Isolamento preparatorio e purificazione di quattro composti da Cstanches Deserticola YC Ma mediante cromatografia in controcorrente ad alta velocità

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Astratto:

Dopo una fase di arricchimento costituente su una colonna di gel di silice, quattroglicosidi feniletanoidisono stati isolati con successo daCstanches deserticolae purificato mediante cromatografia preparativa in controcorrente ad alta velocità (HSCCC) con un sistema solvente a due fasi composto da acetato di etile-n-butanolo-etanolo-acqua (40:6:6:50, v/v /v/v). Un totale di 30,9 mg di acteoside, 13,0 mg di isoacteoside, 12,5 mg di siringalide A 3'- -L-ramnopiranoside e 7,2 mg di 2'-acetilacteoside con una purezza superiore al 95%, come determinato da HPLC-ELSD, sono stati ottenuto in una separazione in un solo passaggio da 297 mg diEstratto di Cistanche deserticola, rispettivamente. Le loro strutture sono state identificate da HR-MS, 1H-NMR e 13C-NMR.

Parole chiave: cromatografia in controcorrente ad alta velocità;Cstanches deserticola YC Ma;glicosidi feniletanoidi; acteoside; isoacteoside; siringalide A 3'- -L-ramnopiranoside; 2'-acetilatteoside.

introduzione

Cstanches deserticolaYC Ma, una specie diCistanceappartenente alla famiglia delle Orobanchaceae, è una nota Medicina Tradizionale Cinese per il trattamento di insufficienza renale, infertilità femminile, leucorrea morbosa, neuraprassia e stipsi senile [1]. È una pianta parassita ampiamente distribuita nel nord-ovest della Cina. Finora, diversi composti, inclusi glicosidi feniletanoidi (PhG), iridoidi e lignani sono stati isolati da questa specie [2]. Alcuni dei PhG sono stati segnalati per possedere attività antiossidanti, epatoprotettive e neuroprotettive [3-6]. Tuttavia, la procedura di isolamento e purificazione dei PhG è difficile e richiede tempo. Inoltre, i metodi cromatografici multipli classici non solo utilizzano un gran numero di solventi organici, ma consentono anche un minore recupero del campione. La cromatografia in controcorrente ad alta velocità (HSCCC), una tecnica cromatografica a partizione liquido-liquido senza supporto, offre un eccellente recupero del campione rispetto ad alcuni metodi convenzionali ed è stata ampiamente utilizzata per la separazione e la purificazione di vari prodotti naturali [7–9] . Sebbene diversi PhG siano stati purificati daCistancegenus e altri di HSCCC [10–14], nessun documento ha riportato la purificazione di acteoside, isoacteoside, syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside e 2'-acetylacteoside in un sistema bifasico.

In questo documento, riportiamo un metodo semplice per la separazione e la purificazione di quattro PhG da C. deserticola. Infine, in un solo passaggio sono stati ottenuti 30,9 mg di acteoside, 13,0 mg di isoacteoside, 12,5 mg di siringalide A 3'- -L-ramnopiranoside e 7,2 mg di 2'-acetilacteoside separazione da 297 mg di frazione con purezza rispettivamente del 99 percento, 95 percento, 99 percento e 98 percento. Le loro strutture sono state caratterizzate sulla base di dati spettrali 1H- e 13C-NMR e spettri HR-MS. Le strutture dei quattro PhG identificate in questa indagine sono mostrate nella Figura 1.

Risultati e discussione

Analisi HPLC dell'estratto grezzo

La frazione arricchita costituente dell'estratto n-butanoico di C. deserticola è stata analizzata mediante HPLC-UV. La colonna utilizzata era una Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, città, stato abbreviato, USA), la fase mobile era metanolo-acqua (30:70, v/v). La portata era di 1 ml/min. La lunghezza d'onda del rivelatore è stata fissata a 254 nm. Il cromatogramma HPLC è mostrato nella Figura 2. I picchi da 1 a 4 corrispondono ad acteoside (1), isoacteoside (2), siringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside (3) e 2'-acetylacteoside (4), rispettivamente.

