Le risposte immunitarie protettive umorali e cellulari al SARS-CoV-2 persistono fino a 1 anno dopo il recupero

La vaccinazione SARS-CoV-2 è stata lanciata in tutto il mondo per creare un'efficace immunità a livello di popolazione per frenare la diffusione di questo virus. L'efficacia e la durata dell'immunità protettiva sono fattori critici per la salute pubblica. Qui riportiamo la cinetica della risposta immunitaria specifica SARS-CoV-2 in 204 individui fino a 1-anno dopo il recupero da COVID-19. Le concentrazioni di RBD-IgG e full-length spike-IgG e la capacità di neutralizzazione del siero diminuiscono durante i primi 6 mesi, ma sono mantenute stabilmente fino a 1 anno dopo la dimissione dall'ospedale. Anche gli individui che avevano generato alti livelli di IgG durante le prime fasi di convalescenza avevano livelli di IgG che erano diminuiti a un livello simile un anno dopo.

L'immunità di gregge si riferisce alla protezione efficace delle persone non vaccinate o non infette in una società quando sempre più persone in una società hanno acquisito l'immunità a una determinata malattia attraverso la vaccinazione o l'infezione naturale. Riducendo così la possibilità della diffusione e del verificarsi dell'epidemia. In generale, quando dal 70% a più del 90% della popolazione in una società ha acquisito l'immunità a una malattia, l'immunità della popolazione della società può raggiungere un livello sufficiente per proteggere le persone non vaccinate o non infette. Le persone infette sono immuni alla malattia.

Allo stesso tempo, dobbiamo anche migliorare la nostra immunità, che richiede buone abitudini di vita come una dieta sana e un sufficiente esercizio fisico. Inoltre, abbiamo scoperto che Cistanche può anche migliorare l'immunità. La cistanche è ricca di sostanze antiossidanti, che possono ridurre i radicali liberi nel corpo umano. il ruolo, migliorando così l'immunità.

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In particolare, il livello di RBD-IgG si correla positivamente con la capacità di neutralizzazione del siero, suggerendo il ruolo rappresentativo di RBD-IgG nel predire la protezione del siero. Inoltre, la protezione immunitaria cellulare specifica del virus, inclusa la specifica per spike e nucleoproteine, è persistita tra 6 e 12 mesi. Complessivamente, il nostro studio supporta la persistenza dell'immunità protettiva specifica del virus per oltre 1 anno.

Le risposte immunitarie specifiche del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) della sindrome respiratoria acuta grave sono fondamentali per sopprimere la replicazione del virus, migliorare la gravità della malattia e prevenire la reinfezione1–4. Gli individui guariti dall'infezione da SARS-CoV -2 wild-type potrebbero eseguire una protezione incrociata dalla reinfezione da parte di un mutante D614G1. Deng et al. ha dimostrato che i primati non umani esposti a SARS-CoV-2 sviluppano potenti risposte anticorpali nel modello di infezione del macaco rhesus e sono per lo più immuni alla reinfezione2.

In a clinical trial testing the protective effect of neutralizing antibodies, outpatients who received neutralizing antibody therapy were less likely to have a COVID-19–related hospitalization or visit to an emergency department and were less likely to develop severe symptoms3. A two-dose regimen of BNT162b2 elicited robust immune protection against COVID-19 in persons aged >16 anni4. I pazienti convalescenti SARS-CoV-2 e i destinatari del vaccino di solito generano risposte immunitarie robuste. Le risposte immunitarie protettive contro l'infezione da SARSCoV-2 sono costituite da due parti principali, l'immunoglobina umorale (IgA e IgG) e le risposte delle cellule T.

