L'apprendimento precedente della paura consente la rapida assimilazione di nuovi ricordi di paura direttamente nelle reti corticali Parte 2

Il precedente apprendimento contestuale della paura consente alla corteccia cingolata anteriore di codificare immediatamente nuovi ricordi

Fino ad oggi, abbiamo studiato le dinamiche del consolidamento del sistema nelle memorie uditive della paura. Tuttavia, il modello di consolidamento del sistema deriva principalmente da studi sulla memoria dipendente dall’ippocampo.

La paura uditiva è un problema psicologico molto comune che può avere un grande impatto sulla vita quotidiana delle persone. Quando si manifesta la fobia uditiva, le persone possono sentirsi molto a disagio e possono persino causare vari problemi di salute. Ma allo stesso tempo ci sono anche esperimenti che dimostrano che la paura uditiva può anche migliorare la memoria.

Negli ultimi anni, i ricercatori hanno scoperto che le persone con fobia uditiva sono più attente e sensibili di altre. Il loro cervello risponde in modo più forte e rapido alla stimolazione sonora. Questa reazione li rende più sensibili ai suoni nella loro vita. In alcuni casi, sono in grado di elaborare meglio una varietà di informazioni e persino di ottenere segnali più utili dai suoni, migliorando potenzialmente la loro memoria complessiva.

Quando una persona è in uno stato emotivo teso o ansioso, il cervello rilascia una sostanza chiamata adrenalina. Questa sostanza può favorire l'attività dei neuroni cerebrali e aumentare la concentrazione delle persone. Pertanto, durante uno stato di paura uditiva, il rilascio di adrenalina porta ad una maggiore concentrazione e memoria nell'ascoltatore.

Allo stesso tempo, quando lo stimolo audio della paura persiste, il cervello può adattarsi a questo stimolo costruendo una memoria più profonda del suono. Questa memoria può aiutare i pazienti a rispondere meglio a diversi stimoli sonori, consentendo loro di diventare più sicuri e indipendenti.

Pertanto, sebbene la paura uditiva possa causare molti inconvenienti nella vita quotidiana delle persone, può anche avere un impatto positivo sulla memoria. Quando le persone imparano ad affrontare questo problema psicologico, possono superare le proprie paure e persino trarne beneficio. Questo ci ricorda anche che dovremmo considerare correttamente i problemi psicologici, prestare attenzione alla salute mentale e utilizzare un atteggiamento positivo nell’affrontare le difficoltà per migliorare la nostra vita. Si può vedere che dobbiamo migliorare la nostra memoria. La Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come aumentare i livelli di acetilcolina e fattori di crescita. Queste sostanze sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, la carne può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l’apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello riceva nutrienti ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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Si pensa che questi ricordi si formino inizialmente sia a livello ippocampale che corticale. Nel tempo, l’interazione coordinata tra l’ippocampo e le reti corticali porta ad un graduale rimodellamento dei circuiti corticali che alla fine immagazzinano ricordi remoti [1–5]. In linea con questo, negli animali ingenui, i ricordi di paura dipendenti dall’ippocampo, vale a dire i ricordi di paura contestuali, dipendono inizialmente dall’ippocampo e diventano progressivamente dipendenti da una rete corticale che comprende l’ACC e la corteccia prefrontale [1,2,6–8 ].

Abbiamo quindi considerato se questa riorganizzazione dipendente dal tempo avvenisse in modo diverso se in precedenza si fosse verificato il consolidamento del sistema di un ricordo precedente. I ratti sono stati addestrati ad associare il contesto agli Stati Uniti. Due settimane prima, 1 gruppo di ratti aveva appreso un'altra associazione tra un contesto diverso e gli Stati Uniti (CtxA-CtxB), mentre un altro gruppo aveva ricevuto solo stimoli dolorosi immediati che ostacolavano l'apprendimento della paura contestuale (shock-CtxB) (S1A Fig). Gli animali sono stati iniettati con CNQX o soluzione salina nell'ACC 24 ore dopo l'apprendimento contestuale (Figg. 4A e S1B).

In linea con studi precedenti [1,6,8], l'inattivazione dell'ACC negli animali che non avevano appreso in precedenza un'altra associazione di paura ha lasciato inalterato il congelamento del CtxB, suggerendo così che questa manipolazione non ha influenzato la memoria recente. Tuttavia, in modo simile ai dati ottenuti nell'apprendimento della paura uditiva, l'inattivazione dell'ACC ha ridotto il congelamento al recente CtxB nei ratti che avevano appreso una precedente associazione di paura contestuale (Fig. 4B e 4C).

