Effetto protettivo e meccanismo dei glicosidi di cistanche in un modello di lesione da reperfusione di ischemia cerebrale di ratto
Dec 19, 2024
Astratto
ObiettivoPer studiare l'effetto neuroprotettivo e il meccanismo dei glicosidi di cistanche (GCS) sulla lesione della riperfusione dell'ischemia cerebrale (CIRI) nei ratti. METODI Quarantotto ratti maschi Wistar sono stati divisi in modo casuale in gruppi sham, modello, GC e nimodipina. Un modello di ratto di CIRI focale è stato istituito dall'occlusione dell'arteria cerebrale media. Le capacità sensoriali e motorie dei ratti in ciascun gruppo sono state valutate mediante rimozione dell'adesivo, raggio di bilanciamento e test di campo aperto. L'area dell'infarto cerebrale è stata rilevata da 2,3, 5- trifeniltetrazolio cloruro, la colorazione NISSL è stata utilizzata per osservare la morfologia delle cellule nervose e la deossinucleotidilefiliche terminali terminali è stata utilizzata per rilevare l'apoptosi delle celle nervose. Livelli di espressione delle proteine correlate all'apoptosi Bcl -2 associate x (Bax), linfoma a cellule B -2 (bcl -2) e proteasi aspartiche cisteine -3} (caspase -3) sono stati rilevati da immunohochimic blot. Risultati rispetto al gruppo sham, il punteggio del deficit neurologico è stato significativamente aumentato (P<0.05) and the times to remove stickers and passing the balance beam were significantly increased (P<0.05), motor ability was decreased, infarct size was increased, the number of neurons was decreased, and the number of apoptotic cells was increased after CIRI. Bax and caspase-3 expression were significantly increased (P<0.05) and Bcl-2/Bax was significantly decreased (P<0.05). Compared with the Model group, GCs improved the behavioral performance of CIRI model rats, reduced the infarct size, inhibited cell apoptosis, downregulated the expression of Bax and caspase-3 (P<0.05), and up-regulated the expression of Bcl-2/Bax (P<0.05). Conclusion GCs have a neuroprotective effect on CIRI, and may play a role in inhibiting cell apoptosis by regulating the expression of the apoptosis-related factors Bax, Bcl-2, and caspase-3. Keywords glycosides of cistanche; cerebral ischemia reperfusion injury; apoptosis; middle cerebral artery occlusion
Materie prime a base di cistanche di alta qualità per lesioni cerebrali di ischemia-riperfusione
Ictus ischemicorappresenta circa l'80% di tutti i colpi ed è una delle principali malattie che minacciano la salute umana [1-3]. La lesione cerebrale dell'ischemia-riperfusione (CIRI) è una complicazione che si verifica dopo terapia di riperfusione come trombolisi endovenosa e trombectomia arteriosa perIctus ischemico[4-5]. Il CIRI può portare a grave disfunzione neurologica e morte neuronale irreversibile. Pertanto, è fondamentale trovare un piano di trattamento efficace che si concentra sulla neuroprotezione.
Cistanche Deserticola è un prezioso materiale medicinale locale prodotto principalmente nella Mongolia interna. Ha gli effetti della reintegrazione di Qi e sangue, nutrimento di yin e reni e regolare la funzione intestinale. I glicosidi di cistanche (GCS) sono i principali componenti estratti di cistanche deserticola, che può giocare uno stress antiossidativo,Ictus ischemico, inibire l'apoptosi cellulare eIctus ischemico[6]. Gli studi hanno dimostrato che i GC migliorano le funzioni di apprendimento e cognitive dell'AD riducendo l'accumulo di radicali liberi e inibendo l'apoptosi cellulare [7]; I GC promuovono l'angiogenesi e il rimodellamento neurale, mantengono l'integrità della barriera emato-encefalica e quindi migliorano il CIRI [8]. Tuttavia, non è ancora chiaro se GCS possa migliorare il CIRI regolando l'apoptosi cellulare per alleviare i deficit neurologici. Pertanto, questo studio mira a esplorare se i GC hanno un effetto neuroprotettivo su CIRI e se possono migliorare il CIRI regolando l'apoptosi cellulare, rivelare il loro potenziale valore di applicazione nella prevenzione e trattamento del CiRI e fornire una base teorica e sperimentale per il trattamento di CIRI con GCS.
1 Materiali e metodi
1.1 Animali sperimentali
Sessanta SPF maschio 6- mesi Wistar Rats (250-280 g) sono stati acquistati da Beijing Sibeifu Biotechnology Co., Ltd. [Scxk (Pechino) 2024-0001]. Tutti gli animali sperimentali furono tenuti nella stanza degli animali standardizzati del Centro di esperimenti sugli animali del Baotou Medical College of Inner Mongolia University of Science and Technology [SCXK (Mongolia) 2018-0001], con una temperatura di 20-24 grado, un'umidità del 50%-60%, e una condizione di luce alternante ogni 12 ore. Avevano libero accesso a cibo e acqua. Questo esperimento è conforme agli standard sperimentali di etica degli animali del Baotou Medical College [Baoyi Lunshen 2022 No. (60)]. Il principio del 3R è stato seguito durante il processo di alimentazione e sperimentale e è stata data la cura umana.
