Effetti protettivi dell'acido alfa-lipoico contro la 5-mucosite gastrointestinale indotta da fluorouracile nei ratti Parte 1

Astratto: L'acido alfa-lipoico (ALA) è ampiamente utilizzato nelle formule multivitaminiche e nei prodotti antietà. Lo scopo di questo studio era di indagare i potenziali benefici protettivi dell'ALA sulla mucosite gastrointestinale indotta da 5-fluorouracile (5-FU) nei ratti albini Wistar. I tessuti dello stomaco, dell'intestino tenue e crasso sono stati asportati e sono stati ottenuti sieri di sangue per identificare indici biochimici come TNF-, IL-1, MDA, GPx, SOD, MMP-1, {{ 8}}, -8 e TIMP-1. È stato inoltre eseguito uno studio istopatologico. I risultati hanno rivelato livelli elevati di TNF-, IL-1, MDA, MMP-1, -2, -8 e TIMP-1 sia nei tessuti che nel siero e questi valori sono diminuiti drasticamente dopo il trattamento con ALA. Le attività ridotte di SOD e GPx nei gruppi con mucosite sono state invertite nei gruppi trattati con ALA. Il danno prodotto dalla mucosite nello stomaco e nell'intestino tenue è regredito nel gruppo trattato con ALA, secondo la valutazione istopatologica. Di conseguenza, l'implementazione dell'integrazione di ALA nella terapia con 5-FU può fungere da intervento protettivo per i pazienti oncologici con mucosite gastrointestinale. Alla luce dei risultati, l'ALA, un antiossidante di origine alimentare con proprietà pleiotropiche, può essere un trattamento efficace per la 5-mucosite gastrointestinale indotta da FU e prevenire lo stress ossidativo, l'infiammazione e il danno tissutale nei pazienti oncologici che ricevono {{ 24}}Terapia FU.

Il glicoside di cistanche può anche aumentare l'attività della SOD nei tessuti del cuore e del fegato e ridurre significativamente il contenuto di lipofuscina e MDA in ciascun tessuto, eliminando efficacemente vari radicali reattivi dell'ossigeno (OH-, H₂O₂, ecc.) e proteggendo dai danni al DNA causati da radicali OH. I glicosidi feniletanoidi di Cistanche hanno una robusta capacità di scavenging dei radicali liberi, una maggiore capacità di riduzione rispetto alla vitamina C, migliorano l'attività della SOD nella sospensione dello sperma, riducono il contenuto di MDA e hanno un certo effetto protettivo sulla funzione della membrana dello sperma. I polisaccaridi Cistanche possono migliorare l'attività di SOD e GSH-Px negli eritrociti e nei tessuti polmonari di topi sperimentalmente senescenti causati dal D-galattosio, nonché ridurre il contenuto di MDA e collagene nei polmoni e nel plasma e aumentare il contenuto di elastina, hanno un buon effetto scavenging su DPPH, prolunga il tempo di ipossia nei topi senescenti, migliora l'attività della SOD nel siero e ritarda la degenerazione fisiologica del polmone nei topi senescenti sperimentalmente Con la degenerazione morfologica cellulare, gli esperimenti hanno dimostrato che Cistanche ha la buona capacità antiossidante e ha il potenziale per essere un farmaco per prevenire e curare le malattie dell'invecchiamento cutaneo. Allo stesso tempo, l'echinacoside in Cistanche ha una significativa capacità di eliminare i radicali liberi DPPH e può eliminare le specie reattive dell'ossigeno, prevenire la degradazione del collagene indotta dai radicali liberi e ha anche un buon effetto riparatore sul danno dell'anione dei radicali liberi della timina.