Questo fenomeno era causalmente correlato allo sviluppo del lento consolidamento del sistema della prima memoria perché era assente negli animali in cui i 2 eventi di paura erano separati da sole 7 o 24 ore, e in quelli in cui l'ACC era inattivato 24 ore dopo entrambi gli eventi di paura. il primo e il secondo apprendimento contestuale della paura. Inoltre, era assente nei ratti che hanno sperimentato l'esplorazione del primo contesto in assenza di US (gruppo Contesto-CtxB) (Fig 4D e 4E).

Fondamentalmente, l'inattivazione dell'ACC eseguita 1 ora dopo l'apprendimento ha influenzato anche la memoria della paura recente (Fig. 4F e 4G). A questo punto, la somministrazione di anisomicina ha ridotto il congelamento al CtxB negli animali che avevano sperimentato un precedente apprendimento contestuale della paura (Fig. 4H e 4I). Questi dati supportano l'idea che, una volta memorizzato un primo evento di paura, la neocorteccia diventa immediatamente essenziale per nuovi ricordi, sfruttando esclusivamente i meccanismi di consolidamento sinaptico.

Il precedente apprendimento contestuale della paura riorganizza le proiezioni ACC-BLA in modo che supportino i ricordi recenti

Successivamente abbiamo esaminato se la connettività neurale che viene reclutata durante la conservazione della memoria remota negli animali ingenui può anche partecipare alla recente ritenzione della memoria in animali che avevano precedentemente appreso un altro ricordo contestuale della paura. A tal fine, abbiamo studiato il coinvolgimento delle proiezioni dall'ACC al BLA nella ritenzione di ricordi contestuali recenti e remoti.

Uno studio precedente ha dimostrato che l’inibizione optogenetica dei terminali assonici proiettati dalla corteccia prefrontale al BLA compromette la ritenzione della memoria della paura contestuale in punti temporali remoti ma non recenti negli animali naïve [7]. Il vettore virale adeno-associato (AAV5-CaMKIIa-eNpHR3.0-mCherry) o il vettore di controllo (AAV5-CaMKIIa-mCherry) sono stati iniettati nell'ACC in 2 gruppi, come in gli esperimenti sopra descritti (Fig. 5A–5C e S3C). L'inibizione optogenetica dei terminali ACC nel BLA durante la recente ritenzione della memoria della paura contestuale ha compromesso il congelamento al CtxB solo negli animali a cui è stato iniettato il vettore eNpHR3.0-mCherry e che avevano precedentemente appreso un'associazione contesto-USA distinta (Fig 5D ).

In questo gruppo, la successiva inibizione dei terminali ACC nel BLA ha causato anche una significativa diminuzione del congelamento al CtxA, suggerendo così che ha influenzato anche il mantenimento dell'associazione contesto remoto-Stati Uniti (Fig 5E). Questi risultati supportano l’idea che lo stesso percorso neurale sia essenziale per la conservazione della memoria remota del primo evento di paura e dei ricordi recenti di nuovi eventi analoghi. Questi dati suggeriscono anche che il riarrangiamento delle vie corticali che scendono al BLA, indotto dal primo ricordo, è un processo comune sia per i ricordi di paura uditivi che per quelli contestuali.

Dopo un precedente apprendimento della paura, l'ippocampo dorsale e l'ACC sono entrambi necessari per la formazione di nuovi ricordi

Questi risultati pongono la questione se l’ippocampo formi nuovi ricordi anche se si è verificato un precedente apprendimento contestuale della paura. In alternativa, la corteccia potrebbe formare nuovi ricordi, anche in assenza dell’ippocampo. Per rispondere a queste domande, abbiamo inattivato l'ippocampo 1 ora dopo l'apprendimento contestuale della paura in 2 gruppi simili agli esperimenti sopra.