Selezione del sistema solvente bifase

Il successo della separazione mediante HSCCC dipende in gran parte dalla selezione di un adatto sistema solvente a due fasi, il sistema solvente a due fasi è stato selezionato in base ai valori del coefficiente di ripartizione (K) di ciascun componente target e un intervallo ottimale di K dovrebbe essere compreso tra {{ 2}}.5 a 2.

Nell'esperimento, i valori K per i componenti target di diversi sistemi di solventi a due fasi sono mostrati nella Tabella 1 (sebbene un po' più alti per il picco 4, i risultati si sono dimostrati accettabili). Tra questi, acetato di etile–n-butanolo–etanolo-acqua (40:6:6:50, v/v/v/v) ha fornito coefficienti di partizione adeguati per i composti target. Alla fine, il sistema solvente composto da acetato di etile–n-butanolo–etanolo-acqua (40:6:6:50, v/v/v/v) è stato utilizzato per isolare e purificare quattro composti di C. deserticola, come mostrato in Figura 3. Come mostrato nella Figura 2, l'analisi HPLC di ciascuna frazione HSCCC ha rivelato che quattro PhG puri (acteoside, 99%; isoacteoside, 95%; syringalide A 3′- -L-rhamnopyranoside 99% e 2′- acetilacteoside 98 percento) potrebbe essere ottenuto dalla frazione grezza.

Sperimentale

Apparecchio

L'apparecchiatura HSCCC impiegata nel presente studio era un sistema di cromatografia in controcorrente ad alta velocità TBE-300B (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, Cina) con tre colonne di separazione della bobina multistrato preparativa collegate in serie (diametro del tubo=2,6 mm, volume totale=300 ml) e un ciclo di campionamento da 20 ml. Il raggio di rivoluzione o la distanza tra l'asse del supporto e la centraleasse della centrifuga (l'asse della centrifuga (R) era di 5 cm e il valore variava da 0.5 al terminale interno a 0.8 al terminale esterno (=r/R, dove r è la distanza dalla bobina all'albero del supporto). Per controllare la temperatura nell'esperimento è stato utilizzato un attrezzo di circolazione a temperatura costante HX 105 (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Pechino, Cina). Il sistema HSCCC era dotato di una pompa a portata costante modello TBP-5002, un rilevatore UV modello TBP-2000 funzionante a 254 nm e una workstation modello V4.0 (Jinda Biochemistry Instrument Company, Shanghai, Cina).

L'apparecchiatura per cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) utilizzata era un sistema Agilent 1200 costituito da una pompa binaria G1312A, un campionatore automatico G1329A, un rivelatore a lunghezza d'onda variabile (VWD) G1314A, un compartimento colonna termostatato G1316A, un degasatore G1379B e LC Agilent postazione di lavoro. Per il rilevamento delle purezze è stato utilizzato un Alltech 3300 ELSD. Per l'identificazione strutturale dei composti sono stati utilizzati gli spettrometri Agilent 6520 Q-TOF e Bruker AVANCE III 500-NMR. Gli spettri 1H e 13C-NMR (rispettivamente a 500 e 125 MHz) sono stati misurati a temperatura ambiente (22 gradi/295,1 K).

Reagenti e materiali

Acetato di etile, n-butanolo ed etanolo erano gradi analitici e il metanolo era di grado HPLC. Tutti i solventi sono stati acquistati da Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, Cina). Per tutte le soluzioni e diluizioni è stata utilizzata acqua Milli-Q (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA). Il rizoma di C. deserticola è stato raccolto dalla Provincia della Mongolia Interna, Repubblica Popolare Cinese, nel giugno 2009. La pianta è stata identificata dal Prof. Lijuan Zhang e un esemplare voucher (n. 20091001) è stato depositato nel nostro laboratorio.

Preparazione del campione grezzo

Gambi carnosi essiccati all'aria in polvere di C. deserticola (1 Kg) sono stati fatti rifluire due volte con etanolo acquoso (8 L, 60 percento v/v) per 2 ore ogni volta. L'estratto è stato evaporato a pressione ridotta e ad una temperatura di 60 gradi fino a totale evaporazione dell'etanolo. Il residuo è stato sospeso in acqua ed estratto successivamente tre volte con cloroformio, acetato di etile e n-butanolo, ottenendo 5,16 g di estratto n-butanoico dopo evaporazione a secchezza a pressione ridotta. L'estratto n-butanoico è stato quindi separato su una colonna di gel di silice (200–300 mesh) utilizzando un'eluizione a gradiente progressivo (CHCl3–MeOH, 10:1→1:1) per ottenere otto frazioni. La frazione 6 (297 mg) è stata utilizzata per l'ulteriore isolamento e separazione dell'HSCCC.