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1. Introduzione

L'acido alfa-lipoico (ALA) è presente in una vasta gamma di alimenti, comprese le verdure (spinaci, broccoli, pomodori) e le carni (soprattutto le viscere), nonché in diversi integratori alimentari [1,2]. L'ALA ha numerosi effetti antiossidanti, tra cui l'attivazione di meccanismi antiossidanti endogeni e la chelazione di ioni metallici come ferro, zinco e rame [3,4]. In quanto molecola organosulfur, l'ALA può eliminare le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e potenziare l'attività degli enzimi antiossidanti tissutali come la glutatione perossidasi (GPx) e la superossido dismutasi (SOD) [5-7]. A causa delle sue proprietà antiossidanti, è stato scoperto che l'ALA riduce la morte cellulare ALA-dipendente nel cancro del polmone [8], nel cancro al seno [9] e nel cancro del colon [10]. Inoltre, ricerche precedenti hanno dimostrato che l'ALA possiede proprietà antinfiammatorie [11-16]. L'ALA lavora per ridurre l'infiammazione modulando l'espressione di citochine infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF-) e l'interleuchina-1 (IL-1) [17,18]. I benefici farmacologici dell'ALA sono stati dimostrati in un'ampia varietà di campi correlati alla medicina, inclusi i modelli cardiovascolari, neuroprotettivi, cognitivi e anti-invecchiamento [19].

Il cancro è la principale causa di mortalità in ogni paese e uno dei principali ostacoli alla longevità [20]. Gli effetti collaterali dei farmaci chemioterapici sono uno dei più importanti fattori debilitanti nella lotta contro il cancro e la mucosite è una delle malattie più diffuse riscontrate nei pazienti oncologici [21]. La mucosite è una condizione infiammatoria patologica caratterizzata da ulcerazione e infiammazione della mucosa del sistema gastrointestinale [22]. La mucosite aumenta l'uso di analgesici oppioidi a causa del dolore e accelera la transizione alla nutrizione parenterale totale a causa di problemi nutrizionali [23]. La mucosite e le difficoltà correlate alla mucosite diminuiscono la qualità della vita del paziente, mentre lo sviluppo di condizioni potenzialmente letali e le risposte negative alla terapia sono motivo di preoccupazione a causa dello scarso trattamento delle lesioni [24].

Il farmaco chemioterapico più utilizzato nelle neoplasie gastrointestinali è l'analogo della pirimidina 5-fluorouracile (5-FU). Il 5-FU esercita i suoi effetti antitumorali inibendo la timidilato sintasi (TS) e integrando i suoi metaboliti nell'RNA e nel DNA [25]. Tuttavia, questo agente induce mucosite gastrointestinale, un grave effetto collaterale debilitante [26]. In particolare, la degradazione dell'equilibrio ossidante-antiossidante, un aumento dei livelli di citochine pro-infiammatorie e l'attività degli enzimi proteolitici giocano un ruolo importante nello sviluppo di questi effetti avversi. Sebbene farmaci antiossidanti e antinfiammatori siano stati utilizzati nel tentativo di affrontare questo problema, deve ancora essere identificato un metodo terapeutico particolarmente robusto [27,28].

Ad oggi, diversi studi hanno riportato l'uso di 5-FU e ALA insieme in diversi tipi di cancro; questi includono tumori cervicali e colorettali [29,30]. Inoltre, i farmaci ausiliari che potrebbero essere incorporati nelle procedure terapeutiche per prevenire nei pazienti oncologici gli effetti avversi della mucosite gastrointestinale indotti da 5-FU sarebbero vantaggiosi. Pertanto, lo scopo di questo studio era determinare gli effetti biologici dell'utilizzo di ALA nei ratti con un modello di mucosite creato da 5-FU, oltre a esaminare il suo possibile utilizzo come agente candidato nei protocolli di trattamento.

2. Materiali e metodi

2.1. Animali

Gli animali sono stati prelevati dalle unità di esperimenti sugli animali della Near East University. I ratti (Wistar albino, entrambi i sessi) sono stati mantenuti sotto un ciclo buio/luce di 12:12 h dall'inizio a una temperatura ambiente di 22 ± 2 ◦C in una struttura a umidità controllata (50 ± 5%). L'alimentazione era ad libitum senza alcuna restrizione al cibo per topi standard e all'acqua potabile. I ratti sono stati alloggiati in una gabbia di plexiglass (4 ratti per gabbia con dimensioni di 60 × 40 × 40 cm). Il protocollo di studio è stato autorizzato dal comitato etico per gli esperimenti sugli animali locali della Near East University (approvazione n. 2019/01 il 17 gennaio 2019 e 2020/11 il 27 novembre 2020) e le linee guida etiche menzionate nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e successive modifiche sono stati seguiti.