Poiché la maggior parte della letteratura sul consolidamento del sistema proviene da studi in cui l'ippocampo è stato distrutto in modo permanente, abbiamo iniziato lesionando in modo irreversibile l'ippocampo dorsale 1 ora dopo l'apprendimento (Fig. 6A-6C). Le lesioni dell'ippocampo hanno causato una diminuzione significativa del congelamento del CtxB in entrambi i gruppi (Fig 6C). Poiché le lesioni eccitotossiche potrebbero interferire transitoriamente con l'attività delle regioni cerebrali esterne all'ippocampo, come l'ACC, abbiamo ripetuto questo esperimento inattivando l'ippocampo dorsale con CNQX per bloccare i recettori locali del glutammato AMPA e riscontrato effetti amnesici in entrambi i gruppi (Fig 6D e 6E ).

Questi risultati hanno mostrato che l’ippocampo è necessario per la formazione di nuovi ricordi contestuali, indipendentemente dal fatto che si sia verificato un precedente apprendimento della paura. Insieme ai risultati di cui sopra, questi dati indicano anche che, negli animali che hanno appreso un precedente evento di paura contestuale, sia l'ippocampo che l'ACC sono necessari per formare ricordi di paura recenti, e nessuno di questi siti da solo può supportare la formazione della memoria in assenza dell'altro.

Abbiamo quindi studiato l'andamento temporale del coinvolgimento dell'ippocampo ritardando la lesione dell'ippocampo a 1 settimana dopo l'apprendimento. In linea con i risultati precedenti [46], le lesioni dell’ippocampo influenzavano ancora la formazione della memoria negli animali che non avevano mai appreso in precedenza altre associazioni di paura. Al contrario, nel gruppo che aveva appreso un precedente evento di paura, le lesioni dell'ippocampo non hanno influenzato la ritenzione della memoria (Fig. 6F e 6G), suggerendo che un precedente ricordo di paura accorcia la finestra temporale del coinvolgimento dell'ippocampo (da 2 settimane a 1 settimana), poiché osservato anche per gli apprendimenti spaziali [3,20,21].

Discussione

Nel presente studio, abbiamo scoperto che il precedente consolidamento del sistema di un ricordo uditivo della paura consente al Te2 di codificare immediatamente un nuovo ricordo uditivo della paura tramite consolidamento sinaptico. Inoltre, le proiezioni discendenti dal Te2 al BLA che si attivavano durante il consolidamento degli apprendimenti precedenti diventano necessarie nella formazione di nuovi ricordi uditivi di paura.

Risultati simili sono stati osservati nell’apprendimento della paura contestuale dipendente dall’ippocampo. In quest'ultimo compito, abbiamo anche scoperto che l'apprendimento precedente accorcia la durata del coinvolgimento dell'ippocampo nel recente apprendimento contestuale della paura. Nel loro insieme, i nostri risultati suggeriscono che l’apprendimento precedente riorganizza i circuiti cerebrali in modo che nuove informazioni analoghe vengano apprese immediatamente nelle strutture corticali.

L'attuale concetto di consolidamento del sistema delle memorie ippocampo-dipendenti presuppone che l'ippocampo sia coinvolto in modo limitato nel tempo e che un concomitante processo graduale di riorganizzazione del circuito cerebrale avvenga nel tempo in modo che le reti corticali diventino progressivamente più importanti [1–5].

Sebbene esistano anche teorie alternative [47], numerosi studi supportano il ruolo temporalmente limitato dell'ippocampo nei processi di memoria sia in modelli umani che animali [1–3]. Al contrario, la riorganizzazione dei circuiti cerebrali che supportano la memoria nel tempo è stata dimostrata principalmente in modelli animali, mentre le prove negli esseri umani sono più controverse [3].

Alcuni studi hanno dimostrato che l’attività dell’ippocampo durante il recupero della memoria negli esseri umani diminuisce progressivamente nel corso di settimane e mesi, mentre l’attività nella regione prefrontale mediale ventrale [48], nella neocorteccia temporale [49] o la connettività tra le aree corticali [48] aumenta significativamente. Al contrario, studi più recenti hanno dimostrato che, sebbene l’attività dell’ippocampo diminuisse con il passare del tempo, l’attività corticale rimaneva stabile nel tempo [50] o diminuiva anch’essa [51]. Prove più consistenti sulla riorganizzazione dei circuiti cerebrali che supportano la memoria nel tempo sono state ottenute negli animali [1–3]. Questi studi sono stati condotti su animali sperimentalmente naïve.