1.2 Reagenti e strumenti principali
I glicosidi totali di Cistanche Deserticola sono stati acquistati da Baoji Cosmai Plant Polisaccaride Development Co., Ltd. (numero di lotti di produzione: KM20220609011), con un contenuto di glicoside totale superiore all'85%. I GC possono essere completamente sciolti in acqua distillata e preparati in una dose di 50 mg/kg e il volume di somministrazione viene calcolato in base al peso animale. Soluzione di colorazione TTC (G3005), kit di colorazione NISSL (G1434), soluzione di lisi RIPA ad alta efficienza (R0010), soluzione luminescente ECL Plus ultra sensibile (PE0010), soluzione di preparazione del gel al 30% (A1010), elettroforesi tampone (T1070), soluzione di trasferimento (D1060) Marker di proteina ad ampio spettro (PR1910), tampone di carico proteico (P1015), ecc. Sono stati acquistati da Solebao; Il kit immunohistochemistry (pv -9000) e pbs buffer powder (zli -9062) sono stati acquistati da Beijing Zhongshan Jinqiao; Il kit di rilevamento delle proteine BCA (23227) è stato acquistato da Thermo Scientific; Bax (50599-2- ig), bcl -226593-1- AP) anticorpi, anticorpi secondari anti-rabbit di capra (sa 00001-2) sono stati acquistati da ProteIntech; Caspase -3 (AF6311) è stato acquistato da affinità; -Actina (52901) è stata acquistata da SAB.
Thread Plug (2636) è stato acquistato da Beijing Xinong Technology Co., Ltd.; Slicer (Leica, Germania); Microscopio ottico (Leica, Germania); Open Field Experimental Box (Shanghai Xinruan); Pipette (Eppendorf, Germania); Sistema di imaging microscopico (Leica, Germania); Strumento di elettroforesi (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.); Shaker (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.); Imaging in gel proteico
Sistema analitico (Tanon Technology, Shanghai); Microplate Reader (Thermo Fisher, USA).
1.3 Metodi sperimentali
1.3.1 Preparazione del modello animale
Il modello di occlusione dell'arteria cerebrale centrale del ratto (MCAO) è stato stabilito dal metodo di sutura zea-longa modificato [9]. Dopo la pesatura, i ratti sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di 2% di sodio pentobarbital (50 mg/kg). Dopo che gli animali sono stati completamente anestetizzati, sono stati fissati sul tavolo operativo in posizione supina. Dopo che il collo è stato rasato, è stato disinfettato con lo iodio. Un'incisione della linea mediana è stata leggermente fatta a sinistra e la fascia e i muscoli sono stati strati senza mezzi termini per strato per evitare danni ai nervi, ai vasi sanguigni e ai muscoli circostanti. First, find the left common carotid artery, separate the common carotid artery and its vagus nerve, use 4-0 suture to ligate the proximal end of the left common carotid artery, then gently separate the left internal carotid artery and the left external carotid artery along the common carotid artery upward, clamp the external carotid artery and the internal carotid artery with an artery clamp, cut a small incision obliquely on the left common carotid artery to insert the thread plug, and after the thread plug passes through the common carotid artery to the internal carotid artery, gently release the artery clamp to allow the thread plug to pass, and the thread plug goes along the internal carotid artery and then reaches the middle cerebral artery, and fix the thread plug with suture, and pull out the thread plug after 2 hours to achieve reperfusion, and finally Sutura l'incisione e disinfettare con lo iodio.
1.3.2 raggruppamento di animali sperimentali
Sono stati selezionati un totale di 59 ratti per questo studio, di cui 12 sono stati selezionati casualmente come gruppo operativo sham e i restanti 47 sono stati usati per preparare il modello MCAO. Dopo la preparazione del modello, 7 ratti sono morti e 4 ratti non sono riusciti a preparare il modello. I restanti 36 ratti sono stati divisi casualmente nel gruppo modello e nel gruppo di somministrazione del farmaco, ovvero i ratti sono stati divisi casualmente nei seguenti 4 gruppi (12 ratti/gruppo), gruppo operativo sham, gruppo modello, glicosidi totali del gruppo di cistanche deserticola (GCS, 50 mg/kg) e gruppo nimodipino (NIM, 20 mg/kg). Il gruppo sham ha subito la stessa operazione chirurgica del gruppo modello, ma senza legatura vascolare e inserzione del tappo di filo; Il gruppo modello e ciascun gruppo di somministrazione di droga hanno stabilito il modello cerebrale di ischemia-riperfusione e la somministrazione intragastrica continua è iniziata 24 ore dopo l'intervento chirurgico per 14 giorni. Nell'inizio è stato condotto un esperimento preliminare per esplorare l'effetto dose di GC, che erano 25 mg/kg, 50 mg/kg e 100 mg/kg. I risultati hanno mostrato che la dose di 50 mg/kg era la migliore, quindi 50 mg/kg sono stati selezionati in questo esperimento.
