidamente dopo l'OGD [34], ma l'attività di MDM2 è principalmente controllata da modifiche post-traduzionali, in particolare la fosforilazione [51]. In buon accordo con questo, abbiamo scoperto che una volta attivato dalla fosforilazione dopo IPC, AKT, a sua volta, fosforila MDM2 al residuo Ser166, che si trova vicino al segnale di localizzazione nucleare [52], e questo effetto viene mantenuto dopo la lesione OGD/R.

I nostri risultati mostrano che la fosforilazione di MDM2 a Ser166 è sufficiente per esercitare l'effetto neuroprotettivo mediato da IPC tramite la destabilizzazione di p53. Pertanto, qui, abbiamo identificato un'attivazione dipendente dal tempo della via AKT / MDM2-p53 dopo la lesione ischemica e, in effetti, dimostriamo che l'AKT attivato dall'IPC ha innescato la traslocazione nucleare dell'MDM2 ectopico, nonché la stabilizzazione della proteina endogena.

Inoltre, AKT rimane attivo all'interno del nucleo, dove PI3K potrebbe anche migrare in risposta allo stress ossidativo e quindi spiegare la fosforilazione di AKT [53]. L'inibizione della fosforilazione mediata da PI3K di AKT o AKT knockdown promuove la ritenzione della proteina MDM2 nel citoplasma e previene la fosforilazione Ser166 di MDM2, così come la neuroprotezione mediata da IPC contro l'apoptosi neuronale indotta dall'ischemia. Al contrario, abbiamo dimostrato che l'AKT attivo si lega alla proteina nucleare MDM2.

Di conseguenza, l'AKT attivo promuove sia la fosforilazione di MDM2 che la sua stabilizzazione nucleare, che contribuiscono alla neuroprotezione mediata da IPC. I nostri risultati rivelano che la neuroprotezione promossa da IPC dipendeva dall'attivazione di AKT mediata da PI3K, che fosforilava MDM2 a Ser166, promuovendo l'accumulo nucleare di MDM2 dopo un insulto ischemico.

Di conseguenza, l'inibizione di PI3K/AKT da parte di wortmannin o deplezione di AKT da parte di siRNA ha abolito la neuroprotezione promossa da IPC, portando alla stabilizzazione di p53 e alla successiva apoptosi neuronale dopo l'ischemia. Quindi, i nostri risultati aiutano a chiarire il ruolo essenziale dell'attivazione IPC-dipendente della via AKT-MDM2 nella sopravvivenza neuronale contro il danno ischemico.

La proteina p53 è coinvolta nel controllo della morte/sopravvivenza neuronale determinando la prognosi nei pazienti con ictus [34,42,54], così come nei pazienti con TIA [3]. La stabilizzazione di P53 compromette la neuroprotezione mediata dal precondizionamento al danno da ischemia/riperfusione [33]. L'interazione MDM2-p53 sarà, quindi, fondamentale per la sopravvivenza neuronale in questo contesto [34] e per la tolleranza mediata da IPC contro il danno ischemico [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G nel promotore MDM2 determina l'espressione di MDM2 e, a sua volta, modula il recupero dei pazienti affetti da ictus [34].

Inoltre, abbiamo osservato che un SNP del gene Tp53 (rs1042522) modula la stabilizzazione della p53 mitocondriale e la tolleranza neuronale all'ischemia, predicendo il recupero funzionale dei pazienti che soffrono di un TIA prima dell'ictus [3]. Pertanto, il controllo delle vie apoptotiche di p53 sarà essenziale per garantire l'effetto neuroprotettivo dell'IPC.

Questi risultati forniscono un approccio traslazionale allo studio che potrebbe essere implementato in futuro a beneficio dei pazienti e pongono la via di segnalazione PI3K/AKT-MDM2-p53 come un obiettivo essenziale per le strategie IT promosse dal precondizionamento nell'ictus ischemico. In sintesi, dimostriamo che la via di segnalazione PI3K/AKT potenziata dall'IPC promuove la fosforilazione di MDM2 a Ser166, portando alla traslocazione nucleare di MDM2 e alla sua stabilizzazione, che innesca l'IT neuronale promuovendo la destabilizzazione di p53 e la successiva inattivazione della morte apoptotica indotta dopo l'insulto ischemico.