Investigando questo problema negli animali che avevano formato un precedente ricordo di paura, abbiamo scoperto che l'ippocampo è necessario per la formazione di nuovi ricordi, indipendentemente dal fatto che si fosse verificato un precedente apprendimento della paura. Tuttavia, la riorganizzazione dei circuiti cerebrali innescata dal primo apprendimento consente alla neocorteccia di codificare immediatamente nuovi ricordi, semplicemente attraverso meccanismi cellulari di consolidamento sinaptico. Questo fenomeno si applica sia ai ricordi di paura ippocampali-dipendenti che a quelli indipendenti ed è stato specificamente indotto dal lento consolidamento del sistema innescato dall'evento di apprendimento iniziale.

Era assente nei ratti in cui le due prove di apprendimento erano temporalmente vicine tra loro (poche ore o 1 giorno) e in quelli in cui l'inattivazione corticale dopo il primo evento di apprendimento precludeva il riarrangiamento della corteccia e il suo successivo coinvolgimento nella rapida assimilazione di nuovi stimoli. ricordi. Inoltre, una volta che il primo apprendimento della paura ha riorganizzato la connettività cerebrale, le vie che scendono dalla corteccia al BLA sono necessarie non solo per la conservazione dei ricordi remoti come nei ratti naïve ma anche per quelli recenti. Concludiamo che se un ricordo analogo è stato codificato in precedenza, la riorganizzazione dei circuiti cerebrali era già avvenuta e potrebbe non essere più necessaria per la formazione di nuovi ricordi, che al contrario coinvolgono immediatamente la corteccia e la sua interazione con i siti sottocorticali.

Nonostante il gran numero di studi che dimostrano la riorganizzazione dipendente dal tempo dei circuiti cerebrali negli animali ingenui, lo scopo esatto di questo processo è lungi dall’essere definito. Poiché le risposte comportamentali associate alla memoria possono rimanere simili nel tempo, si ritiene che questo processo serva a migliorare la stabilità della memoria nel tempo [1,2,52]. Sulla base dei nostri risultati, proponiamo che, quando si verifica un evento di paura per la prima volta, i circuiti cerebrali subiscono un lungo processo di riorganizzazione, come descritto nel modello di consolidamento del sistema. Questo processo potrebbe servire a riorganizzare le reti neurali che immagazzinano permanentemente la memoria della paura in modo che possano acquisire immediatamente nuove informazioni analoghe attraverso meccanismi di consolidamento sinaptico. In effetti, questo meccanismo operativo può rendere il nuovo apprendimento più “economico”, perché può ridurre la spesa di risorse per acquisire nuove informazioni correlate, liberando così più risorse per l’apprendimento di informazioni nuove e non correlate.

Una domanda importante che emerge dalle nostre scoperte è se l’apprendimento precedente modifichi permanentemente le reti neurali in modo che esperienze simili possano essere immagazzinate immediatamente nella neocorteccia, anche se si verificano a intervalli di tempo molto distanti. In alternativa, potrebbe essere che il sistema venga riportato al livello iniziale degli animali ingenui se non si verificano a breve nuove esperienze simili. Esperimenti che valuteranno il coinvolgimento della neocorteccia a intervalli di tempo crescenti tra il primo e il secondo apprendimento chiariranno questo punto.

Abbiamo anche scoperto che il blocco della neocorteccia durante il consolidamento precoce di una prima esperienza impediva l'immediata assegnazione di nuove esperienze simili alla neocorteccia (vedi Fig. 1F e 4D). Questi risultati suggeriscono che i processi cellulari che avvengono immediatamente dopo il primo apprendimento all'interno della neocorteccia sono necessari per il suo reclutamento nel processo di consolidamento della memoria del sistema. Questa idea è in linea con la scoperta che alcune cellule "etichettate" vengono attivate all'interno della neocorteccia dopo l'apprendimento negli animali ingenui e servono per l'immagazzinamento di ricordi remoti ma non recenti [7,8,12,44]. Sono necessari studi futuri per chiarire se queste cellule svolgono questo ruolo anche a seguito di apprendimenti pregressi o se partecipano anche alla formazione di ricordi recenti.

Originariamente, il modello del consolidamento dei sistemi portava all'idea aggiuntiva che l'ippocampo apprende nuove informazioni rapidamente mentre la neocorteccia le apprende lentamente, ma studi successivi hanno dimostrato che la neocorteccia è capace anche di processi di apprendimento rapidi [3,20,21,53]. I nostri dati hanno mostrato che 2 diverse cortecce (Te2 e ACC) possono apprendere nuove informazioni immediatamente se in precedenza si è verificato un evento analogo.