L'obiettivo ideale è ottenere un'infezione sterile; pertanto, la maggior parte degli studi si concentra sull'analisi delle IgG sieriche protettive per la sua pronta disponibilità1,2,4,5. Una potente protezione immunitaria delle cellule T prenderà di mira le cellule contenenti virus, limiterà la diffusione virale in vivo, accelererà la clearance virale e allevierà il carico della malattia. Le risposte umorali e delle cellule T virali specifiche possono durare, con un leggero calo, fino a 6-8 mesi nei soggetti SARS-CoV-2 convalescenti5,6. Se la memoria immunitaria protettiva può essere mantenuta a lungo termine e se gli anticorpi o le cellule T possono conferire una protezione duratura richiede ulteriori indagini e la comprensione di quest'area andrà anche a vantaggio dello sviluppo del vaccino.

Qui, analizziamo i cambiamenti dinamici delle risposte immunitarie umorali e cellulari specifiche del virus fino a 1 anno in una coorte di follow-up longitudinale COVID-19. In questa coorte rappresentativa di pazienti, i livelli di IgM e IgA specifici per SARS-CoV-2 sono diminuiti sostanzialmente ai livelli di base entro 1 anno. Le IgG specifiche per il picco e la capacità protettiva del siero sono diminuite significativamente entro i primi 6 mesi, ma sono state mantenute fino a 1 anno. Le risposte immunitarie specifiche delle cellule T SARS-CoV-2 sono rimaste stabili fino a 1 anno dopo la dimissione dall'ospedale. Questi risultati implicano che le risposte immunitarie protettive contro SARS-CoV-2 possono durare almeno 1 anno.

Risultati

Caratteristiche della coorte COVID-19.

Una coorte rappresentativa di 204 persone guarite (68,2%) su 299 pazienti nello stesso periodo che sono stati ricoverati al Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou, Cina, dal 20 gennaio al 29 febbraio 2020, ha partecipato a questo studio di follow-up. Di questi partecipanti, a 29 sono stati diagnosticati sintomi gravi, 162 moderati, 12 lievi e uno asintomatico (Tabella 1). La loro età e sesso erano rappresentativi dell'intera popolazione di pazienti (Supp. Fig. 1). Ad eccezione dell'unico paziente asintomatico, tutti gli individui hanno donato campioni di sangue in più punti temporali; fortunatamente, 50 individui (il 24,5% di 204) hanno completato l'intero ciclo di follow-up e hanno contribuito con campioni di sangue in tutti e quattro i punti temporali del follow-up. Pertanto, è stata possibile una valutazione cinetica della memoria immunitaria. In breve, la coorte di follow-up rappresenta l'intera popolazione di pazienti COVID-19 a Guangzhou all'inizio del 2020.

Cambiamenti longitudinali degli anticorpi umorali contro SARSCoV-2.

Il dominio di legame del recettore (RBD) del picco SARS-CoV-2 svolge un ruolo essenziale nel legame virale al suo recettore, l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2), i livelli di anticorpi specifici per RBD sono correlati e rappresentano il suo capacità neutralizzante7. Abbiamo analizzato la cinetica degli anticorpi IgM, IgA e IgG specifici per RBD circolanti nel tempo con kit di immunodosaggio per elettrochemiluminescenza a immunodosaggio indiretto in due fasi8.

First, all patients were positively seroconverted (at least one IgM >1 COI, IgA >1 COI, or IgG >1 COI) con almeno un punto temporale, a conferma dell'effettiva infezione da SARS-CoV-2 verificatasi per tutti i pazienti selezionati. I pazienti gravi hanno generato RBD-IgA, RBD-IgG e spike-IgG significativamente più alti, ma non RBD-IgM, rispetto ai pazienti moderati nella fase ospedaliera (Fig. 1a-d e Supp. Fig. 2). Il nostro risultato ha confermato che un'esposizione più prolungata del sistema immunitario ai virus ha migliorato la generazione di anticorpi specifici per il virus.