I nostri risultati evidenziano i potenziali benefici dell'attivazione precoce dell'AKT nella tolleranza neuronale mediata da IPC, che regola la via apoptotica MDM2-p53 sotto danno ischemico. Questi risultati evidenziano un'opportunità per comprendere i meccanismi che regolano la via di segnalazione neuronale AKT-MDM2-p53 per sviluppare nuove strategie neuroprotettive per i disturbi correlati all'IT.

4. Materiali e Metodi

4.1. Colture primarie di neuroni corticali

Le colture neuronali sono state preparate da cortecce di embrioni di topo C57Bl/6J o p53-null (Tp53−/−, B6.129S2, The Jackson Laboratory) (14.5E). I neuroni sono stati seminati a 1,8 × 105 cellule/cm2 in un terreno neurobasale integrato con il 2% di B27 e 2 mM di glutammina (Invitrogen, Madrid, Spagna) e incubati a 37◦C in un'atmosfera umidificata contenente il 5% di CO2- [ 55].

4.2. Modelli di privazione di ossigeno e glucosio e precondizionamento

Dopo 9–1{{10}} giorni in vitro (DIV), i neuroni sono stati esposti alla privazione di ossigeno e glucosio (OGD) incubando le cellule a 37 ◦C per 90 min in un incubatore dotato di una camera di equilibrio e continuamente gassato con il 95% di N2/5% di CO2. Il mezzo di incubazione (soluzione di Hanks tamponata senza glucosio: 5,26 mM KCl, 0,43 mM KH2PO4, 132,4 mM NaCl, 4,09 mM NaHCO3, 0,33 mM Na2HPO4, 2 mM CaCl2 e 20 mM HEPES, pH 7,4) è stato precedentemente gassato con il 95% di N2 /5% CO2 per 30 min. In queste condizioni, le concentrazioni di ossigeno nel mezzo di incubazione erano di 6,7 ± 0,5 µM misurate con un elettrodo per ossigeno di tipo Clark [56,57].

Quando indicato, i neuroni sono stati esposti al precondizionamento ischemico (IPC; breve OGD per 20 min seguito da 2 ore di riossigenazione) prima della successiva ischemia prolungata (OGD, 90 min) e 4 ore di riossigenazione (IPC più OGD/R) (Figura S1B ). Parallelamente, i neuroni sono stati incubati in normossia (Nx) a 37°C in un'atmosfera umidificata al 95% di aria/5% di CO2 o precondizionamento ischemico (IPC). Quando indicato, i neuroni sono stati incubati 30 minuti prima dell'IPC nella soluzione tamponata di Hanks (pH 7,4), in assenza o presenza di wortmannin (100 nmol/L), come descritto in precedenza [19].

4.3. Trasfezioni cellulari

I neuroni (8 DIV) o le cellule T HEK-293 sono stati trasfettati con un vettore plasmidico che esprimeva Mdm2 marcato con YFP dal promotore umano MDM2. MDM2p/Mdm2-YFP è stato un regalo di Uri Alon e Galit Lahav (Addgene plasmid # 53962, Watertown, MA, USA) [58]. Quando richiesto, un vettore vuoto (pYFP) è stato utilizzato come controllo nelle stesse condizioni. La trasfezione plasmidica è stata eseguita utilizzando Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA), secondo le istruzioni del produttore. Le cellule sono state trasfettate con 1,5 µg/µL dei vettori plasmidici e utilizzate dopo 24 ore.

Il knockdown dell'AKT in 6 neuroni DIV è stato ottenuto mediante trasfezione con piccoli ribonucleotidi a doppio filamento interferenti (siRNA). Le sequenze mirate erano le seguenti: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisenso: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (topo, s62216, corrispondente ai nucleotidi 1006–1025, numero di accesso GenBank NM_009652) [59]. Come controllo negativo, abbiamo utilizzato Silencer™ Select Negative Control No. 1 siRNA (siControl). Tutti gli siRNA sono stati acquistati da Ambion®, Invitrogen® e Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Germania). Secondo il grado di knockdown proteico, l'efficienza della trasfezione di siRNA è stata stimata al 70-80% a 3 giorni dopo la trasfezione. Per gli esperimenti di silenziamento, i neuroni sono stati trasfettati con siRNA (10 nM) utilizzando Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen), seguendo le istruzioni del produttore. I neuroni sono stati ulteriormente incubati in un mezzo neurobasale per 72 ore prima del loro utilizzo.

