Chinolilnitroni privilegiati per la terapia combinata di ictus ischemico e malattia di AlzheimerⅡ

3. Materiali e Metodi

3.1. Sintesi

I QN target sono stati preparati e purificati come mostrato nel materiale supplementare.

3.2. Analisi della neuroprotezione in un modello sperimentale di ischemia

3.2.1. Culture neuronali primarie

Le colture neuronali primarie sono state preparate dalla corteccia cerebrale come precedentemente descritto [16]. Le cortecce cerebrali sono state ottenute da embrioni di ratto Sprague-Dawley E16, omogeneizzati e seminati su piastre multiple di plastica prerivestite con 0.05 mg/mL poli-Dlysine a una densità di 2,5 × 105 cellule/cm2. Le colture cellulari sono state mantenute in un'atmosfera di CO2 al 6,5% a 37°C, in mezzo di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio integrato con siero di vitello fetale inattivato al calore al 15% (56°C, 30 min). Dopo 24 ore, il terreno di coltura è stato sostituito da terreno privo di siero (Dulbecco's/Ham's F12, 1:1 vol/vol, 5 mg/mL di glucosio, 2 mM di L-glutammina e 1 mM di piruvato di sodio e integrato con 100 µg /mL di transferrina, 100 µM di putrescina, 20 nM di progesterone, 30 nM di selenito di sodio e 5 µg/mL di insulina).

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Negli esperimenti riportati, sono state utilizzate colture neuronali in vitro (DIV) da 6- a 7- giorni, che contenevano il 90% di neuroni maturi positivi per l'isotipo III della tubulina, come descritto in precedenza [17]. Tutte le procedure associate agli esperimenti sugli animali sono state autorizzate dal Comitato Etico dell'Ospedale Universitario Ramón y Cajal (Madrid, Spagna).

3.2.2. Ischemia sperimentale in colture neuronali e trattamenti

Per indurre l'ischemia sperimentale, le colture neuronali primarie sono state sottoposte a privazione di ossigeno-glucosio (OGD) [18]. Le colture da 6- a 7-DIV sono state lavate e poste in mezzo di Dulbecco privo di glucosio, precedentemente fatto gorgogliare con il 95 percento di N2/5 percento di CO2 per 30 minuti, e conservate in una camera anaerobica umidificata contenente un miscela di gas al 95% di N2/5% di CO2 a 37 °C per 4 ore (OGD4h). Il gruppo di controllo è stato posto in mezzo di Dulbecco addizionato di glucosio e tenuto nell'incubatore normossico per 4 ore. Dopo 4 ore di incubazione in condizioni anossiche (OGD4h) o normossiche (controllo), le cellule di coltura sono state rapidamente poste in terreno di coltura normoglicemico privo di siero e condizioni di riossigenazione, quindi sono stati aggiunti composti o veicolo e le cellule sono state mantenute in condizioni normossiche e normoglicemiche fino al recupero per 24 h.

Il gruppo sperimentale del veicolo (R24h) includeva le stesse quantità di veicoli dei composti testati (concentrazione finale senza testo 0,5% di etanolo). Dopo il recupero per 24 ore, è stata determinata la vitalità cellulare. Ad ogni gruppo analizzato è stato assegnato un ordine casuale per eseguire alla cieca la procedura sperimentale. Le analisi dei composti sono state eseguite indipendentemente da quattro a otto volte diverse con diversi lotti di colture e ogni esperimento è stato eseguito in quadruplicato.

3.2.3. Saggio di vitalità cellulare

Per la valutazione dell'effetto neuroprotettivo dei composti contro l'OGD, la vitalità cellulare è stata valutata quantificando le cellule viventi metabolicamente attive, come determinato dalla riduzione fotometrica di 3-(4,5-dimetiltiazol{{3 }}yl)-2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) (Roche) a un prodotto blu formazano.

Il dosaggio MTT è stato eseguito dopo il periodo di recupero, ad eccezione del gruppo OGD 4 h, per il quale è stato aggiunto MTT subito dopo la fine del periodo OGD, senza recupero, trattando le cellule con 0.2 mg/mL MTT nel terreno di coltura per 1,5 ore a 37 ◦C in un'atmosfera di CO2 al 6,5%. Dopo l'incubazione, le cellule sono state lisate con un uguale volume di soluzione di lisi (10 mM HCl, 10% SDS) durante la notte. La riduzione dell'MTT è stata quantificata mediante la misurazione dell'assorbanza a 595 nm (690 nm come riferimento). La diminuzione dell'attività MTT denota una compromissione della funzione mitocondriale ed è considerata indicativa di danno cellulare.

3.3. Analisi della neuroprotezione nei modelli sperimentali AD

3.3.1. Coltura cellulare SHSY-5Y

La linea cellulare di neuroblastoma SH-SY5Y è stata ottenuta da Sigma-Aldrich (Madrid, Spagna), mantenuta e coltivata in una miscela 1:1 di terreno minimo essenziale di Eagle (EMEM) e terreno F12 integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS ), secondo le procedure precedentemente descritte [8].

Le colture sono state seminate in fiasche e mantenute a 37°C in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 e il 95% di aria. Per i saggi di vitalità, le cellule SH-SY5Y sono state seminate in 96-pozzetti a una densità di 50,000 cellule/pozzetto seguendo la procedura riportata [8]. In questo studio, tutte le cellule sono state utilizzate con un basso numero di passaggi (<14).