1.3.3 Punteggio della funzione neurologica
Tutti i ratti in questo esperimento sono stati valutati utilizzando il metodo di punteggio del modello MCAO internazionale (metodo di punteggio di Zea-Longa) [9]. I ratti con punteggi da 1 a 3 sono stati selezionati da ciascun gruppo per esperimenti successivi e sono stati esclusi i ratti del modello con punteggi di 0 e 4. I criteri di punteggio sono i seguenti:
1.3.4 Esperimento di rimozione dell'adesivo
Una lunga striscia di nastro adesiva di 1,2 cm × 2. 0 cm era attaccata alla prefigurare del ratto. Dopo la stimolazione tattile, il ratto ha strappato l'adesivo con i denti. Gli animali sperimentali hanno ricevuto un allenamento per la rimozione dell'adesivo 3 giorni prima dell'intervento, con l'allenamento due volte al giorno. I ratti che potrebbero strappare l'adesivo entro 30 s sono stati selezionati per entrare in ciascun gruppo. Il tempo per i ratti di strappare l'adesivo è stato testato prima dell'intervento e la media dei tre risultati è stata presa come valore di base. Il tempo per i topi di strappare l'adesivo è stato registrato in ciascun gruppo 14 giorni dopo la chirurgia MCAO. Il punteggio di topi che non ha morso l'adesivo entro 120 s o non ha potuto strappare l'adesivo è stato registrato come 120 s.
1.3.5 esperimento di raggio di bilanciamento
Il raggio di equilibrio è stato fatto per 150 cm di lunghezza, 4 cm di larghezza e 3 cm di altezza. L'altezza del raggio di equilibrio era di 80 cm da terra e supportata da cornici di legno ad entrambe le estremità. Un'estremità del raggio di bilanciamento è stata definita come il punto di partenza e l'altra estremità come punto finale. Una gabbia di ratto è stata posizionata dietro il punto finale. Un tappetino lungo 1 m, largo 1 m e spesso 12 cm è stato posizionato sotto il raggio di bilanciamento per evitare che il ratto diminuisca. All'inizio dell'esperimento, il ratto è stato posto nel punto di partenza, di fronte alla direzione della gabbia, e è stato registrato il tempo impiegato dal ratto per attraversare l'intero raggio di equilibrio. I ratti in ciascun gruppo hanno ricevuto una formazione 3 giorni prima dell'intervento, 3 volte al giorno. Il tempo impiegato dal ratto per attraversare il raggio di equilibrio è stato registrato prima dell'intervento e il tempo impiegato per i topi di ciascun gruppo per attraversare il raggio di equilibrio è stato registrato 1 giorno, 2 giorni, 3 giorni, 7 giorni e 14 giorni dopo la chirurgia MCAO. Il tempo massimo consentito per camminare attraverso la barra orizzontale era di 120 s.
1.3.6 Esperimento sul campo aperto
Metti ogni gruppo di animali sperimentali in una scatola sperimentale a campo aperto e usa il software di analisi comportamentale per registrare la traiettoria dell'attività e la distanza di movimento dei ratti entro 5 minuti. L'ambiente deve essere silenzioso durante l'esperimento e l'attrezzatura sperimentale viene cancellata con acqua pulita e alcol tra due esperimenti per impedire alle informazioni residue dei precedenti animali sperimentali di influenzare i risultati del prossimo esperimento.
1.3.7 colorazione TTC
Dopo l'esperimento, i ratti sono stati pesati e anestetizzati dall'iniezione intraperitoneale. Successivamente, i topi furono uccisi e il cervello furono eliminati. I tessuti cerebrali sono stati sciacquati con soluzione salina e posizionati a -20 gradi per 30 minuti per tagliare. Il cervello era diviso in 5 fette in posizione coronale. Le fette cerebrali tagliate sono state posizionate in soluzione di colorazione TTC preriscaldata e colorate in un bagno d'acqua a 37 gradi dalla luce per 30 minuti. Dopo la colorazione, sono stati fissati con paraformaldeide al 4%. Le fette di tessuto cerebrale fisso sono state messe in ordine e fotografate. Sono stati eliminati animali con coaguli di sangue alla base del cranio e della trombosi dell'anello arterioso. Il software di analisi delle immagini Pro-Plus (IPP) di immagini è stato utilizzato per calcolare l'area dell'infarto cerebrale. Il rapporto area di infarto/%=la somma delle aree di infarto di ciascuna sezione/la somma delle aree di ciascuna sezione × 100% [10].