Successivamente, abbiamo scoperto che il livello di IgM specifiche per RBD è diminuito drasticamente da 4,669 (COI medio, di seguito) a 0,785 (negativo) (circa sei volte, p < 0.0 001, un t-test spaiato con correzione di Welch) entro 3 mesi dalla dimissione (Fig. 1a). Anche le IgA specifiche per RBD sono diminuite sostanzialmente da 9,283 a 3,234 (solo 2.86-volte, p < 0,0001, un t-test non appaiato con correzione di Welch) entro 3 mesi, ma si sono mantenute fino a 6 mesi (3,491, p { {24}}.073, un t-test spaiato con la correzione di Welch). Alla fine, RBD-IgA è diventato negativo al 12- punto del mese (0,57) (p <0,0001, un t-test non accoppiato con la correzione di Welch) (Fig. 1b). Poiché l'IgA svolge una funzione di neutralizzazione nella mucosa, ci si aspettava che i suoi livelli sierici fossero inferiori anche al picco rispetto a quelli nei tessuti della mucosa. Se i tessuti della mucosa potrebbero mantenere una IgA stabile richiede ulteriori indagini.

RBD-IgG è stato considerato l'indicatore critico della protezione immunitaria contro l'infezione da virus. La nostra analisi ha mostrato che RBDIgG ha avuto una riduzione di 2.87-volte da 825 a 287 AU/ml nei primi 3 mesi (p < 0.0001, un t-test non accoppiato con la correzione di Welch) e oltre a 153 AU/ml ai 6- punti temporali del mese (p=0.0033) (Fig. 1c, un t-test non accoppiato con la correzione di Welch), che era coerente con i rapporti precedenti5,6 .

In particolare, i livelli di RBD-IgG si sono mantenuti stabilmente fino a 1 anno (170 AU/ml in media, Fig. 1c). Il livello di spike-IgG a lunghezza intera, misurato in modo indipendente, ha mostrato uno schema simile a quello di RBD-IgG (Fig. 1d), confermando ulteriormente l'osservazione di cui sopra secondo cui l'anticorpo si manterrebbe stabile da 6 mesi a 1 anno dopo un rapido declino.

I livelli di RBD-IgG e di spike-IgG a lunghezza intera hanno mostrato una forte correlazione positiva (r=7411, p <0.0001, n=474, correlazione di Pearson, Fig. 1e). Una forte correlazione positiva tra RBD-IgG e spike-IgG a lunghezza intera è stata osservata in più punti temporali (Fig. 1e e Supp. Fig. 3).

Thus, RBD-IgG was used in the following analysis. To investigate what kind of patients tends to maintain long-term RBD-IgG-producing capacity, we test the influence of initial antibody titers on antibody persistence. We divided the follow-up individuals with at least the first three follow-up visits into high RBD-IgG (maximal titer >1000 AU/ml) e basso (100 < titolo massimo<1000 AU/ml) groups. We observed that the high group had significantly higher RBD-IgG levels at the in-hospital stage (p = 0.0004, an unpaired t-test with Welch's correction), 1-month (p = 0.0026, an unpaired t-test with Welch's correction), and 3-month (p = 0.0363, an unpaired t-test with Welch's correction) visits. But the difference diminished at the 6-month visit (p = 0.2212, an unpaired t-test with Welch's correction) and the 12-month visit (p = 0.7074) (Fig. 1f). Next, we demonstrated that disease severity does not necessarily contribute to higher RBD-IgG maintenance with individuals with at least three continuous follow-up serum samples (Fig. 1g). Therefore, our results showed that neither the antibody levels nor the disease severity would affect the RBD-specific IgG antibody persistence.

