Effetti protettivi di Cistanche contro la degradazione del collagene dermico dei fibroblasti indotta da H2O2/UVB tramite la segnalazione TGF/Smad mediata da Hsa-microRNA-4535- Ⅱ

DISCUSSIONE

In questo studio, abbiamo identificato che ilruolo protettivo della cistancheè mediato attraverso l'attenuazione di hsa-miR- 4535 che prende di mira Smad4, regolando così la segnalazione Smad2/3/4 e la sintesi del collagene nella pelle esposta a H2O2/Danno dermico indotto da UVB in vitroEin vivo. I nostri risultati possono essere riassunti in sei punti principali: (1) cistanche attenuato H2O2senescenza delle cellule HS68 indotta ma non apoptosi alla dose di 30 µM; (2) h2O2/indotta da UVBintracellulare e mitocondrialel La formazione di ROS e lo squilibrio di MMP sono stati invertiti in seguitotrattamento cistanche; (3) cistanche ha migliorato significativamente la segnalazione TGF / Smad così come l'attivazione del complesso Samd2/3/4 in H2O2-cellule esposte; (4) sovraregolazione di hsa-miR-4535 da parte di H2O2/UVB è stato soppresso in seguitotrattamento cistanche; (5) hsa-miR- 4535 è coinvolto nella regolazione della segnalazione TGF /Smad tramiteindirizzare Smad4 alla sintesi di collagene compromessa in H2O2/cellule esposte ai raggi UVB; (6)applicazione topica di cistanchesulpelle dorsale di nudoi topi hanno ridotto significativamente i raggi UVB indottifotoinvecchiamento cutaneo,formazione di rughe, iperplasia cutanea, e la menomazionedelle vie di segnalazione TGF/Smad.

Figura 10. Effetto della cistanche sul fotodanneggiamento della pelle del topo nudo C57BL6/J indotto da UVB. (A) La procedura schematica degli esperimenti sugli animali. La pelle dorsale di topi nudi C57BL6/J di quattro settimane (n=6) ​​è stata esposta a radiazioni UVB e trattata con cistanche una volta ogni due giorni per 8 settimane (B) Fotografia che mostra la formazione di rughe sulla pelle dorsale di topi nudi topi a causa dell'esposizione ai raggi UVB, seguita dall'applicazione topica di cistanche.

Clicca qui per conoscere il trattamento Cistanche per ridurre la pelle Photodamage

Figura 11. L'applicazione topica di cistanche attenua i raggi UVB indottiiperplasia cutaneae degradazione del collagene nella pelle dorsale dei topi nudi C57BL6/J. I tessuti cutanei sono stati sezionati in serie e colorati con H&E, tricromia di Masson e immunoistochimicamente per p-Smad2/3 Smad4 e -gal. La colorazione H&E ha mostrato lo spessore epidermico. Le frecce rosse a due punte indicano l'ispessimento epidermico. La colorazione tricromica di Masson ha mostrato il contenuto di fibre di collagene negli strati dermici. Le fibre di collagene appaiono blu. LD, dose bassa; HD, dose elevata.

cistancheriferito, ha mostrato proprietà anti-apoptotiche e antiossidanti in varie cellule come cheratinociti e cardiomiociti [13, 39, 40]. La somministrazione orale di cistanche ha soppresso efficacemente il danno epatico indotto da streptozotocina nei ratti diabetici riducendo il danno ossidativo mitocondriale e migliorando la segnalazione antiossidante Nrf2 [13, 41]. Altri studi hanno dimostrato che la cistanche ha migliorato l'epatotossicità indotta da ciclofosfamide e la nefrotossicità indotta da cisplatino attenuando lo stress ossidativo e l'infiammazione [42, 43]. L'esposizione dei fibroblasti dermici a UVB o H2O2 provoca l'accumulo di ROS nei mitocondri, portando alla frammentazione dei mitocondri e all'invecchiamento cellulare [44]. Uno studio precedente ha dimostrato che i mitocondri frammentati compromettono la produzione di collagene [45]. Il nostro studio ha indicato che la cistanche possiede una capacità di scavenging dei radicali per prevenire lo squilibrio del potenziale della membrana mitocondriale indotto da ROS e l'accumulo di ROS nelle cellule indotte da UVB e H2O2-. (Figura 3A-3C). Studi recenti hanno riportato che i fibroblasti dermici sono responsabili dell'organizzazione di un ambiente ricco di ECM,

