Effetti protettivi di Cistanche Tubulosa contro la degradazione del collagene dermico dei fibroblasti indotta da H2O2/UVB tramite la segnalazione TGF/Smad mediata da Hsa-microRNA-4535-
May 10, 2023
ASTRATTO
Questo studio mirava a indagare il meccanismo alla base degli effetti protettivi della cistanche contro i danni indotti da H2O2/UVB utilizzando modelli in vitro e in vivo di fotodanneggiamento. Inoltre, abbiamo identificato il coinvolgimento della regolazione del miRNA in questo processo. I fibroblasti dermici umani HS68 trattati con H2O2/UVB e i topi nudi C57BL/6J indotti da UVB sono stati utilizzati come modelli in vitro e in vivo di fotodanneggiamento. I risultati lo hanno dimostratotrattamento cistancheha alleviato la riduzione indotta da H2O2/UVB della vitalità cellulare, la compromissione della segnalazione di TGF/Smad e l'invecchiamento cutaneo. Sulla base dei risultati delle analisi dell'array di microRNA e delle ricerche nel database, has-miR-4535 è stato identificato come un potenziale miRNA candidato che prende di mira Smad4. In vitro,trattamento cistancheha attivato il complesso Smad2/3/4 e ha inibito l'espressione hsa-miR-4535 nelle cellule esposte a H2O2/UVB. In vivo, l'applicazione topica di dosi basse (12 mg/kg) e alte (24 mg/kg) di cistanche sulla pelle dorsale di topi nudi C57BL/6J ha alleviato significativamente il fotodanneggiamento cutaneo indotto da UVB promuovendo la segnalazione della sintesi del collagene TGF/Smad, riducendoiperplasia epidermica, formazione di rughe esenescenza cutanea, così comeinibizione dell'espressione hsa-miR-4535. Presi insieme, i nostri risultati indicano un legame tra hsa-miR-4535 e la segnalazione della sintesi del collagene TGF/Smade suggeriscono che questi fattori siano coinvolti nellameccanismo fotoprotettivo dicistanchenei fibroblasti dermicicontro H2O2/Invecchiamento indotto dai raggi UVB. Le prove lo indicavanocistancheconproprietà antietàpuò essereconsiderato come supplemento nei prodotti per la cura della pelle.
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INTRODUZIONE
I segni clinici dell'invecchiamento della pelle umana includono aumento delle rughe, lassità e pigmentazione irregolare [1]. Il processo di invecchiamento della pelle è complicato e può essere suddiviso in due tipi: invecchiamento intrinseco e invecchiamento estrinseco. L'invecchiamento intrinseco è dovuto al passare del tempo ea fattori genetici, mentre l'invecchiamento estrinseco, chiamato anche fotoinvecchiamento, deriva principalmente dall'esposizione alle radiazioni ultraviolette [2, 3]. Precedenti studi hanno dimostrato che durante l'invecchiamento sia intrinseco che estrinseco vengono generate abbondanti specie reattive dell'ossigeno (ROS). L'accumulo di ROS può indurre la segnalazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) e attivare il suo fattore di trascrizione a valle, la proteina attivatore -1 (AP-1). L'AP -1 attivato può traslocare nel nucleo e legarsi alle regioni del promotore delle metalloproteinasi della matrice (MMP) [4]. Le MMP sono un grande gruppo di endopeptidasi zinco-dipendente, che contribuisce alla degradazione della matrice extracellulare del derma cutaneo (ECM). In particolare, la MMP-1, una collagenasi, è coinvolta nella scissione del collagene di tipo I e III [5]. I tipi di collagene I e III, i componenti principali della MEC, sono in grado di conferire sostegno e forza al derma cutaneo e il loro disordine porta alle caratteristiche rughe e lassità della pelle invecchiata [6]. Il fattore di crescita trasformante-beta (TGF) è una citochina ubiquitaria e potente con tre diverse isoforme, TGF 1, TGF 2 e TGF 3, che possono regolare positivamente la sintesi del collagene nel derma della pelle umana [2]. I TGF attivano il loro segnale interagendo con specifici complessi del recettore della serina/treonina chinasi della superficie cellulare, compresi i recettori del TGF di tipo I (T RI) e II (T RII). La fosforilazione di T RI innesca la fosforilazione di R-Smad (Smad2 e Smad3). Gli R-Smad attivati interagiscono con Smad4 per regolare la sua traslocazione del nucleo e attivare trascrizionalmente i tipi di collagene I e III attraverso il legame con i promotori degli elementi di legame Smad (SBE) [7, 8]. Prove crescenti indicano che un'elevata generazione di ROS, indotta dall'intrinseco o dal fotoinvecchiamento, contribuisce alla compromissione della via di segnalazione TGF/Smad, che a sua volta si traduce in una ridotta sintesi di collagene nei fibroblasti dermici della pelle umana [9, 10].