Fig. 1 Kinetics of SARS-CoV-2 viral-specific antibodies up to 1 year. SARS-CoV-2-infected individuals who attended the follow-up program were included in this analysis. a–c RBD-IgM, IgA, and IgG changes since symptom onset. x-axis, follow-up time (day). y-axis, antibody titer (COI cut-off index; or arbitrary unit, AU/ml). The shaded regions represent the in-patient stage. The average values in the 1-month, 3-month, 6-month, and 12-month stages were labeled. P values (two-tailed) were shown. Mild (black dots), moderate (blue dots), and severe (red dots) symptoms. d Full-length spike-IgG changes since symptom on-set. x-axis, follow-up time (day). y-axis, antibody titer (AU/ml). e Correlation of RBD-IgG and Spike-IgG. In-hospital stage (black), 1-month follow-up (red), 3-month follow-up (blue), 6-month follow-up (purple), and 12-month follow-up (green). Pearson r number and p-value (two-tailed) were shown. f Longitudinal analysis of RBD-specific IgG between patients with high titer (RBD-IgG >1000 AU/ml, cerchio arancione) e pazienti con basso titolo (RBD-IgG<1000 AU/ml, empty circle). g Longitudinal analysis of RBD-specific IgG between severe patients (red circle) and moderate patients (pink circle). Lines in the x-axis and y-axis in a–e indicate the cut-off values. a–d, Mean values were labeled for each column. f, g, Data were presented as median with interquartile range. An unpaired t-test with Welch's correction analysis was applied, and p-values (two-tailed) were labeled. Source data are provided as a Source Data file.

Cinetica della protezione del siero contro SARS-CoV-2.

Abbiamo condotto un test di microneutralizzazione del siero utilizzando il sistema di infezione SARSCoV-2 vivo, il gold standard per valutare la protezione del siero contro l'infezione da virus, per verificare se il siero è ancora protettivo contro l'infezione da SARS-CoV-2. Abbiamo scoperto che i titoli di neutralizzazione del siero sono diminuiti da 1 mese a 3 mesi (p=0.0024, un t-test non appaiato con correzione di Welch) e 6 mesi (p=0.0168, un t-test non appaiato con correzione di Welch) test con la correzione di Welch), in modo simile a RBD-IgG e Spike-IgG (Fig. 2a). Successivamente, si sono mantenuti stabili fino a 12-mese (p=0.591, un t-test non accoppiato con la correzione di Welch), il che implica che la protezione umorale specifica del SARSCoV-2 potrebbe persistere a lungo termine.

Poiché i pazienti gravi generavano livelli elevati di anticorpi rispetto ai pazienti moderati, non era ancora noto se i livelli elevati potessero conferire una protezione più potente. Abbiamo scoperto che i sintomi gravi hanno portato solo a una capacità neutralizzante transitoriamente più alta nella fase di convalescenza precedente (p=0.020, un test t non accoppiato con la correzione di Welch), che è diminuita dal 3-mese a { {4}}anno visita (Sup. Fig. 4).

Quindi, abbiamo analizzato la correlazione di RBD-IgG con la microneutralizzazione sierica. Abbiamo scoperto che esisteva una significativa correlazione positiva tra RBD-IgG e neutralizzazione (r=0.4070, p < 0.0001, n {{6} }, correlazione di Pearson) (Fig. 2b). Non sorprendentemente, i livelli di Spike-IgG avevano una correlazione positiva con la capacità di neutralizzazione del siero (Supp. Fig. 4). Da notare che la correlazione tra RBD-IgG e sieroneutralizzazione non è riuscita a raggiungere la significatività statistica durante la fase di ricovero (r=0.2101, p=0.0905, correlazione di Pearson, Supp. Fig. 5a) mentre mantenuto positivamente a 1-mese (r=0.3952, p < 0.0001, correlazione di Pearson), 3-mese (r=0.2769, p=0. 0135, correlazione di Pearson), 6-mese (r=3846, p=0.0005, correlazione di Pearson) e 12-mese (r=0.5216, p <0,0001, correlazione di Pearson) visite (Supp. Fig. 5b-e).

Cinetica della risposta immunitaria specifica delle cellule T SARS-CoV-2.