4.4. Rilevamento citometrico a flusso della morte cellulare apoptotica

I neuroni sono stati accuratamente staccati dalle piastre utilizzando sale tetrasodico EDTA 1 mM in PBS (pH 7,4) e sono stati colorati con annessina V/APC e 7-AAD, eseguita esattamente come precedentemente descritto [55].

4.5. Analisi dell'attività della caspasi-3

L'attività della caspasi-3 è stata valutata nei lisati cellulari [33] e secondo le istruzioni del produttore utilizzando il kit di analisi fluorimetrica CASP3F di SIGMA e letta all'emissione a una lunghezza d'onda di 405 nm. Il metodo si basa sul rilascio della porzione fluorescente 7-ammino4-metil cumarina (AMC). La concentrazione di AMC viene calcolata utilizzando uno standard AMC.

4.6. Immunoblot e saggio di co-immunoprecipitazione

I neuroni sono stati lisati in tampone contenente 1% di SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12,5 mM Na2HPO4 e 1% Triton X-100 (NP40: 1% NP40, EDTA diK plus 5 mM, Tris pH{{13 }} mM, NaCl 135 mM e 10 percento di glicerolo) integrato con inibitori della fosfatasi (1 mM Na3VO4 e 50 mM NaF) e inibitori della proteasi (100 mM fenilmetilsulfonil fluoruro, 50 µg/mL anti-papaina, 50 µg/mL pepstatina, 50 µg/mL di amastatina, 50 µg/mL di leupeptina, 50 µg/mL di bestatina e 50 µg/mL di inibitore della tripsina di soia), conservate in ghiaccio per 30 min e bollite per 5 min. Aliquote di estratti lisati sono state sottoposte a gel di poliacrilammide SDS (MiniProtean®, Bio-Rad) e macchiate con anticorpi durante la notte a 4°C. Gli anticorpi utilizzati erano anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-caspasi scissa -3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; rileva anche YFP) (Abcam, Cambridge, UK), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germania) e antiGAPDH (Ambion, Cambridge, Regno Unito) durante la notte a 4 ◦C. Dopo l'incubazione con IgG anti-coniglio di capra coniugata con perossidasi di rafano (Pierce, Thermo Scientific) o IgG anti-topo di capra (Bio-Rad), le membrane sono state immediatamente incubate con SuperSignal West Dura (Pierce) a chemiluminescenza potenziata per 5 minuti prima dell'esposizione a Kodak Pellicola XAR-5 per 1-5 minuti e gli autoradiogrammi sono stati scansionati. Le intensità di banda sono state quantificate utilizzando il software ImageJ 1.48v, come descritto in precedenza [60].

Per il saggio di co-immunoprecipitazione, i neuroni sono stati lisati in tampone ghiacciato contenente 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP -40) ​​integrato con gli inibitori della fosfatasi sopra descritti. Dopo aver eliminato i detriti mediante centrifugazione, i lisati neuronali (100 mg) sono stati incubati con 1 mg di anticorpo per 24 ore a 4 °C, seguiti dall'aggiunta di 10 mL di proteina A-agarosio (GE Healthcare Life Sciences) per 2 ore a 4 ◦C. Gli immunoprecipitati sono stati ampiamente lavati con tampone di lisi e risolti mediante SDS-PAGE e immunoblottati con gli anticorpi indicati [61]. Le relative abbondanze proteiche sono mostrate nella Figura S1. Le macchie complete e le scansioni del gel sono incluse nella Figura S3.