Secondo i nostri studi precedenti [10,16,17,34,43,45], usiamo il termine Te2 per riferirci alla regione più posteriore della zona uditiva che, sulla base degli studi di Zilles [24,25], comprende principalmente l'associazione temporale e le aree etorinali. Sebbene non possiamo escludere che i nostri risultati possano riflettere contributi degli effetti del farmaco anche nelle regioni circostanti, vale a dire l'adiacente corteccia visiva, la corteccia uditiva primaria e la corteccia peririnale, i dati che abbiamo ottenuto negli animali naïve suggeriscono che erano principalmente dovuti all'inattivazione del Te .

Abbiamo scoperto che negli animali ingenui, il Te2 era necessario per le memorie uditive remote ma non recenti, mentre l'inattivazione della corteccia visiva adiacente lasciava inalterate le memorie uditive remote [10]. Al contrario, un blocco combinato della corteccia primaria e di quella Te2 ha compromesso anche la memoria recente [34]. Allo stesso modo, l’inattivazione della corteccia peririnale anteriore ha compromesso i ricordi di paura [32,54], mentre l’inattivazione della corteccia peririnale posteriore non ha influenzato i ricordi di paura recenti [54] e remoti [10].

Anche nel caso dell’ACC e dei ricordi di paura contestuali, l’inattivazione dell’adiacente corteccia motoria primaria e secondaria non ha influenzato i ricordi recenti e remoti [55], mentre l’inattivazione dell’adiacente corteccia prelimbica ha compromesso sia i ricordi recenti che quelli remoti [11].

Per quanto riguarda il ruolo che queste cortecce svolgono nei processi di memoria, Te2 partecipa alla memorizzazione del valore emotivo abbinato ai suoni [10,13,16,56]. Questa idea è stata recentemente dimostrata anche nella corteccia visiva di ordine superiore [57,58]. D'altra parte, l'ACC può formare e immagazzinare ricordi ma può anche modulare l'attività di altre aree corticali [1–3,6].

Nonostante il gran numero di studi che dimostrano che Te2 e ACC sono necessari per ricordi remoti ma non recenti, alcuni studi recenti hanno riportato che queste cortecce potrebbero essere necessarie anche per la ritenzione di ricordi di paura uditivi recenti [34,59] e contestuali [55]. Le precise condizioni al contorno che possono determinare la necessità di queste cortecce per i ricordi recenti sono poco conosciute.

Uno di questi studi ha suggerito che l’intensità dell’esperienza emotiva può svolgere un ruolo importante [34], ma gli studi futuri dovrebbero affrontare meglio questo problema. Studi futuri dovranno anche chiarire se le cellule che si attivano all'interno della neocorteccia dopo l'apprendimento negli animali naïve, e che servono per l'immagazzinamento di ricordi remoti ma non recenti [7,8,12,44], svolgono anche questo ruolo in seguito a precedenti apprendimento o se partecipano alla formazione di ricordi recenti.

Per quanto riguarda la partecipazione dell'ippocampo ai processi di memoria, qui abbiamo scoperto che l'ippocampo dorsale è necessario per l'apprendimento di nuova memoria contestuale anche se si è verificato un precedente apprendimento contestuale. Un risultato simile è stato osservato eseguendo un disegno entro soggetti su ratti che hanno appreso ricordi contestuali sia remoti che recenti [60]. D'altra parte, è stato anche dimostrato che i meccanismi cellulari che mediano il successivo apprendimento nell'ippocampo possono differire da quelli coinvolti durante la prova di apprendimento precedente [22,61].

Abbiamo anche scoperto che negli animali che hanno sperimentato la paura contestuale per la prima volta, l'ippocampo è necessario anche 1 settimana dopo l'apprendimento, in linea con una precedente scoperta in animali naïve [46]. Al contrario, nell’altro gruppo, le lesioni dell’ippocampo non hanno influenzato la ritenzione della memoria in questo intervallo di tempo, suggerendo che un precedente apprendimento della paura accorcia la finestra temporale del coinvolgimento dell’ippocampo, come osservato anche per l’apprendimento spaziale [3,20,21]. Questi studi e il presente forniscono quindi prove convergenti che la finestra temporale dell’amnesia temporale indotta dalle lesioni dell’ippocampo dipende dalle precedenti esperienze apprese sia nelle memorie spaziali che emotive.