I linfociti T di memoria specifici del virus possono infine ridurre la gravità della malattia eliminando le cellule infettate dal virus9, formando un altro ramo vitale nella lotta contro l'infezione virale quando si verifica. Per studiare se una risposta immunitaria cellulare T protettiva potesse persistere, abbiamo generato un pool di peptidi Nucleoprotein (N) a causa delle sue proteine ​​​​virali più abbondanti10 e pool di peptidi Spike a causa della loro importanza nell'infezione virale e ampia applicazione6. I peptidi Spike sono stati utilizzati per generare pool di peptidi S1 ​​e S2 per una comoda manipolazione. Abbiamo utilizzato i tre pool di peptidi per l'analisi ELISPOT (enzyme-linked immunosorbent spot) dell'interferone gamma (IFN-) di cellule T virali specifiche utilizzando PBMC fresche isolate dalle visite di 6-mese e 12-mese. Sono stati mostrati i risultati del rilevamento ELISPOT di un individuo rappresentativo (Fig. 3a).

Rispetto ai pazienti convalescenti in ospedale, le cellule secernenti IFN virali specifiche totali sono diminuite a 6- visite al mese e si sono mantenute stabili a 12- visite al mese (Fig. 3b). Cambiamenti simili sono stati osservati per le proteine ​​​​N, S1 e S2 (figura 3c). I pazienti gravi sembrano generare una forte immunità cellulare T persistente contro la proteina Spike (Supp. Fig. 7). L'analisi della composizione della risposta cellulare SARSCoV -2 T ha rivelato che le percentuali di N, S1 e S2 sono ben mantenute con solo un leggero calo (Fig. 3d), indicando la possibile esistenza di una memoria di lunga durata T appena come l'infezione da SARS nel 200311.

Discussione

In un aspetto, il nostro studio ha dimostrato che entrambe le risposte immunitarie umorali specifiche per SARS-CoV-2 possono essere mantenute fino a 1 anno. Abbiamo osservato che le RBD-IgG, Spike-IgG e la capacità di neutralizzazione del siero specifiche del virus sono diminuite rapidamente entro 6 mesi, in modo simile ai rapporti precedenti5,6,12,13. Fortunatamente, i tre parametri rimangono stabili per 1 anno. Sembra che le IgG virali specifiche potrebbero mantenere i livelli attuali per un po'.

Fig. 2 Analisi longitudinale della protezione sierica contro l'infezione da SARS-CoV-2. I sieri raccolti da più punti temporali sono stati testati contro l'infezione da virus SARS-CoV-2 vivo. è stato eseguito un test di microneutralizzazione utilizzando un sistema vivo di coltura cellulare di infezione da SARS-CoV-2. asse y, pieghe di diluizione del siero. I dati sono stati presentati come valore medio ± SEM. I punti colorati rappresentano la gravità della malattia. Sintomi lievi (punti bianchi), moderati (punti blu) e gravi (punti rossi). È stato applicato un test t non accoppiato con l'analisi di correzione di Welch e sono stati etichettati i valori p (a due code). b Correlazione di microneutralizzazione (pieghe di diluizione) e RBD-IgG (unità arbitraria, AU/ml). Sono state analizzate un totale di 475 coppie e sono stati mostrati i valori r e p di Pearson (a due code). Le linee nell'asse x e nell'asse y in a e b indicano i valori di cut-off. I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.

Fig. 3 Risposta delle cellule T specifiche per SARS-CoV-2 in pazienti COVID-19 guariti. Immagini rappresentative del pozzetto ELISpot che mostrano cellule che secernono IFN. N, S1 e S2, pool di peptidi sintetici sovrapposti di nucleocapside (N), subunità Spike 1 (S1) e 2 (S2). Con A, Concanavalin A controllo positivo. b Numeri spot di cellule che secernono IFN che indicano la riduzione della risposta immunitaria specifica per SARS-CoV-2 nel tempo. I numeri sono la somma dei pozzetti stimolati N, S1 e S2-. I dati sono stati presentati come mediana con intervallo interquartile. c I grafici Raincloud mostrano diversi livelli di risposta cellulare T tra tre pool di peptidi in diversi momenti del follow-up. d Grafico a punti waffle che mostra la percentuale di composizione della risposta SARS-CoV-2 durante 1- anni di follow-up. Statistiche del test U di Mann-Whitney. È stato mostrato il valore P (a due code). b, c I dati sono stati rappresentati come grafici a scatola e baffi (mediana con interquartile, limite superiore e limite inferiore). I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.