Trentadue ratti Wistar Albino di entrambi i sessi del peso di 200-250 g sono stati suddivisi in quattro gruppi di otto ratti ciascuno (n=8): gruppo di controllo, ALA, mucosite e mucosite più ALA. Il gruppo di controllo ha ricevuto solo soluzione salina intraperitoneale (ip) (SF) una volta al giorno per una settimana. Il gruppo ALA ha ricevuto solo ALA alla dose di 100 mg/kg ip una volta al giorno per una settimana dal giorno 1 [31,32]. Il gruppo Mucositis è stato trattato con SF (ip) il giorno 1 e 400 mg/kg 5-FU ip dal giorno 2 fino alla fine dell'esperimento [33]. Il gruppo Mucositis plus ALA ha ricevuto 100 mg/kg ip di ALA il giorno 1 e 400 mg/kg ip 5-FU il giorno 2. Quindi, la somministrazione di 100 mg/kg/die ip di ALA è stata continuata fino alla fine dell'esperimento . Gli animali sono stati monitorati per una settimana senza che si verificassero decessi durante quel periodo. Gli animali di tutti i gruppi sono stati soppressi alla fine del periodo di ricerca mediante la somministrazione di una combinazione di overdose di ketamina/xilazina. Le analisi di laboratorio sono state eseguite presso il Laboratorio diagnostico e il Laboratorio di istopatologia dell'Animal Hospital, Near East University.

2.2. Raccolta di campioni di sangue e tessuti

I campioni di sangue sono stati prelevati e inviati al laboratorio in provette con separatore di siero. I campioni di siero sono stati separati a 2000 × g per 10 minuti e mantenuti a -80 °C fino a ulteriori analisi. Per eliminare il sangue in eccesso, i tessuti dello stomaco, dell'intestino tenue e dell'intestino crasso sono stati raccolti e risciacquati con una soluzione tampone fosfato (pH=7.4). Quindi, dopo essere stati consegnati al laboratorio, sono stati sottoposti a procedura di omogeneizzazione. L'omogeneizzazione dei tessuti è stata eseguita secondo il protocollo del produttore utilizzando il tampone RIPA (articolo n. 10010263, lotto n. 0490889-1, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA) e il set di tritacarne Dounce (D8938, lotto 3110, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, USA) sul ghiaccio. Dopo l'omogeneizzazione, i campioni sono stati centrifugati a 1600 × g per 10 minuti a più 4 °C. La tecnica di determinazione della proteina Bradford è stata utilizzata per quantificare i livelli proteici nei campioni di tessuto e i supernatanti sono stati quindi congelati a -80 °C per le successive indagini.

2.3. Misurazioni degli indici biochimici

Attività di alanina transaminasi (ALT), aspartato transaminasi (AST), fosfatasi alcalina (ALP), lattato deidrogenasi (LDH), lipasi (LIP), amilasi (AMY), creatinina, azoto ureico nel sangue (BUN), proteine ​​totali (TP) e i livelli di albumina sono stati misurati come indici biochimici in campioni di siero utilizzando un analizzatore di chimica clinica BS-240 VET automatizzato (Mindray, Shenzhen, Cina).

2.4. Misurazione delle citochine nei sieri e nei tessuti

Le concentrazioni di TNF- e IL-1 nei sieri e nei campioni di tessuto sono state misurate utilizzando i kit di analisi ELISA (ELISA) disponibili in commercio (ELR-TNF- e ELR-IL1 -, RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, USA) seguendo le istruzioni del produttore.