In questi studi, gli autori hanno anche proposto che addestrare i ratti per un periodo prolungato in un compito spaziale produce uno schema "mentale" di conoscenza, in cui le nuove informazioni correlate possono essere rapidamente assimilate [3,20,21,53]. Anche se i nostri risultati possono essere coerenti con questa idea, è molto difficile dire se una prova di apprendimento della paura possa formare uno “schema” associativo di conoscenza e se un evento nuovo e diverso che si verifica in un ambiente diverso possa essere integrato all’interno di questo schema. . Sono necessari ulteriori studi per chiarire questo problema. In ogni caso, dato che la maggior parte dei ricordi negli esseri umani e in altri animali sono costruiti su esperienze passate, le reti cerebrali che immagazzinano per la prima volta ricordi di paura remota potrebbero essere quelle che codificano ricordi di paura sia recenti che remoti nel corso della vita.

Metodi, modello sperimentale e dettagli del soggetto

Animali

Ratti Wistar maschi sani (età, da 65 a 70 giorni; peso, da 250 a 350 g, di tipo selvatico), provenienti da una struttura interna per animali, sono stati alloggiati 3 per gabbia con cibo e acqua disponibili ad libitum, sotto una luce di 12 ore /ciclo buio (luci accese alle 7:00 AM) a una temperatura costante di 22 ± 1˚C. Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Ministero della Salute italiano (autorizzazione n. 408/2020-PR) e dal comitato bioetico locale dell'Università di Torino.

Design sperimentale

La riproducibilità dei dati è stata valutata con diverse repliche (Tabella S1). I primi esperimenti di inattivazione del CNQX in Te2 (Fig 1A-1C) sono stati eseguiti in un numero maggiore di repliche perché sono stati i primi esperimenti che abbiamo condotto e sono serviti a testare l'ipotesi principale del nostro studio. Gli animali sono stati assegnati a priori a diversi gruppi comportamentali in modo bilanciato in termini di peso.

Animali maschi della stessa covata sono stati assegnati in modo casuale a ciascun gruppo sperimentale. Per prima cosa abbiamo affrontato l'ipotesi principale del nostro studio, cioè che l'inattivazione corticale può influenzare in modo diverso il consolidamento di un nuovo ricordo di paura nei ratti sperimentalmente naïve e negli animali che avevano appreso un precedente evento di paura. Nel caso di differenze statistiche tra questi gruppi, abbiamo poi eventualmente eseguito ulteriori gruppi di controllo attraverso l'iniezione di soluzione salina. Un approccio simile è stato applicato agli esperimenti optogenetici, in cui il gruppo di controllo AAV è stato eseguito solo dopo aver rilevato differenze statistiche tra ratti naïve e precedentemente addestrati. Questi programmi sperimentali hanno permesso di evitare gruppi di controllo non necessari e l'utilizzo di animali non necessari, questione chiave nella legislazione europea e italiana sulla sperimentazione animale (principio delle 3 R).

Procedure comportamentali

Tutti gli esperimenti sono stati condotti durante la fase di luce del giorno (dalle 8:00 alle 16:00). Gli animali sono stati trasportati singolarmente dalla struttura alle sale sperimentali all'interno di diversi piccoli secchi trasparenti a seconda delle esigenze sperimentali.

Training uditivo: prima sessione comportamentale.

Animali uditivi condizionati dalla paura (CS1-CS2). In questo gruppo, i ratti sono stati prelevati delicatamente dalla gabbia di casa e trasportati dalla stanza di stabulazione alla stanza insonorizzata. Una volta lì, gli animali venivano posti all'interno dell'apparato di condizionamento costituito da una gabbia nera rettangolare (35 × 40 cm) dotata di una griglia di tondini di acciaio inossidabile (1 cm di diametro, distanziati di 1,5 cm l'uno dall'altro) collegata ad un erogatore di shock. impostare. I ratti sono stati lasciati indisturbati per 1 minuto. Trascorso questo tempo, sono stati somministrati 7 stimoli condizionati (CS) costituiti da un tono puro di 15 kHz di frequenza (15 s di durata ciascuno, 80 dB, intervallo di prove 36 s). L'ultimo 1 s di ciascun tono è stato abbinato a un'ecografia dolorosa (0,5 mA, 1 s). Al termine della sessione di condizionamento, i ratti sono stati riportati nella gabbia di origine.