Figura 12. Effetti di cistanche sulla segnalazione TGF /Smad e sull'espressione hsa-miR-4535 nei topi irradiati con UVB. (A e B) i livelli di mRNA di hsa-miR-4535 e Smad4 dalla pelle dorsale di topi esposti a UVB sono stati rilevati mediante qRT-PCR. (C) I livelli proteici di TGF, p-smad2/3 e Smad4 nei tessuti della pelle dorsale sono stati rilevati mediante western blotting. -tubulina è stata utilizzata come controllo del carico. I dati sono presentati come media ± SD. Viene mostrata la quantificazione dei risultati; *P < 0.05, **P < 0.01 rispetto al gruppo di controllo del veicolo; #P <0,05, ##P <0,01 rispetto a UVB più gruppo di veicoli.

costituito prevalentemente da collagene di tipo I e III [46]. L'omeostasi del collagene di tipo I e III è essenzialmente responsabile del mantenimento del supporto strutturale e meccanico della pelle [47]. Prove emergenti hanno suggerito che durante l'invecchiamento vengono generati abbondanti ROS, con conseguente progressiva perdita di fasci di collagene negli strati dermici e, quindi, contribuendo alla formazione di rughe a causa della compromissione della via TGF/Smad e dell'elevata espressione di MMP [48, 49].mediato da cistanchel'attivazione della segnalazione TGF/Smad produce collagene che mantiene l'integrità della pelle. Tuttavia, ha effetti diversi nelle cellule tumorali; nel cancro al fegato,trattamento cistancheha inibito la proliferazione delle cellule HepG2 attivando la segnalazione TGF/Smad [50]. Al contrario, la cistanche ha inibito la segnalazione TGF/Smad così come inattivato Smad3 con conseguente inibizione della crescita nelle cellule tumorali della prostata e del pancreas [51]. Tuttavia, il ruolo di cistanche nella segnalazione TGF/Smad infibroblasti dermici cutaneirimasto sconosciuto. Qui, abbiamo osservato che l'espressione di COL1A1 e COL3A1 sovraregolata da cistanche era sottoregolata nelle cellule trattate con H2O2/UVB attraverso l'attivazione della segnalazione TGF/Smad (Figura 4A-4C, 8E, 9A). Inoltre, l'induzione di MMP-1 da parte di H2O2/UVB è stata invertita dopo il trattamento con cistanche (Figura 4A, 9A). I nostri risultati indicano che la cistanche protegge i fibroblasti dermici dal danno indotto da H2O2/UVB attivando la segnalazione TGF/Smad e inducendo la produzione di collagene.

Sviluppo del collagene del derma cutaneoè un processo fisiologico complicato e la regolazione mediata da microRNA ha dimostrato di contribuire al rimodellamento e all'organizzazione dell'ECM [23, 52, 53]. Collagene, elastina e acido ialuronico (HA) sono le tre principali proteine ​​che mantengono l'integrità della pelle. Prove sempre più numerose suggeriscono che diversi microRNA sono coinvolti nell'invecchiamento cutaneo attraverso la regolazione dell'ECM. miR-181a è stato sovraregolato nei fibroblasti dermici umani senescenti e ha consentito al collagene XVI di modulare i componenti della MEC [54]. È interessante notare che un'elevata espressione di miR-23a-3p potrebbe indurre la senescenza dermica sopprimendo direttamente la ialuronano sintasi 2, uno degli isoenzimi transmembrana HA sintasi che sintetizzano l'HA [21]. Recentemente, è stato riportato che vari composti naturali attenuano l'invecchiamento cutaneo cutaneo attraverso la regolazione del microRNA [55-57]. Inoltre, secondo quanto riferito, il cistanche è stato coinvolto nella regolazione del microRNA nel colangiocarcinoma e nel carcinoma epatocellulare e ha causato la soppressione della crescita cellulare e delle metastasi [58, 59]. Finora, nessuno studio ha identificato il meccanismo molecolare, come la regolazione del microRNA, intrattato con cistanchecellule di fibroblasti dermici della pelle umana. Qui, abbiamo analizzato i profili dell'array di microRNA per identificare diversi microRNA che differivano tra controllo e 30 µMtrattato con cistanchegruppi (Figura 5A). Utilizzando i database miRDB e TargetScanHuman, abbiamo previsto Smad4 come hsa-miR-4535bersaglio mRNA (Figura 5B). L'espressione di hsa-miR-4535 è stata sottoregolata in seguito al trattamento con cistanche nelle cellule indotte da H2O2/UVB (Figura 6C, 9B). Al contrario, l'espressione del suo bersaglio, mRNA-Smad4, è stata significativamente inibita nelle cellule esposte a H2O2/UVB e aumentata dopo il trattamento con cistanche (Figura 6D, 9C). Una varietà di studi ha indicato che i ROS agiscono come fattori di trascrizione stimolanti intermedi indotti dallo stress, come p53, NF-κB e HIF [60]. Pertanto, abbiamo dedotto che alcuni miRNA potrebbero essere modulati attraverso la regolazione di questi fattori di trascrizione. Utilizzando il database del sito di legame del fattore di trascrizione (PROMO), abbiamo identificato che esiste un presunto elemento di legame p53 nel promotore hsa-miR-4535. Il nostro studio futuro si concentrerà sulla regolazione trascrizionale di p53 nel promotore hsa-miR-4535. Inoltre, la degradazione del collagene indotta da H2O2- non può essere attenuata nelle cellule trasfettate con hsa miR-4535 o si-Smad4 anche dopo il trattamento con cistanche (Figura 8C, 8E). Questi risultati confermano ulteriormente il coinvolgimento di hsa-miR- 4535 nella regolazione della sintesi del collagene prendendo di mira Smad4.