Selezione dei sistemi a solvente a due fasi

I sistemi a solvente a due fasi sono stati selezionati in base al coefficiente di partizione (K) dei componenti target nella frazione di C. deserticola. I valori di K sono stati determinati mediante analisi LC come segue: una quantità adeguata di polvere di estratto grezzo (frazione 6) è stata disciolta nella fase inferiore del sistema solvente e analizzata mediante HPLC. Le aree dei picchi sono state registrate come A1. Quindi un volume uguale della fase superiore è stato aggiunto alla soluzione e miscelato accuratamente per raggiungere l'equilibrio di partizione. La fase inferiore è stata quindi nuovamente analizzata mediante HPLC. Le ultime aree di picco sono state registrate come A2. I valori K sono stati calcolati secondo la seguente equazione: K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

Preparazione del sistema solvente bifase e della soluzione campione

Nel presente studio, per la separazione dell'HSCCC è stato utilizzato il sistema solvente a due fasi composto da acetato di etile–n-butanolo–etanolo-acqua (40:6:6:50, v/v/v/v). Ciascun solvente è stato aggiunto ad un imbuto separatore e completamente equilibrato a temperatura ambiente. La fase superiore e la fase inferiore sono state separate e degasate mediante sonicazione per 30 minuti poco prima dell'uso. La soluzione campione è stata preparata sciogliendo 297 mg di Frazione 6 in 15 ml della fase inferiore di acetato di etile –n-butanolo–etanolo-acqua (40:6:6:50, v/v/v/v).

Procedura di separazione HSCCC

HSCCC è stato eseguito come segue. La colonna a spirale multistrato è stata prima riempita con la fase stazionaria organica superiore. La fase mobile acquosa inferiore è stata quindi pompata nell'estremità di testa della colonna a una portata di 1,5 mL/min e, allo stesso tempo, l'apparato HSCCC è stato fatto funzionare a una velocità di rotazione di 900 giri/min. Dopo che è stato stabilito l'equilibrio idrodinamico, come indicato da una fase mobile limpida che eluisce all'uscita di coda (circa due ore dopo), è stata iniettata attraverso la valvola di iniezione una soluzione campione da 15 mL contenente 297 mg dell'estratto grezzo (frazione 6). L'effluente della colonna è stato continuamente monitorato a 254 nm. Quattro frazioni di picco sono state raccolte secondo il cromatogramma e quindi evaporate a pressione ridotta. La temperatura dell'apparecchio è stata fissata a 25 gradi.

Analisi HPLC e identificazione delle frazioni di picco HSCCC

Le frazioni di picco di HSCCC sono state analizzate mediante HPLC-ELSD. La colonna utilizzata era un Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm), la fase mobile era metanolo-acqua (30:70, v/v). La portata era di 1 ml/min. ELSD è stato utilizzato nelle seguenti condizioni: temperatura 45 gradi, gas 1,6 l/min. L'identificazione strutturale delle quattro frazioni di picco HSCCC è stata effettuata mediante spettroscopia HR-ESI-MS, 1H e 13C-NMR.

L'identificazione strutturale

Frazione I: HR-ESI-MS osservato a m/z 623.2001 (M-H)-, calcolato per C29H35O15, 623.1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 di ramnosio), 2,79 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH 2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 di glucosio), 5,18 (1H, d, J=1 Hz, H{34} } di ramnosio), 6,27 (1H, re, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, re, J=15,5 Hz, Ar -CH=CH-), 6,5–7,1 (6H, aromatico H).13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C{{65} }), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,6 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf-2), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf{{ 98}}), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 114,8 (Caf- ), 148,1 (Caf- ), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc{{116} }), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha{{131} }), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha{{146} }). Rispetto ai dati forniti in letteratura [17], la frazione I corrispondeva ad acteoside.