Animali solo shock (shock-CS2). In questo gruppo, i ratti sono stati collocati in modo simile all'interno dello stesso apparato di condizionamento. Immediatamente dopo, ciascun ratto è stato sottoposto a 7-shock ai piedi (1 s, 0,5 mA) uno immediatamente dopo l'altro. Al termine della stimolazione gli animali sono stati riportati nella gabbia di origine. Il tempo di permanenza nella gabbia di condizionamento è stato inferiore a 9 secondi. Studi precedenti hanno dimostrato che questa procedura consente di evitare processi associativi tra stimoli dolorosi e stimoli sensoriali [29,30].

Animali condizionati dalla paura degli odori (odore-CS2). In questo gruppo, i ratti sono stati posti all'interno della stessa gabbia nera rettangolare impiegata nei gruppi sperimentali di cui sopra e collegati a un sistema di erogazione della scarica. I ratti sono stati lasciati indisturbati per 2 minuti. Dopo questo tempo, sono stati somministrati 7 CS costituiti da odori di vaniglia (10 s di durata ciascuno, intervallo di prova di 24 s). L'ultimo 1 s di ciascun odore è stato abbinato a un'ecografia dolorosa (0,5 mA, 1 s). Il modulo di condizionamento è stato posto in prossimità di una fonte di ventilazione per evitare la persistenza degli stimoli erogati dopo il loro offset. La gabbia era assicurata con una griglia superiore. Gli odori sono stati presentati utilizzando un olfattometro a diluizione del flusso. L'aria pulita (1,5 L/min) veniva diretta a un'elettrovalvola che, una volta azionata, faceva passare l'aria a una bottiglia da 15 ml contenente 10 ml di odore di vaniglia.

Animali solo tono (Tone-CS2). I ratti di questo gruppo sono stati posti all'interno della stessa gabbia nera e gli è stato presentato il tono 15-kHz (7 stimoli, 15 s di durata, 36 s ITI) erogato in assenza degli Stati Uniti.

Animali pre-esposti (Tone-CS1-CS2). I ratti sono stati posti all'interno della gabbia di condizionamento e, 1 minuto dopo, è stato presentato loro 20 volte solo con il tono 15-kHz e 24 ore dopo lo stesso tono è stato accoppiato con l'US che è diventato il CS1.

Animali condizionati dalla paura con rumore bianco (WN-CS2). In questo gruppo, i ratti sono stati posti all'interno della gabbia nera rettangolare e lasciati indisturbati per 1 minuto. Dopo questo tempo, sono stati somministrati 7 CS costituiti da un WN (15 s di durata ciascuno, 75 dB, 36 s di intervallo tra le prove). L'ultimo 1 s di ciascun tono è stato abbinato a un'ecografia dolorosa (0,5 mA, 1 s). Al termine della sessione di condizionamento, i ratti sono stati riportati nella gabbia di origine.

Apprendimento della paura uditiva: secondo training comportamentale.

Due settimane dopo le procedure descritte nel paragrafo precedente, gli animali sono stati addestrati in un altro compito diverso di condizionamento della paura uditiva. I ratti sono stati messi in una scatola skinner standard, come nel nostro lavoro precedente [10], e lasciati indisturbati per 2 minuti. Trascorso questo tempo, sono stati erogati 7 CS costituiti da toni puri di 3 kHz di frequenza (8 s di durata ciascuno, 80 dB, 22 s di intervallo tra le prove). L'ultimo 1 s di ciascun tono è stato abbinato a un'ecografia dolorosa (0,5 mA, 1 s). Al termine della sessione di condizionamento, i ratti sono stati riportati nella gabbia di origine.

Paura della ritenzione della memoria. La ritenzione della memoria uditiva della paura recentemente acquisita al CS2 (3 kHz) è stata testata 4 giorni dopo. Per gli esperimenti di optogenetica, il test della memoria recente è stato eseguito con erogazione del laser 24 ore dopo l'apprendimento CS2-US in analogia all'intervallo di tempo in cui abbiamo eseguito l'inattivazione corticale attraverso la somministrazione del CNQX (cioè, 24 ore dopo formazione). I ratti sono stati abituati a un apparato diverso da quello utilizzato per il condizionamento e posti in una stanza diversa per evitare comportamenti di paura condizionati da segnali contestuali [10,62]. Il nuovo apparecchio era costituito da una gabbia di plastica trasparente con un lato verniciato di nero racchiusa all'interno di una scatola fonoassorbente dotata di un aspiratore, che eliminava l'aria odorizzata dall'involucro e forniva un rumore di fondo di 60 dB. Agli animali è stato permesso di esplorare la gabbia per 5 minuti al giorno durante la sessione di assuefazione. Il giorno del test di ritenzione della memoria della paura, dopo 2 minuti di esplorazione libera, abbiamo erogato 4 CS2 da 3 kHz (8 s—22 ITI) non seguite da alcuna ecografia.