cistanche (3,5,7-triidrossiflavone), un membro naturale della famiglia dei flavonoidi, è abbondante in Alpinia officinarum e propoli. la cistanche è un potenziale candidato per il trattamento di ictus ischemico, diabete e diversi tipi di cancro [11-13]. Inoltre, la cistanche possiede attività antiradicaliche e antinfiammatorie [14, 15]. In precedenza abbiamo dimostrato che il cistanche riduceva l'infiammazione indotta da H2O2- e promuoveva la formazione di collagene attraverso le vie di segnalazione del recettore del fattore di crescita 1 simile all'insulina (IGFI-R)/ERK1/2 nelle cellule HS68 [16, 17]. Inoltre, uno studio ha indicato che la cistanche è stata identificata come composto di Alpinia officinarum e possiede effetti inibitori della collagenasi nelle cellule dei fibroblasti dermici [18]. Tuttavia, non è noto un meccanismo molecolare più dettagliato relativo al modo in cui la cistanche regola l'invecchiamento cutaneo della pelle.
I microRNA (miRNA) sono un gruppo di piccole molecole di RNA a filamento singolo, non codificanti, con una lunghezza media di 22 nucleotidi. I miRNA maturi sono trascritti da sequenze di DNA. Nella maggior parte dei casi, i miRNA maturi si legano alle regioni 3′-non tradotte (UTR) degli mRNA bersaglio per silenziare la traduzione dell'mRNA [19]. Nella pelle umana, i miRNA svolgono un ruolo cruciale nella regolazione del metabolismo cellulare, del cancro, della senescenza e della formazione del collagene [20-23]. Ad esempio, miR-377 può indurre la senescenza dei fibroblasti dermici attraverso l'inibizione dell'espressione della DNA metiltransferasi 1 (DNMT1), che successivamente porta a una minore metilazione nel promotore p53 e alla senescenza dei fibroblasti dermici [22]. Il profilo del miRNA nel danno indotto da UVB nel derma umano
le cellule della papilla (nHDP) sono state precedentemente studiate [24]. Tuttavia, il modo in cui la senescenza dei fibroblasti dermici indotta da UVB attraverso la regolazione del miRNA, specialmente nel coinvolgimento del composto naturale, è in gran parte sconosciuto. Questo studio mirava a studiare gli effetti protettivi del cistanche contro il danno dermico indotto da H2O2/UVB e il ruolo della degradazione del collagene mediata da microRNA in questo processo. Abbiamo inoltre mirato a identificare i microRNA coinvolti nella regolazione della sintesi del collagene.
RISULTATI
la cistanche inibisce la citotossicità indotta da UVB/H2O2- nei fibroblasti dermici umani HS68
Per studiare la citotossicità della cistanche (Figura 1A) in vitro, le cellule HS68 sono state trattate con diverse dosi di cistanche (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) per 24 h. I risultati del test MTT hanno mostrato che la cistanche non era citotossica per le cellule HS68 (Figura 1B). Successivamente, abbiamo esposto le cellule HS68 a diverse dosi di H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) e UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) per 24 ore. Il trattamento con H2O2 e UVB ha ridotto la vitalità cellulare in modo dose-dipendente (Figura 1C, 1D). Per valutare le proprietà citoprotettive della cistanche dopo l'esposizione a H2O2 e UVB, abbiamo trattato cellule HS68 con diverse concentrazioni di cistanche (10, 20, 30 μM) dopo H2O2- (200 μM) e indotte da UVB (40 mJ/cm² ) danno. Solo trattamento con H2O2 o UVB
effetti nelle cellule HS68.
Per determinare se la diminuzione della vitalità cellulare fosse dovuta alla morte cellulare o all'inibizione della crescita, abbiamo controllato l'espressione di diversi marcatori di apoptosi e sopravvivenza mediante western blotting in cellule HS68 esposte a diverse dosi di H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 μM) per 24 h. Abbiamo trovato un'espressione significativamente ridotta di marcatori di sopravvivenza, come p-Akt, e una maggiore espressione di
Figura 1. La cistanche inibisce la citotossicità indotta da UVB/H2O2- nei fibroblasti dermici umani HS68. (A) La struttura chimica della cistanche. (B) Vitalità cellulare delle cellule HS68 trattate con diverse concentrazioni di cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) per 24 ore. (C e D) Vitalità cellulare delle cellule HS68 esposte a diverse dosi di H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 µM) o irradiate con UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) per 24 ore. (E e F) Vitalità cellulare delle cellule HS68 esposte a H2O2 (200 µM) o irradiate con UVB (40 J/cm2) per 1 h e poi trattate con cistanche (10, 20, 30 µM) per 23 h. Gli effetti citoprotettivi di cistanche sono stati determinati dal saggio MTT. Alle cellule di controllo è stata assegnata una vitalità del 100%. I valori sono mostrati come media ± SE. Viene mostrata la quantificazione dei risultati (n=3) *P <0,05, **P <0,01, ***P <0,001 rispetto a cellule di controllo non trattate; ##P <0,01, ###P <0,001 rispetto a cellule trattate con H2O2 o UVB.