1.3.8 colorazione Nissl
Dopo che il tessuto cerebrale è stato fissato con paraformaldeide al 4%, è stato disidratato con alcol gradiente, reso trasparente con xilene e completamente immerso in cera in un bagno di paraffina e il tessuto cerebrale era incorporato nella paraffina. Lo spessore delle sezioni di paraffina era di 5 µm. Le sezioni di paraffina sono state collocate in sequenza in xilene, alcool a gradiente e lavate con acqua distillata per 5 minuti. Le sezioni sono state collocate nella soluzione di colorazione NissL preparata in anticipo e colorata a 60 gradi per 40 minuti. Le sezioni sono state differenziate in alcol al 95% e la differenziazione è stata osservata al microscopio. La differenziazione è stata fermata quando lo sfondo era azzurro e i corpi Nissl erano chiaramente colorati. Le sezioni sono state disidratate in etanolo anidro, rese trasparenti con xilene e sigillate con gomma neutra. Dopo che le sezioni sono state essiccate, la morfologia delle cellule nervose è stata osservata al microscopio e le immagini sono state raccolte e analizzate scattando foto nel sistema di acquisizione delle immagini.
1.3.9 colorazione immunoistochimica
Disidratazione di routine del tessuto cerebrale, incorporamento, sezionamento, deidastica in acqua, riparazione del calore dell'antigene a microonde ad alta pressione, lavaggio PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta, bloccante perossidasi endogeno aggiunto, incubato a temperatura ambiente per 10 minuti, lavaggio PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta. Incubazione dell'anticorpo primario, 4 gradi durante la notte, si risveglia a temperatura ambiente per 30 minuti, lavaggio PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta, soluzione di miglioramento della reazione aggiunta, incubata a 37 gradi per 25 minuti, lavaggio PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta, a livello di elaboraggio a etichetta di enzima ogni volta Min, lavaggio dell'acqua del rubinetto, controcolorazione dell'ematossilina, disidratazione ascendente per etanolo, trasparente di xilene e sigillatura.
1.3.10 colorazione TUNEL
Dewax Le sezioni di paraffina per acqua, girare asciugare le sezioni, aggiungere una soluzione di lavoro della proteinasi K, incubare a 37 gradi per 25 minuti, lavarsi con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta, aggiungere una soluzione di permeabilizzazione della membrana, incubare a temperatura ambiente per 20 minuti, lavarsi con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta, aggiungere soluzione di reazione al tunel, mescolare secondo TDT enzyme: dutp: buffer {buffer {buffer {buffer {buffer {buffer {buffer {buffer {buffer {buffer {buffer {buffer {buffer {buffer {b 50, incubare a 37 gradi per 1 ora, lavarsi con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta, aggiungere una soluzione di colorazione DAPI, incubare a temperatura ambiente al buio per 10 minuti, lavarsi con PBS 3 volte, 5 minuti ogni volta, sigillare le sezioni con quencher antifluorescenza, osservare e raccogliere immagini sotto un microscopio a fluorescenza.
1.3.11 Occidentale macchia
Dopo aver aggiunto il tessuto cerebrale al tampone di lisi delle proteine, il tessuto cerebrale era completamente macinato con una bordo di macinazione e la proteina è stata rotta ultrasonicamente più volte in un bagno di ghiaccio. Il surnatante è stato centrifugato per 15 minuti a bassa temperatura ultracentrifuga. Il surnatante è stato estratto e la concentrazione è stata determinata usando un kit BCA. Il tampone di carico delle proteine è stato aggiunto e collocato in un bagno in metallo di 100 gradi per la denaturazione per 5 minuti. Sono stati preparati gel di concentrazione e gel di separazione e 20 UG di campione sono stati aggiunti a ciascun pozzetto per l'elettroforesi. Dopo l'elettroforesi, la membrana è stata trasferita a una portata costante per 2,5 ore e la polvere di latte scremata al 5% è stata bloccata a temperatura ambiente per 2 ore; L'anticorpo primario è stato agitato a 4 gradi durante la notte e l'anticorpo secondario è stato incubato a temperatura ambiente per 2 ore; Le bande sono state scansionate e analizzate utilizzando un sistema di analisi di imaging.
1.4 Metodi statistici
Tutti i risultati sperimentali sono stati espressi in media ± deviazione standard (X S) e l'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 9.5. L'anona a senso unico è stato utilizzato per confrontare i dati di ciascun gruppo e il test t o test non parametrico è stato utilizzato per il confronto a coppie all'interno del gruppo. P <0. 05 indicava differenze statisticamente significative.