Se richiesto dalla richiesta sperimentale, i ratti sono stati poi testati per la ritenzione della memoria remota della paura, acquisita 2 settimane prima della seconda prova di condizionamento uditivo alla paura. A questo scopo, 7 giorni dopo il test di ritenzione della memoria della paura al tono 3-kHz, gli animali sono stati messi in un ambiente nuovo (una gabbia a strisce bianche e nere) e poi presentati con il tono 15-kHz. Quattro toni sono stati presentati a intervalli di 36 secondi.

Formazione contestuale: prima sessione comportamentale.

Gruppo di condizionamento contestuale alla paura (CtxA-CtxB). In questo gruppo, i ratti sono stati prelevati delicatamente dalla gabbia di casa, posti in un secchio e trasportati dalla stanza di stabulazione alla stanza insonorizzata. Una volta lì, gli animali venivano posti all'interno dell'apparato di condizionamento costituito dalla suddetta gabbia rettangolare nera, dotata di griglia di tondini di acciaio inossidabile collegata ad un dispositivo di erogazione degli shock. I ratti sono stati lasciati indisturbati per 1 minuto. Dopo questo tempo, sono stati somministrati 5 US (0,5 mA, 1 s) con intervalli di tempo di 51 s. Al termine della sessione gli animali sono stati riportati nella gabbia di origine.

Gruppo di solo shock (shock-CtxB). I ratti, una volta posti all'interno dell'apparato di condizionamento, ricevevano immediatamente 5-shock ai piedi (1 s, 0,5 mA) uno subito dopo l'altro. Il tempo di permanenza nella gabbia di condizionamento è stato inferiore a 7 secondi. Studi precedenti hanno dimostrato che questa procedura consente di evitare processi associativi tra stimoli dolorosi e stimoli sensoriali [29,30].

Animali solo contesto (contesto-CtxB). I ratti sono stati posti all'interno della stessa gabbia nera impiegata negli esperimenti di cui sopra per 5 minuti senza la somministrazione di alcun US.

Nuovo condizionamento contestuale alla paura e recente conservazione della memoria della paura. Due settimane dopo le procedure descritte nel paragrafo precedente, tutti i gruppi sono stati addestrati ad associare un nuovo ambiente contestuale (il modulo skinner box, posizionato in una stanza diversa) con un'ecografia dolorosa (0,5 mA, 1 s) . Ciascun animale è stato posto all'interno della nuova camera e lasciato indisturbato per 2 minuti. Successivamente è stato esposto a 5 US separati da intervalli di 30 s.

La ritenzione della memoria contestuale della paura è stata testata 4 giorni dopo la procedura di condizionamento della paura mettendo nuovamente i ratti nella camera della scatola di Skinner per 3 minuti. Per gli esperimenti di optogenetica, il test della memoria recente è stato eseguito con erogazione del laser 24 ore dopo l'apprendimento del CtxB-US in analogia all'intervallo di tempo in cui abbiamo eseguito l'inattivazione corticale attraverso la somministrazione del CNQX (cioè 24 ore dopo l'allenamento). Se richiesto dalla richiesta sperimentale, i ratti sono stati poi testati per la ritenzione della memoria remota della paura inserendo gli animali nel contesto accoppiati agli US 2 settimane prima della nuova associazione.

Gli animali sono stati trasportati in 2 diversi secchi alle camere di condizionamento secondo le diverse procedure contestuali.

Misura di congelamento. In tutte le procedure sperimentali, la valutazione della ritenzione della memoria della paura è stata determinata come una risposta di congelamento [10], analizzata come la completa assenza di mobilità somatica ad eccezione dei movimenti respiratori. Per ciascun animale, la quantità di tempo (in secondi) trascorso nel congelamento è stata misurata offline da 2 osservatori indipendenti che erano in cieco rispetto ai gruppi di animali.

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