2.5. Misurazione delle metalloproteinasi della matrice (MMP) e degli inibitori tissutali delle metalloproteinasi-1 (TIMP-1) nei sieri e nei tessuti

MMP e TIMP-1, che sono coinvolti in una varietà di processi biologici, come il cancro e l'infiammazione, sono stati misurati sia negli omogenati tissutali che nei sieri utilizzando le istruzioni del produttore e le raccomandazioni dei test ELISA specifici per ratto disponibili in commercio (MMP{ {2}} E-EL-R0617; Elabscience, Wuhan, Cina; MMP-2 ELR-MMP2; MMP-8 ELR-MMP8; TIMP-1 ELR-TIMP-1 RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, USA). Le concentrazioni sieriche di MMP e TIMP-1 sono state espresse come pg/mL, mentre i livelli tissutali sono stati espressi come proteina pg/mg.

2.6. Misurazione di malondialdeide (MDA), GPx e SOD nei tessuti

I livelli di MDA nei tessuti sono stati valutati utilizzando kit di analisi disponibili in commercio per determinare lo stato di perossidazione lipidica (TBARS Assay Kit, articolo n. 10009055, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA). Il principio di misurazione si basa sulla reazione con l'acido tiobarbiturico (TBA) in acqua bollente per 60 minuti in un mezzo acido e sulla misurazione dell'assorbanza della miscela di reazione a 532 nm (Ohkawa et al., 1979). Per misurare l'assorbanza è stato utilizzato un lettore di micropiastre modulabile VersaMax (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). Le concentrazioni di MDA nei tessuti sono state espresse come nmol MDA/mg di proteina.

Nei tessuti, l'attività di GPx e SOD è stata valutata utilizzando kit di analisi pronti all'uso. (RANSEL RS505, RANSOD SD125, Randox Laboratories Ltd., Crumlin, Regno Unito) utilizzando un analizzatore di chimica clinica VET BS-240 automatizzato (Mindray, Shenzhen, Cina). Le quantità di GPx e SOD nei campioni di tessuto (stomaco, intestino tenue e intestino crasso) sono state espresse come proteine ​​U/mg.

2.7. Valutazione istopatologica

I tessuti dello stomaco, dell'intestino tenue e dell'intestino crasso ottenuti immediatamente dopo il periodo sperimentale sono stati fissati in formalina neutra all'10 percento (v/v) per 24 ore a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, i tessuti sono stati posizionati su un dispositivo di tracciamento dei tessuti, Leica TP1020 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germania). I tessuti prelevati dal dispositivo di tracciamento dei tessuti sono stati quindi incorporati in paraffina. Sezioni di 5- µm di spessore sono state tagliate dai tessuti con l'aiuto di un microtomo Leica RM2255 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germania) ed è stata eseguita la colorazione di routine con ematossilina ed eosina (HE). Le sezioni sono state esaminate istomorfologiche con un microscopio ottico Leica DM500 abbinato al sistema di analisi delle immagini digitali integrato Leica Microsystem Framework (Leica Application Suite versione 3.0 serie 38132019, Leica ICC50 HD, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nußloch, Germania).

2.8. Analisi statistiche

Il software GraphPad Prism è stato utilizzato per l'analisi statistica (versione 7.04, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). I dati sono stati tutti espressi come media ± deviazione standard (X ± DS). È stato utilizzato un test di analisi della varianza (ANOVA) per confrontare i gruppi di dati, seguito dal test di confronto multiplo di Tukey. Inoltre, il test Kruskal-Wallis è stato utilizzato per confrontare i punteggi istomorfologici tra i gruppi. Una differenza di p <0,05 è stata considerata statisticamente significativa.

3. Risultati

3.1. ALA influisce positivamente sugli indici biochimici

La tabella 1 mostra l'attività degli enzimi sierici e le concentrazioni dei metaboliti. Rispetto al gruppo di controllo, il gruppo con mucosite presentava livelli sostanzialmente più elevati di albumina, ALT, AST, ALP, LDH, amilasi, lipasi, azotemia, creatinina e TP (p <0.05 –0.0001). Tuttavia, c'era una differenza significativa nei livelli di albumina, AST, ALT, ALP, LDH, BUN, creatinina, amilasi, BUN e creatinina tra il gruppo ALA più Mucosite e il gruppo Mucosite (p <0,05-0,001). Anche i livelli di ALP, ALT, AST, LDH e amilasi erano sostanzialmente diversi tra i gruppi Mucositis e ALA (p <0,05–0,0001). Di conseguenza, i livelli degli enzimi epatici, degli enzimi pancreatici e dei metaboliti sono stati osservati drasticamente ridotti nel gruppo Mucositis quando l'ALA è stato aggiunto al trattamento.