Figura 13. Il diagramma schematico per il meccanismo dell'azione cistanche. cistanche potenzia le vie di sintesi del collagene TGF/Smad riducendo l'has-microRNA-4535 indotto da H2O2- per migliorare il fotoinvecchiamento nei fibroblasti dermici della pelle umana. Abbreviazioni: ECM: matrice extracellulare; TGF : fattore di crescita trasformante beta; T RI: recettore TGF di tipo I; T RII: recettore del TGF di tipo II.

In conclusione, i nostri risultati hanno indicato che la cistanche protegge dalla generazione di ROS indotta da H2O2/UVB, dallo squilibrio di MMP, dalla senescenza cellulare e dalla degradazione del collagene nei fibroblasti dermici umani. Gli effetti dermoprotettivi di cistanche sono stati associati all'inibizione di hsa-miR-4535 e all'attivazione del complesso Smad2/3/4 per migliorare la sintesi del collagene. L'attivazione del complesso Smad2/3/4 è stata regolata da hsa-miR-4535 attraverso il legame con Smad4-3′-UTR. Pertanto, il meccanismo protettivo di cistanche contro i danni cutanei indotti da H2O2/UVB può comportare l'inibizione della sintesi di Smad4/collagene da parte di hsa-miR- 4535

MATERIALI E METODI

Colture cellulari e trattamenti

I fibroblasti dermici umani HS68 sono stati ottenuti dal Bioresource Collection and Research Center (BCRC, Hsinchu, Taiwan) e mantenuti nel mezzo essenziale modificato di Dulbecco (DMEM, Thermo Fisher Scientific, MA, USA) contenente il 10% di siero bovino fetale (Invitrogen, CA, USA ), 2 mM di L-glutammina (Sigma-Aldrich, MO, USA), 100 U/mL di penicillina (Sigma-Aldrich) e 100 ug/mL di streptomicina (Sigma Aldrich) a 37 gradi e 5% di CO2. Per valutare l'effetto di cistanche contro il danno cellulare indotto da H2O2-, le cellule HS68 sono state trattate con 200 μM di H2O2 per 1 ora e poi co-trattate con cistanche (282200, Sigma-Aldrich) per 23 ore. Le cellule sono state lavate con PBS e poste in 1 mL di PBS fresco prima dell'esposizione ai raggi UVB. Per l'irradiazione UVB, le cellule sono state esposte a un reticolante (CX-2000, Upland, CA, USA) e lampadine UVB a un'intensità di 40 mJ/cm2 e quindi trattate con cistanche.

Saggi MTT

La vitalità cellulare HS68 dopo il trattamento è stata misurata utilizzando il test MTT. Le cellule HS68 sono state seminate in 96-pozzetti e trattate con 200 μM H2O2 per 1 ora o irradiate con 40 mJ/cm2 UVB e quindi incubate con diverse concentrazioni di cistanche (10, 20, 30 μM) per 23 ore. Dopo 24 ore, il terreno di coltura è stato sostituito con 100 μL di MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5-difenil tetrazolio bromuro) soluzione (0,5 mg/mL; 5 mg/mL di soluzione madre in PBS è stata diluita con terreno di coltura a 0,5 mg/mL) per 4 ore a 37 gradi . Quindi il formazan di colore viola è stato solubilizzato in 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO) e la densità ottica a 570 nm è stata misurata utilizzando uno spettrofotometro (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Transitori transfezione

Analisi di microarray

Saggio reporter della luciferasi

Le cellule sono state co-trasfettate con un costrutto di luciferasi wild-type e mutante Smad4-3′-UTR-WT o Smad4-3′-UTR-MT reporter, rispettivamente, e plasmidi di luciferasi di controllo interno. Dopo le trasfezioni, le attività della luciferasi sono state rilevate da un Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Sunnyvale, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. Le piastre sono state lette su un luminometro per micropiastre Reporter (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, USA). Le attività relative della luciferasi sono state normalizzate a quelle della renilla luciferasi.