Frazione II: HR-ESI-MS osservato a m/z 623.1987 (M-H)-, calcolato per C29H35O15, 623.1981. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,25 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 di ramnosio), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 di glucosio), 5,17 (1H, d, J {{ 33}} Hz, H-1 di ramnosio), 6,28 (1H, re, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, re, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, H aromatica). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,7 (C- ), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89 }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf- ), 115,0 (Caf- ), 147,3 (Caf- ), 104,5 (Gl-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). I dati spettrali 1H-NMR e 13C-NMR erano in accordo con quelli dell'isoacteoside come riportato in letteratura [18].

Frazione III: HR-ESI-MS osservato a m/z 6{{108}}7.2032 (M−H)−, calcolato per C29H35O14, 607.2032. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 di ramnosio), 2,84 (2H, t, J=7,5 Hz, Ar-CH 2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 di glucosio), 5,19 (1H, d, J=1,5 Hz, H{{ 35}} di ramnosio), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH= CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH =CH-), 6,6–7,1 (7H, aromatico H). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C- ), 36,4 (C- ), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88 }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 115,4 (Caf- ), 148,0 (Caf- ), 104,3 (Gl-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). Secondo la letteratura [18], la frazione III corrispondeva alla siringalide A 3'- -L-ramnopiranoside.

Frazione IV: HR-ESI-MS osservato a m/z 665,21{{20}} (M-H)-, calcolato per C31H37O16, 665,2087. 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ ppm: 1,09 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 di ramnosio), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J { {25}},5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H{33}} di glucosio), 4,90 (1H, d, J { {37}} Hz, H-1 di ramnosio), 6,29 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d, J=15,5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, H aromatica). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ ppm: 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4(C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C- ), 36,4 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93 }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf- ), 114,7 (Caf- ), 148,2 (Caf- ), 101,8 (Gl-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). I dati spettrali 1H-NMR e 13C-NMR erano in accordo con quelli del 2'-acetilacteoside [17].

Conclusioni

Un metodo HSCCC per la separazione preparativa e la purificazione di acteoside, isoacteoside, siringalide A 3'- -L-ramnopiranoside e 2'-acetilacteoside daCistanche deserticola YC Mafu fondato. Il presente studio indica che l'HSCCC è una tecnica molto potente per la separazione preparativa e la purificazione dei componenti bioattivi dai materiali vegetali. Inoltre, i composti possono essere isolati su scala sufficientemente ampia con purezza elevata e possono quindi essere utilizzati come sostanze di riferimento per studi cromatografici o di bioattività. Il metodo è una tecnica fattibile, economica ed efficiente per un rapido isolamento preparativo di complicati prodotti naturali.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University (PCSIRT), Project of International Cooperation Plan del Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2008DFB30070) e Scientific Program of Left Banner of Alashan ({{2 }}).

Riferimenti

1. Commissione farmacopea cinese. Farmacopea della Repubblica Popolare Cinese; People's Medical Publishing House: Pechino, Cina, 2010; Volume 1, pag. 126.

2. Jiang, Y.; Tu, PF Analisi dei costituenti chimici nelle specie Cistanche. J. Cromatogr. 2009, 1216, 1970–1979.

3. Morikawa, T.; Pan, Y.; Ninomiya, K.; Imura, K.; Matsuda, H.; Yoshikawa, M.; Yuan, D.; Muraoka, O. Aminoglicosidi feniletanoidi acilati con attività epatoprotettiva dalla pianta del deserto Cistanche tubulosa. Bioorg. Med. Chimica. 2010, 18, 1882–1890.

4. Chen, H.; Jing, FC; Li, CL; Tu, PF; Zhang, QS; Wang, ZH L'echinacoside previene la diminuzione dei livelli extracellulari striatali dei neurotrasmettitori delle monoamine nei 6- ratti con lesioni da idrossidopamina. J. Etnofarmaco. 2007, 114, 285–289.

5. Muraoka, O.; Ninomiya, K.; Morikawa, T.; Wakayama, H.; Matsuda, H.; Yoshikawa, M. Costituenti epatoprotettivi dagli steli di Cistanche tubulosa. Yakugaku Zasshi 2007, 127, 49–51.