Nell'altro aspetto, il nostro studio ha dimostrato che la risposta specifica delle cellule T SARS-CoV-2 potrebbe anche essere relativamente stabile a lungo termine (Fig. 3). Questa osservazione è piuttosto cruciale nella situazione attuale. Diversi ceppi famigerati14-18, come B.1.1.7 (anche 501Y.V1, ceppo UK), B.1.351 (anche 501Y.V2, ceppo Sud Africa), B.1.617.1 e B.1.617.2 (India ceppo), B.1.525 (anche 20 A, ceppo Nigeria) e B.1.1.28.1 (anche 501Y.V3, ceppo Brasile) sono emersi con maggiore infettività o patogenesi o entrambi. I nuovi mutanti, che si verificano principalmente nel dominio RBD, potrebbero potenzialmente sfuggire alla protezione di neutralizzazione acquisita tramite infezione naturale o vaccinazione SARS-CoV-215,17,18.

A differenza degli anticorpi neutralizzanti, le cellule T virali specifiche non potrebbero bloccare l'ingresso del virus nelle cellule, ma potrebbero comunque uccidere il virus intracellulare distruggendo direttamente le cellule infettate dal virus che presentano peptidi virali2,11. Poiché i numerosi epitopi virali19 possono essere prodotti da qualsiasi proteina virale oltre alla proteina Spike per la presentazione del complesso maggiore di istocompatibilità, nuove mutazioni non potrebbero facilmente interrompere la sorveglianza immunitaria delle cellule T. In questa prospettiva, i vaccini che potrebbero indurre durevoli risposte immunitarie virali specifiche delle cellule T prometteranno di costruire un'efficace immunità della popolazione contro SARS-CoV-2.

Metodi

Informazioni per il paziente.

Il Guangzhou Eighth People's Hospital, l'ospedale ufficiale nominato dal governo di Guangzhou, ha ricevuto e curato pazienti COVID-19 durante la prima ondata di diffusione endemica di SARS-CoV-2 da gennaio 2020 a marzo 2020. 299 pazienti ricoverati Il Guangzhou Eighth People's Hospital è stato arruolato in questo studio retrospettivo. Duecentoquattro pazienti hanno partecipato allo studio di follow-up fornendo almeno una volta. Le informazioni generali sui pazienti, tra cui età, sesso e diagnosi clinica, sono state raccolte dal sistema informativo ospedaliero. Tutti i pazienti sono stati diagnosticati secondo i criteri del nuovo piano di diagnosi e trattamento della polmonite da coronavirus (versione di prova 7) emesso dalla National Health and Health Commission. La diagnosi di sintomi gravi era conforme ai seguenti criteri:

1. Distress respiratorio, frequenza respiratoria (RR) maggiore o uguale a 30 volte/min nello stato di riposo.

2. Saturazione di ossigeno Inferiore o uguale al 93% nello stato di riposo.

3. Pressione parziale di ossigeno nel sangue arterioso (PaO2)/concentrazione di ossigeno (FiO2) Inferiore o uguale a 300 mmHg).

4. Imaging radiologico del torace deteriorato (raggi X e imaging TC ad alta risoluzione) come ausilio.

Il sintomo moderato è stato diagnosticato quando i pazienti presentavano polmonite visibile, febbre e/o altri sintomi respiratori. Il sintomo Lieve è stato diagnosticato in presenza di lieve disagio ma senza sintomi di polmonite. I casi asintomatici sono stati diagnosticati quando i pazienti non presentavano segni di sintomi clinici ma sono stati confermati positivi all'RNA virale SARS-CoV-2 durante la fase di follow-up dopo l'esposizione virale o uno stretto contatto con casi confermati.

Definizioni.