La segnalazione TGF/Smad favorisce la formazione di collagene nei fibroblasti dermici della pelle umana [25-27]. Pertanto, abbiamo studiato il ruolo della cistanche nella sintesi del collagene tramite la via TGF/Smad nelle cellule HS68 esposte a H2O2. I risultati del Western blot hanno indicato che il cistanche ha migliorato significativamente la segnalazione TGF/Smad e la sintesi del collagene nelle cellule HS68 esposte all'H2O2- (Figura 4A). Inoltre, la disorganizzazione del collagene di tipo I e III è una delle caratteristiche tipiche dei fibroblasti cutanei invecchiati [28]. Poiché la famiglia MMP è stata implicata nel catabolismo del collagene [29], abbiamo successivamente confermato l'influenza della cistanche sull'attivazione di MMP-1. Abbiamo scoperto che la cistanche ha impedito la degradazione del collagene nelle cellule HS68 sopprimendo il livello di H2O2-MMP potenziato-1 (Figura 4A).
Inoltre, abbiamo identificato il meccanismo molecolare subcellulare alla base di questa azione protettiva confrontando cellule HS68 trattate con H2O2 da solo o co-trattate con cistanche mediante immunoblotting e immunofluorescenza. il trattamento con cistanche ha migliorato l'accumulo nucleare di p-smad2/3 e Smad4 che è stato interrotto dall'esposizione a H2O2 nelle cellule HS68
(Figura 4B, 4C). Questi risultati hanno indicato che la cistanche può migliorare la frammentazione del collagene indotta da H2O2- attivando la via TGF/Smad nelle cellule HS68.
Figura 4. Il cistanche attenua la compromissione della via di sintesi del collagene TGF/Smad indotta da H2O2- nelle cellule HS68. (A) Le cellule HS68 sono state esposte a H2O2 (200 µM) per 1 ora e poi trattate con cistanche (30 µM) per 23 ore. L'espressione proteica dei componenti della via correlata alla sintesi del collagene (TGF , p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) e della proteina correlata alla degradazione del collagene (MMP-1) è stata rilevata mediante western blot. (B) L'espressione proteica di p-smad2/3, Smad4 nelle frazioni nucleari e citosoliche è stata rilevata mediante western blotting. GAPDH è stato utilizzato come controllo del caricamento. I valori sono mostrati come media ± SE. Viene mostrata la quantificazione dei risultati (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 vs. cellule di controllo non trattate; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 rispetto alle cellule trattate con H2O2-. (C) L'anticorpo anti-p-Smad2/3, Smad4 e l'anticorpo secondario coniugato con FITC/PE sono stati utilizzati per rilevare l'espressione di p-Smad2/3 (verde), Smad4 (rosso). DAPI ha indicato la posizione del nucleo (blu). Le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza (200×).
Per determinare ulteriormente i meccanismi mediante i quali hsa-miR-4535 esercita il suo effetto sull'espressione di Smad4 e la sua segnalazione a valle nelle cellule HS68, abbiamo trasfettato cellule HS68 con imitazioni o inibitori hsa-miR-4535 e misurato Smad4 e la sua espressione di collagene a valle. I risultati hanno dimostrato che l'inibizione di hsa-miR-4535 da parte dell'inibitore hsa-miR-4535 ha invertito in modo significativo la downregulation dell'mRNA di Smad4 e l'espressione proteica nelle cellule HS68 trattate con H2O2- (Figura 7A-7C) . Inoltre, la soppressione di hsa-miR-4535 ha parzialmente ripristinato la compromissione COL1A1 e COL3A1 indotta da H2O2- nelle cellule HS68 trattate con H2O2- (Figura 7C).
Al contrario, l'espressione hsa-miR -4535 migliorata come risultato della trasfezione mimica hsa-miR -4535 ha bloccato la sovraregolazione mediata da cistanche di Smad4 nelle cellule HS68 esposte a H2O2 (Figura 7D-7F). La sovraespressione di miR-4535 ha parzialmente ridotto i livelli di COL1A1 e COL3A1 indotti da cistanche (Figura 7F). La sovraespressione di hsa-miR-4535 (Figura 8A-8C) o l'inibizione di Smad4 da parte di siRNA (Figura 8D, 8E) ha portato a una ridotta sintesi di collagene durante il trattamento con cistanche dopo l'esposizione a H2O2. Sorprendentemente, abbiamo scoperto che sia diretto Smad4
il silenziamento e i trattamenti con hsa-miR-4535 imitano la sintesi inversa del collagene indotta da cistanche nelle cellule HS68 trattate con H2O2-. Nel loro insieme, abbiamo concluso che la sintesi del collagene regolata da cistanche, potenzialmente attraverso la diminuzione del livello di hsa-miR-4535 per migliorare la segnalazione Smad4 nelle cellule HS68 esposte a H2O2.