6. Koo, KA; Cantato, SH; Parco, OH; Kim, SH; Lee, KY; Kim, YC Attività neuroprotettive in vitro dei glicosidi feniletanoidi da Callicarpa dichotoma. Pianta Med. 2005, 71, 778–780.

7. Li, M.; Liu, RM; Sole, AL; Wu, SJ; Liu, NN Separazione e purificazione di rutina e acaciina dall'erba medicinale cinese Herba Cirsii mediante combinazione di resina ad adsorbimento macroporoso e cromatografia controcorrente ad alta velocità. J. Cromatogr. Sci. 2009, 47, 329–332.

8. Yin, H.; Zhang, S.; Luo, XM; Liu, YH Isolamento preparatorio e purificazione di due glucosidi benzoxazinoidi da Acanthus ilicifolius L. mediante cromatografia in controcorrente ad alta velocità. J. Cromatogr. 2008, 1205, 177–181.

9. Peng, AH; Li, R.; Hu, J.; Chen, LJ; Zhao, X.; Luo, HD; Sì, HY; Yuan, Y.; Wei, YQ Separazione cromatografica in controcorrente ad alta velocità con gradiente di flusso di cinque diterpenoidi da Triperygium wilfordii e scale-up. J. Cromatogr. 2008, 1200, 129–135.

10. Xie, J.; Deng, J.; Abbronzatura, F.; Su, J. Separazione e purificazione dell'echinacoside da Penstemon barbatus (Can.) Roth riciclando la cromatografia in controcorrente ad alta velocità. J. Cromatogr. B2010, 878, 2665–2668.

11. Li, L.; Tsao, R.; Yang, R.; Liu, C.; giovane, JC; Zhu, H. Isolamento e purificazione dei glicosidi feniletanoidi daCistanche desertichemediante cromatografia in controcorrente ad alta velocità. Chimica alimentare. 2008, 108, 702–710.

12. Li, L.; Tsao, R.; Liu, ZQ; Liu, SY; Yang, R.; giovane, JC; Zhu, HH; Deng, ZY; Xie, MIO; Fu, ZH Isolamento e purificazione di acteoside e isoacteoside da Plantago psyllium L. mediante cromatografia in controcorrente ad alta velocità. J. Cromatogr. 2005, 1063, 161–169. Molecole 2012, 17 8284

13. Lei, L.; Yang, FQ; Zhang, TY; Tu, PF; Wu, LJ; Ito, Y. Isolamento preparatorio e purificazione di acteoside e 2'-acetil acteoside dalla salsa Cistanches (CA Mey.) G. Beck mediante cromatografia in controcorrente ad alta velocità. J. Cromatogr. 2001, 912, 181–185.

14. Lei, L.; Yang, FQ; Zhang, TY; Tu, PF; Wu, LJ; Chen, FC; Ito, Y. Isolamento preparatorio e purificazione dei glicosidi feniletanoidi dall'estratto di feci di cani beagle mediante cromatografia in controcorrente ad alta velocità. J. Liq. Cromatogr. relaz. Tecno. 2001, 24, 2187–2195.

15. Gao, SY; Feng, B.; Zhu, RN; Mamma, JK; Wang, W. Isolamento preparatorio di tre antrachinoni da Rumex japonicus mediante cromatografia in controcorrente ad alta velocità. Molecole 2011, 16, 1201–1210.

16. Lui, F.; Bai, YH; Wang, J.; Wei, J.; Yu, CY; Li, S.; Yang, WL; Han, CH Isolamento e purificazione di oridonina dall'intera pianta di Isodon rubescens mediante cromatografia in controcorrente ad alta velocità. Molecole 2011, 16, 7949–7957.

17. Kobayashi, H.; Oguchi, H.; Takizawa, nord; Miyase, T.; Ueno, A.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Nuovi glicosidi feniletanoidi da cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. I. Chimica. Farma. Toro. 1987, 35, 3309–3314.

18. Yoshizawa, F.; Deyama, T.; Takizawa, nord; Usmanghani, K.; Ahmad, M. I costituenti della cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. f. II. Isolamento e strutture di un nuovo glicoside feniletanoide e di un nuovo glicoside neolignico. Chimica. Farma. Toro. 1990, 38, 1927-1930.