Tutte le persone che hanno partecipato a questo programma di follow-up sono state suddivise in due fasi: la fase di ricovero e quella di follow-up. Quest'ultimo è stato ulteriormente raggruppato come 1-mese (entro 60 giorni dalla dimissione), 3-mese (da 70 a 135 giorni), 6-mese (da 150 a 220 giorni) e {{11 }}mese (da 280 a 360 giorni).

Misurazione degli anticorpi IgA, IgG e IgM virali specifici.

I campioni di plasma o siero sono stati inattivati ​​a 56 gradi per 30 minuti e conservati a -80 gradi prima del test. Gli anticorpi IgA, IgG e IgM contro la proteina spike SARS-CoV-2 RBD nei campioni di plasma sono stati testati con kit di immunodosaggio a elettrochemiluminescenza immunodosaggio indiretto in due fasi (Kangrun Biotech Co., Ltd.), secondo le istruzioni del produttore. In breve, i campioni di siero sono stati prima incubati con microparticelle modificate. Le microparticelle sono state rivestite con l'RBD della proteina spike SARS-CoV-2 e con anticorpi marcati con estere di acridina contro il dominio Fc degli anticorpi umani. Dopo diversi cicli di lavaggio delle sostanze non legate, il rilevamento del segnale è stato eseguito su un analizzatore immunitario automatico a chemiluminescenza (KAESER1000, Chongqing Cosmax Biotech Co., Ltd.).

Allo stesso modo, gli anticorpi IgG contro la proteina Spike a lunghezza intera SARS-CoV-2 nei campioni di plasma sono stati testati con kit di immunodosaggio a elettrochemiluminescenza immunodosaggio indiretto in due fasi (Mairui Biotech Co., Ltd.), secondo le istruzioni del produttore. Tutti i test sono stati eseguiti in rigorose condizioni di biosicurezza. Il titolo anticorpale è stato testato una volta per campione di siero. I livelli di anticorpi sono presentati come valori di chemiluminescenza misurati divisi per il cut-off (indice di cut-off, COI). COI<1 was regarded as negative, and COI >1 è stato considerato positivo.

Saggio di microneutralizzazione.

Il siero inattivato al calore è stato diluito in serie quattro volte (da 1:4 a 1:1024) e quindi miscelato con un volume uguale (125 ul) di una soluzione virale contenente 100 TCID50 di SARS-CoV-2. Successivamente, le miscele siero-virus sono state prima incubate per 2 ore a 37 gradi e quindi applicate in duplicato a un monostrato VERO E6 semiconfluente. Dopo 4-giorni di incubazione, sono stati valutati i pozzetti infetti dal virus. I pozzetti con un effetto citopatogeno visibile sono stati definiti come infezione virale positiva.

Saggi umani IFN-ELISPOT

I test IFN-ELISPO sono stati eseguiti come descritto in precedenza (1) In breve, le piastre filtranti MultiScreen 96-pozzetti (Merck Millipore, Darmstadt, Germania) sono state rivestite con anticorpo monoclonale anti-IFN umano (U-Cytech, Paesi Bassi, n. CT{ {5}}) durante la notte a 4 gradi C. I pozzetti sono stati lavati con PBS e bloccati con terreno R10 (RPMI-1640, 0,05 mM, 2-mercaptoetanolo, 1 mM piruvato di sodio, 2 mM di L-glutammato, 10 mM di 4-(2-idrossietil)-1-acido piperazineetansolfonico [HEPES], 10% di siero bovino fetale [FBS] e penicillina/streptomicina (1×)) per 2 ore a 37 gradi C. Le PBMC appena isolate sono state piastrate e stimolate in presenza di pool di peptidi SARSCOV-2 S1 o S2 o N (GenScript, Cina) per 24 ore a 37 gradi C. SARS-COV{{29 }} i peptidi sono lunghi 20 amminoacidi, con dieci sovrapposizioni di amminoacidi tra peptidi sequenziali. Le piastre sono state lavate con PBS-Tween 20 (PBST), seguite da incubazione con anticorpo anti-IFN umano biotinilato (U-Cytech, Paesi Bassi, n. CT640-10) e streptavidina coniugata con fosfatasi alcalina (AKP) (BD , Stati Uniti, n. 554065). Gli spot sono stati sviluppati incubando in NBT/BCIP (Pierce, USA) per 10 min. I punti sono stati contati utilizzando un lettore ELISPOT (Bioreader 4000, BIOSYS, Germania). Il numero di cellule che formano spot (SFC) viene riportato come numero di cellule che secernono IFN- -antigene-specifico per milione di PBMC.