Figura 5. Hsa-miR-4535 prende di mira Smad4. (A) L'espressione di microRNA nelle cellule HS68 trattate con cistanche è stata valutata utilizzando microarray. (B) Diagramma di Venn raffigurante potenziali candidati mRNA che possono essere regolati da hsa-miR-4535 basato su database miRDB e TargetScanHuman. Analisi della sequenza dei presunti siti di legame del miRNA nell'mRNA Smad4-3′-UTR per hsa-miR-4535. Le corrispondenze sono indicate da linee rette. (C) Le cellule HS68 sono state co-trasfettate con Smad4-3′-UTR-WT (wild-type; 0.5 µg/mL) più hsa-miR-4535 mimico (2{ {25}} nM) o Smad4-3′-UTR MT (mutante; 0.5 µg/mL) più mimic hsa-miR-4535 (20 nM) per 24 h. L'attività della luciferasi è stata determinata e normalizzata a quella della renilla. Viene mostrata la quantificazione dei risultati (n=3); ***P < 0,001, rispetto al gruppo mimico Smad4-3′-UTR-MT più hsa-miR-4535. G1=controllo, G2=cistanche (10 μM), G3=cistanche (30 μM)
I risultati del western blotting hanno confermato che la cistanche ha soppresso l'espressione MMP -1 potenziata con UVB nelle cellule HS68 (Figura 9A). Inoltre, abbiamo chiarito l'effetto anti-invecchiamento della cistanche nelle cellule HS68 sottoposte all'esposizione ai raggi UVB dimostrando che la cistanche ha ridotto l'elevazione indotta da UVB dei livelli di p16 e p21 (Figura 9A). Per valutare se la cistanche potesse attenuare la degradazione del collagene indotta da UVB attraverso l'inibizione di hsa-miR-4535 mirata a Smad4, abbiamo studiato i livelli di hsa-miR-4535 e Smad4 in cellule co-trattate con UVB e cistanche utilizzando qPCR. Abbiamo scoperto che l'espressione hsa-miR-4535 era significativamente sovraregolata nelle cellule esposte ai raggi UVB, ma diminuiva dopo il trattamento con cistanche. Al contrario, l'espressione di Smad4 è stata soppressa dall'esposizione ai raggi UVB e questa soppressione è stata notevolmente invertita dal trattamento con cistanche (Figura 9B, 9C). Collettivamente, i nostri risultati hanno suggerito che la cistanche esercita effetti simili a quelli dell'H2O2 per ripristinare la diminuzione indotta da UVB nella formazione di collagene reprimendo i livelli di hsa-miR-4535 in modo da promuovere la segnalazione Smad4 nelle cellule HS68.
Inoltre, l'applicazione di cistanche ha salvato l'espressione proteica di TGF , p smad2/3 e Smad4 nel tessuto cutaneo danneggiato da UVB (Figura 12C). I nostri risultati hanno indicato che la cistanche potrebbe potenzialmente proteggere la pelle dai danni indotti da UVB inibendo hsamiR-4535 per migliorare l'espressione di Smad4 per l'attivazione di P-smad2/3 per promuovere infine la sintesi del collagene (Figura 13).
Figura 9. Il cistanche migliora la via di sintesi del collagene TGF/Smad e attenua la senescenza dermica così come l'inibizione dell'espressione di hsa-miR-4535 nelle cellule HS68 esposte ai raggi UVB. Le cellule HS68 sono state esposte a UVB (40 mJ/cm2) e quindi trattate con cistanche (30 µM) per 23 ore. (A) Espressione proteica dei componenti della via correlata alla sintesi del collagene (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), proteina correlata alla degradazione del collagene (MMP{{2{0}}) e senescenza- i marcatori associati (p16 e p21) sono stati rilevati mediante western blot. GAPDH è stato utilizzato come controllo del caricamento. (B e C) L'espressione dell'RNA di hsa-miR-4535 e Smad4 è stata rilevata mediante qRT-PCR. I valori sono mostrati come media ± SE. Viene mostrata la quantificazione dei risultati (n=3) *P <0.05, **P <0,01, vs cellule di controllo non trattate; #P <0,05, ##P <0,01 rispetto alle cellule esposte ai raggi UVB.
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