4.7. Immunocitochimica e analisi delle immagini

I neuroni sono stati cresciuti su coprioggetti di vetro e fissati con paraformaldeide al 4% (p/v, in PBS) per 30 minuti e immunocolorati con coniglio anti-phosphoAKT (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, USA), mouse anti-MDM2 (2A10, ab-16895), topo anti-MAP2 (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [55], topo anti-p53 (1:200; 554157, BD Pharmingen , San Diego, CA, USA) e anti-GFP (1:1000; ab290; anche convalidato per rilevare YFP). L'immunolamarcatura è stata rilevata utilizzando anticorpi secondari anti-coniglio IgG-Cy3 o anti-topo IgG-Cy2 (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, Regno Unito).

I nuclei sono stati colorati con 40,6-diamidino-2 fenilindolo (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). I coprioggetto sono stati lavati, montati nel reagente antisbiadimento della luce SlowFade (Invitrogen) su vetrini ed esaminati utilizzando un microscopio (microscopio invertito Nikon Eclipse Ti-E, (NY, USA) dotato di obiettivo 40 ×, un illuminatore a fibra precentrato Nikon Intensilight C-HGFI e una fotocamera digitale con dispositivo ad accoppiamento di carica in bianco e nero Hamamatsu ORCAER o un microscopio confocale laser a scansione ("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tokyo, Giappone) con tre laser 405, 491 e 561 nm, dotato di obiettivo a immersione in olio 40 ×, 63 × e 100 × PL Apo per imaging ad alta risoluzione e fotocamera digitale del dispositivo Evolve Photometrics.

Tutte le impostazioni del microscopio sono state impostate per raccogliere immagini fluorescenti al di sotto della saturazione e sono state mantenute costanti per tutte le immagini scattate nell'esperimento. Le immagini sono state analizzate con il software ImageJ 1.48v (National Institutes of Health). La percentuale di neuroni p(Ser473)AKT plus e p53 plus e la quantificazione dell'intensità massima di fluorescenza proteica di p(Ser473)AKT e p53 sono mostrate nella Figura S2A. Nei neuroni trasfettati con MDM2-GFP, la distribuzione nucleocitoplasmatica di MDM2-GFP è stata calcolata come rapporto tra la fluorescenza media nucleare e la fluorescenza media citoplasmatica dell'MDM2 endogeno, misurata in 24 neuroni (sei neuroni per condizione in quattro diverse colture neuronali) (Figura S2B) [62].

Per quantificare l'intensità massima della fluorescenza nucleare della colorazione MDM2 endogena e pSer473AKT, sono stati misurati 40 neuroni (10 neuroni per condizione in quattro diverse culture) (Figura S2C), come descritto in precedenza [44]. Nei profili di intensità della sezione trasversale rappresentativi mostrati nella Figura 5B, la percentuale di p(Ser473)AKT e MDM2 indicata sotto ciascuna condizione è stata quantificata come fluorescenza media nucleare. In tutti i casi, i nuclei sono stati identificati mediante colorazione DAPI. L'intensità massima della fluorescenza nucleare MDM2 nei neuroni trattati con wortmannin o siAkt è mostrata nella Figura S2D.

4.8. Analisi statistica

I risultati sperimentali sono stati valutati mediante analisi della varianza unidirezionale, seguita dal test post hoc di Bonferroni, utilizzato per confrontare i valori tra più gruppi. I risultati sono espressi come medie ± SEM. Il test t di Student è stato utilizzato per il confronto tra due gruppi di valori. In tutti i casi, p < 0.05 è stato considerato significativo (* p < 0,05 contro Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

In che modo Cistanche protegge i neuroni?

Ci sono alcune prove che suggeriscono che Cistanche possa proteggere i neuroni riducendo l'apoptosi (morte cellulare programmata) e promuovendo la sopravvivenza neuronale. L'apoptosi è un processo naturale che si verifica nel corpo per rimuovere le cellule danneggiate o indesiderate, ma può essere dannoso quando si verifica in modo eccessivo o inappropriato. È stato scoperto che Cistanche inibisce l'apoptosi in studi di laboratorio e questo effetto può aiutare a proteggere i neuroni dai danni.

Inoltre, Cistanche contiene diversi composti bioattivi che hanno dimostrato di avere effetti neuroprotettivi. Ad esempio, contiene echinacoside, che ha dimostrato di proteggere i neuroni dallo stress ossidativo e dall'infiammazione. Contiene anche acteoside, che ha proprietà antinfiammatorie e antiossidanti.

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