Analisi statistica.

Per analizzare i dati nel software GraphPad PRISM (versione 5.01) sono stati utilizzati il ​​test t non accoppiato con la correzione di Welch, il test Chi-quadrato e il test di correlazione di Pearson. Le differenze tra i gruppi sono state confrontate utilizzando il test U di Mann-Whitney e il test della somma dei ranghi di Kruskal-Wallis per confronti multipli con R studio (versione 4.0.2).

Approvazione etica.

Lo studio è stato approvato dal comitato etico medico del Guangzhou Eighth People's Hospital (n. 202001134 e 202020153). Il consenso scritto è stato ottenuto da individui volontari.

Riepilogo dei rapporti.

Ulteriori informazioni sulla progettazione della ricerca sono disponibili nel riepilogo dei rapporti sulla ricerca sulla natura collegato a questo articolo.

Disponibilità dei dati

Gli autori dichiarano che tutti i dati che supportano i risultati di questo studio sono disponibili all'interno del documento e dei suoi file di informazioni supplementari. I dati di origine sono inclusi come file di dati di origine. I dati di origine sono forniti in questo documento.

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Ringraziamenti

Ringraziamo tutti i membri del gruppo di follow-up COVID-19 per i loro contributi indiretti a questo studio. Ringraziamo tutti i medici e gli infermieri che si sono presi cura di questi pazienti e hanno raccolto i campioni nel reparto di isolamento. Ringraziamo anche tutti i tecnici di laboratorio che hanno gestito i campioni ed eseguito le misurazioni presso l'Ottavo Ospedale del Popolo di Guangzhou. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81670536, 81770593 e 82061138006), National Grand Program on Key Infectious Disease Control (2017ZX10202203-004-002 e 2018ZX10301404-003-002), Dipartimento provinciale del Guangdong of Science and Technology Fund (n. 2020B1111330002), Guangzhou Health Science and Technology Program (20211A010029), Sino-German Center for Research Promotion (SGC)'s Rapid Response Funding Call for Bilateral Collaborative Proposals tra Cina e Germania in COVID{{14 }} Ricerca correlata (n. C-0032) e programma chiave di emergenza del laboratorio di Guangzhou (EKPG21-29).

Contributi d'autore

XD, FH, CL, XT e FL erano responsabili del disegno dello studio, della supervisione dello studio e dell'analisi dei dati. FH e FL hanno scritto il giornale. CF, YW, HH, FC, GT, YL, JL, JC e MJ erano responsabili del reclutamento dei pazienti e della raccolta dei campioni e dei dati clinici. JS, PL, LF e LC hanno effettuato le analisi di sequenziamento e bioinformatica. QF, LG e SC hanno condotto il rilevamento dell'RNA virale e i test anticorpali. CK ha eseguito il test di microneutralizzazione.

Interessi conflittuali

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Informazioni aggiuntive

La corrispondenza e le richieste di materiale devono essere indirizzate a XD, FH, XT o FL

Informazioni sulla revisione tra pari Nature Communications ringrazia Bin Cao e gli altri revisori anonimi per il loro contributo alla revisione tra pari di questo lavoro. Sono disponibili i rapporti dei revisori tra pari.

Nota dell'editore Springer Nature rimane neutrale riguardo alle rivendicazioni giurisdizionali nelle mappe pubblicate e alle affiliazioni istituzionali.

Accesso libero

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