3.2. ALA diminuisce la produzione di citochine pro-infiammatorie

I livelli delle citochine pro-infiammatorie TNF- e IL-1 nei campioni di siero, stomaco, intestino tenue e crasso possono essere visualizzati nella Figura 1. I livelli di TNF- e IL-1 nei sieri e in tutti i tessuti degli animali nel gruppo Mucositis erano significativamente più alti rispetto ai gruppi Controllo, ALA e Mucositis plus ALA (p < 0.05–0.0{ {17}}{{20}}1). Tuttavia, i livelli di TNF- e IL-1 nel siero e in tutti i tessuti si sono ridotti significativamente nel gruppo Mucosite più ALA rispetto al gruppo Mucosite (p < 0.05–0.0001). Tra i gruppi Controllo e Mucosite più ALA, c'era una sostanziale differenza nei livelli di TNF- nell'intestino tenue e crasso. (p<0,01). C'erano anche differenze significative nei livelli di TNF nell'intestino tenue e crasso tra i gruppi ALA e Mucositis plus ALA. (p <0,01, p <0,001, rispettivamente). Inoltre, c'erano differenze statisticamente significative tra i gruppi Controllo e Mucosite più ALA in termini di livelli di IL-1 nello stomaco (p < 0,05). Pertanto, l'ALA sembrava sopprimere significativamente i livelli di citochine pro-infiammatorie nella mucosite.

3.3. Il trattamento con ALA riduce la perossidazione lipidica e aumenta l'attività degli enzimi antiossidanti nei tessuti

I livelli di MDA, GPx e attività SOD sono stati quantificati per valutare la perossidazione e lo stato antiossidante a livello tissutale (Figura 2). I livelli di MDA nello stomaco, nell'intestino tenue e nell'intestino crasso del gruppo Mucositis erano significativamente più alti rispetto ai gruppi Controllo, ALA e Mucositis plus ALA (p <0.05–0 .0001). Inoltre, i livelli di MDA nell'intestino crasso del gruppo Mucositis plus ALA erano sostanzialmente diversi da quelli dei gruppi Controllo e ALA (p < 0,0001).

I ratti nei gruppi Controllo e ALA avevano livelli di SOD significativamente più alti in tutti i tessuti rispetto ai ratti nel gruppo Mucositis (p < {{0}}.05–0.{{8 }}{{10}}01). I livelli di SOD nei campioni di intestino crasso erano significativamente diversi nei gruppi ALA e Mucosite più ALA (p < 0,01). Nei campioni dello stomaco, i livelli di SOD erano significativamente più bassi nei gruppi ALA e Mucosite più ALA (p < 0,05). Inoltre, i livelli di SOD nell'intestino tenue dei ratti del gruppo Mucositis erano sostanzialmente inferiori ai livelli di SOD nel gruppo ALA (p < 0,05). Tuttavia, i livelli di SOD nello stomaco e nell'intestino crasso degli animali nei gruppi Mucositis e Mucositis plus ALA erano sostanzialmente diversi (p <0,05–0,0001).

3.4. Il trattamento con ALA aumenta i livelli di MMP tissutali e TIMP-1

Le attività MMP{{0}}, MMP-2, MMP-8 e TIMP-1 (Tabella 2) nel siero, nello stomaco, nell'intestino tenue e nell'intestino crasso erano significativamente più alto nel gruppo Mucosite rispetto ai gruppi Controllo e ALA (p <0.05–0.0001). L'aumento dei livelli di MMP-1, MMP-2, MMP-8 e TIMP-1 nei sieri e nello stomaco, nell'intestino tenue e nell'intestino crasso dei ratti con mucosite è stato significativamente soppresso in Mucosite plus ALA ratti (p < 0,05–0,0001), sebbene non vi fosse alcuna differenza significativa nei livelli sierici di MMP-8 tra i gruppi Mucositis plus ALA e Mucositis.