3.3.2. Studi di neuroprotezione

Per studiare il potenziale effetto neuroprotettivo dei composti, le cellule sono state preincubate con i composti a 0.3, 1, 3 o 10 µM per 24 ore. Quindi, le cellule sono state incubate con 30 µM di rotenone e 10 µM di oligomicina-A (R/O) [19], acido okadaico (20 nM) [20] o amiloide- 25-35 (30 µM) (Sigma-Aldrich, Madrid, Spagna) con o senza composti a diverse concentrazioni per 24 ore. Al termine dell'esperimento, la vitalità cellulare è stata misurata utilizzando il metodo MTT descritto nella Sezione 3.2.3.

3.4. Analisi statistica

I risultati ottenuti per ciascun trattamento sono stati mediati e analizzati in modo indipendente e le informazioni sul trattamento sono state tenute nascoste durante lo studio. I dati sono stati rappresentati come media ± SE. L'analisi della varianza (ANOVA) è stata eseguita per confrontare i dati tra più concentrazioni, a seguito di un test post hoc quando l'analisi della varianza era significativa. Il livello di significatività statistica è stato fissato a {{0}}.05 utilizzando il software statistico Prism 5.0 (GraphPad).

3.5. Analisi dell'ADME

Le proprietà ADME del composto MC903 sono state valutate con il modulo QikProp di Schrödinger (QikProp, versione 5.1, Schrödinger, LLC, New York, NY, USA, gennaio 2017) [21–23].

4. Conclusi

In questo lavoro, abbiamo divulgato i risultati preliminari che abbiamo ottenuto nella ricerca di agenti singoli e nuovi per il potenziale trattamento combinato di ictus ischemico e AD. Contrariamente ad altri approcci riportati [14,15], qui abbiamo affrontato per la prima volta una progettazione di farmaci basata sulla razionalità utilizzando una strategia di progettazione di farmaci basata su frammenti basata sulla giustapposizione di farmacofori selezionati da QN23 e Contilisant, i nostri composti di piombo più avanzati rispettivamente per l'ictus ischemico e il trattamento dell'AD.

Così, alla ricerca di nuovi nitroni come agenti neuroprotettivi-antiossidanti, in grado non solo di diminuire i livelli di ROS ma anche di legarsi a bersagli biologici e aumentare il livello di neurotrasmettitori - un deficit chiave riscontrato nel cervello dei pazienti con AD - abbiamo sintetizzato i QN JMA101A, JMA98C , DDI89, DDI88, JMA12A, JMA11A, MC903 e MC902 (Figura 1) e li ha sottoposti a test fenotipici appropriati per lesioni ischemiche e AD. Di conseguenza, siamo stati in grado di identificare MC903 come un sicario. Per quanto riguarda la struttura, MC903 porta gli stessi gruppi funzionali nelle stesse posizioni di QN23, tranne che per una N-propargil piperazina sostituita all'altro azoto da un motivo lineare a tre metilene legato a O(C6), invece di un gruppo metossi.

Tenendo conto dei risultati ottenuti dal SAR preliminare qui riportato, questa disposizione funzionale e farmacoforica sembra critica per le attività osservate e dovrebbe essere presa in considerazione per ulteriori sviluppi. Pertanto, MC903 è un nuovo e piccolo QN per la potenziale terapia combinata di ictus ischemico e AD, che mostra forti proprietà neuroprotettive su colture neuronali primarie in condizioni OGD come modello sperimentale di ischemia e su cellule della linea neuronale contro R/O, OA o A 25-35 trattamenti, che imitano gli effetti riscontrati nell'AD.

Sulla base di questi risultati promettenti, i nostri sforzi sono ora diretti a migliorare il profilo farmacologico osservato di hit-MC903 mediante la progettazione, la sintesi e la valutazione biologica di nuovi QN correlati, comprese le pertinenti analisi di legame enzimatico e recettoriale, alla ricerca di un lead-QN sottoporre a idonei modelli animali di ictus ischemico e AD. I risultati attuali aprono la strada a nuove intuizioni terapeutiche e sviluppi nella ricerca di nuovi agenti per il trattamento combinato di ictus ischemico e AD.

il meccanismo della Cistanche effetto di neuroprotezione

Cistanche è un'erba tradizionale cinese che è stata segnalata per avere effetti neuroprotettivi. I meccanismi alla base di questi effetti non sono completamente compresi, ma ci sono diversi possibili meccanismi proposti dai ricercatori:

1. Attività antiossidante: è stato scoperto che gli estratti di Cistanche possiedono una potente attività antiossidante, che può proteggere dai danni neuronali indotti dallo stress ossidativo.

2. Effetti antinfiammatori: l'infiammazione è una causa comune di malattie neurodegenerative e gli estratti di cistanche hanno dimostrato di avere effetti antinfiammatori che possono attenuare il danno neuronale.

3. Protezione della funzione mitocondriale: la disfunzione mitocondriale contribuisce in modo determinante al danno neuronale e alla morte cellulare e si è scoperto che gli estratti di cistanche proteggono dal danno mitocondriale e migliorano la funzione mitocondriale.

4. Attivazione di fattori neurotrofici: i fattori neurotrofici sono sostanze chimiche che promuovono la crescita e la sopravvivenza dei neuroni e gli estratti di cistanche hanno dimostrato di aumentare l'espressione di fattori neurotrofici come il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) e il fattore di crescita nervoso (NGF) .

Riferimentoces

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