Analisi Western blot

Le cellule sono state lavate usando 1 × soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e lisate in tampone di lisi (50 mM Tris-base (pH7.5), {{1{0}}.5 M NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 1 mM -mercaptoetanolo, 1% NP-40, 1% glicerolo e compresse cocktail di inibitori della proteasi (Roche Molecular Biochemicals, Alta Baviera, Germania) per 30 minuti in ghiaccio e poi centrifugate a 12, 000 × g per 10 minuti a 4 gradi. I surnatanti sono stati raccolti in provette per microcentrifuga da 1,5 mL. La concentrazione proteica in questi surnatanti è stata determinata con il metodo Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). contenenti uguali quantità di proteine ​​(20 ug) sono state separate attraverso l'elettroforesi su gel di poliacrilammide con gradiente del 6% -12% di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) e quindi trasferite su membrane di polivinilidene difluoruro (PVDF) (Millipore, Bedford, MA, USA). Le membrane sono state bloccate utilizzando un tampone bloccante (latte in polvere scremato al 5%, Tris-HCl 20 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM e Tween 20 allo 0,1%) per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi, le membrane sono state incubate con anticorpi primari (1: 1,000 diluizione) contro TGF 1 (sc-31609, Santa Cruz, CA, USA), p-smad2/3 (sc- 11769, Santa Cruz), Smad4 (sc{{ 50}}, Santa Cruz),COL1A1 (mb-28657, Santa Cruz), COL3A1 (mb-271249,Santa Cruz), p16 (10883-1-AP, Proteintech), p21 (mb{ {60}}, Santa Cruz), MMP-1 (sc-1731, Santa Cruz), GAPDH (sc-32233, Santa Cruz) e Histone H1 (sc-10806 , Santa Cruz) durante la notte a 4 gradi . Quindi, sono stati incubati con anticorpi secondari appropriati (diluizione 1:80, 000), IgG anticoniglio (A0545), antitopo (A9044) o anticapra (A5420) (Santa Cruz Biotechnology) per 1 ora a temperatura ambiente. Gli immunoblot sono stati rilevati con substrato di perossidasi di rafano (HRP) a chemiluminescenza potenziata (ECL) (Millipore) utilizzando ImageQuant LAS4000 mini (GE Healthcare Life Sciences, Little Chalfont, Regno Unito).

Estrazione di proteine ​​nucleari

Estrazione dell'RNA e qRT-PCR

L'RNA totale è stato estratto utilizzando un kit commerciale Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymo Research Corporation, CA, USA) secondo il protocollo del produttore [65, 66]. i miRNA sono stati retrotrascritti in cDNA utilizzando un kit di sintesi di miRNA cDNA (Takara, Shiga, Giappone) come descritto in precedenza [16, 67]. L'espressione hsa-miR-4535 e Smad4 è stata rilevata mediante PCR in tempo reale in un sistema LightCycler 96 (Roche, Basilea, Svizzera) utilizzando il protocollo standard LightCycler 480 SYBR Green I Master. La reazione PCR da 10 μL comprendeva 2 μL di cDNA, 5 μL 2× SyberGreen PCR Mix, 0,5 μL di forward primer (10 μM), 0,5 μL di reverse primer (10 μM) e 2 μL di ddH2O. Tutte le reazioni sono state eseguite in triplicato. Per il rilevamento dell'mRNA, è stato determinato il ciclo di soglia (Ct) per ciascun gene e l'espressione di ciascun gene relativa a quella di GAPDH è stata calcolata come 2ΔCt dove ΔCt=(gene Cttarget - CtGAPDH). Per il rilevamento del miRNA, Ct è stato determinato per ciascun gene e l'espressione di ciascun gene relativa a quella dell'rRNA U6 è stata calcolata come 2ΔCt dove ΔCt=(Cthsa-miR-4535 – CtU6 rRNA). I primer forward (F) e reverse (R) utilizzati per rilevare l'espressione di miRNA e mRNA erano: hsa-miR-4535 (3′-CAGGG TCGGUCCA5′); umano-Smad4 (F'-TGACCCAAA CATCACCTTCA, R'- ATACGTGGACCCTTCTG GA); umano-GAPDH (F'-ACCCAGAAGACTGTGGA TGG, R'-TTCAGCTCAGGGATGACCTT); topo-Smad4 (''-GTGGAAGCCACAGGAATGTT, R'-CCCA CTGAAGGACATTCGAT); topo-GAPDH (F'-CCTT CCACAATGCCAAAGTT, R'-GGGTGTGAACCA CGAGAAAT).

Analisi di immunofluorescenza