Metilazione dell'arginina proteica: una modifica emergente nell'immunità al cancro e nell'immunoterapia, parte 1

Negli ultimi anni, le proteine ​​​​arginina metiltransferasi (PRMT) sono emerse come nuovi membri di una famiglia di regolatori dell'espressione genica negli eucarioti e sono associate alla patogenesi e alla progressione del cancro. L'immunoterapia contro il cancro ha migliorato significativamente il trattamento del cancro in termini di sopravvivenza globale e qualità della vita. La metilazione dell'arginina proteica è una funzione di modificazione epigenetica non solo nella trascrizione, nell'elaborazione dell'RNA e nelle cascate di trasduzione del segnale, ma anche in molti processi del ciclo cancro-immunità. La metilazione dell'arginina è coinvolta nell'attivazione dell'immunità anticancro e nella regolazione dell'efficacia dell'immunoterapia.

In questa recensione, riassumiamo le informazioni più aggiornate sui meccanismi molecolari regolatori e sulle diverse vie di segnalazione della metilazione dell'arginina sottostanti nelle risposte immunitarie innate e adattative durante il cancro. Delineiamo anche il potenziale degli inibitori PRMT come trattamenti combinatori efficaci con l'immunoterapia.

Parole chiave: proteina arginina metiltransferasi (PRMT), immunità contro il cancro, immunoterapia contro il cancro, modificazione post-traduzionale, meccanismo molecolare

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1. INTRODUZIONE

La modifica post-traduzionale è una modificazione chimica che aumenta la diversità funzionale delle proteine ​​attraverso l'aggiunta covalente di un gruppo chimico. Il processo modula la funzione delle proteine ​​ed è emerso come un regolatore cruciale di molteplici processi cellulari nel cancro.

Tuttavia, la metilazione dell'arginina, a differenza dell'acetilazione, dell'ubiquitinazione e della fosforilazione, ha ricevuto poca attenzione fino a poco tempo fa, principalmente a causa della natura discontinua del rilevamento del substrato e dell'assenza di anticorpi affidabili ed efficaci inibitori di piccole molecole. La scoperta della proteomica e degli inibitori ha approfondito la nostra comprensione di scrittori, lettori e regolatori durante la metilazione dell'arginina. Le proteine ​​​​arginina metiltransferasi (PRMT) catalizzano la metilazione dell'arginina come "scrittori" e sono principalmente coinvolte nell'attivazione e nella repressione della trascrizione, nello splicing pre-mRNA e nelle risposte al danno del DNA (1). La metilazione dell'arginina modula anche la trascrizione dei loci mirati, mediando così i processi cellulari chiave per mantenere l'omeostasi dei tessuti e i fenotipi della malattia. Poiché la metilazione dell'arginina è una modifica mirata, gli inibitori PRMT hanno mostrato un grande potenziale come terapie antitumorali nei modelli preclinici e negli studi clinici, per migliorare efficacemente la sopravvivenza dei pazienti (2).

Poiché le funzioni del sistema immunitario sono ben consolidate e vitali per la sorveglianza del tumore e il trattamento del cancro, le immunoterapie antitumorali in rapida crescita sono ora considerate il quarto pilastro del trattamento del cancro (insieme a chirurgia, radioterapia e chemioterapia) (3).

L'immunità al cancro in genere elimina le cellule tumorali o ne limita la crescita, ma promuove anche la progressione del tumore stabilendo microambienti tumorali (TME), che si adattano alla crescita del tumore (4). Nonostante l'efficacia della terapia del blocco del checkpoint immunitario (ICB), una minoranza di pazienti con tumori maligni avanzati trae benefici clinici da questi trattamenti, con la maggioranza che sviluppa resistenza innata o acquisita (5).

Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche sui metodi di combinazione basati sull'immunoterapia per migliorare la sopravvivenza globale nei pazienti con cancro in stadio avanzato.

Dato che le risposte immunitarie del cancro sono processi continui, dinamici, strettamente regolati e ben progettati, le risposte soppressive all'immunoterapia possono essere attribuite a diversi fattori, tra cui il fenotipo immunitario TME e i meccanismi molecolari alla base della resistenza intrinseca del tumore (6). Tra le questioni rilevanti per le risposte ottimali all'immunoterapia c'è ogni fase di una serie di processi di amplificazione a cascata chiamati ciclo immunitario del cancro, l'interazione tra immunità innata e adattativa, nonché l'attivazione o la perdita delle vie di segnalazione oncogeniche. Il classico ciclo cancro-immunità comprende l'espressione e la presentazione dell'antigene, il traffico di cellule T e l'infiltrazione del tumore e l'uccisione delle cellule bersaglio da parte dei linfociti T citotossici (CTL). L'immunità innata integra, sostiene e amplifica completamente questo ciclo. Mentre i regolatori epigenetici sono coinvolti nell'attivazione e nella traslocazione delle cellule immunitarie nella TME, così come nelle successive risposte immunitarie, i loro ruoli specifici nell'immunità tumorale e i loro effetti combinati con l'immunoterapia rimangono poco chiari (7, 8).

Qui, esaminiamo le funzioni di metilazione dell'arginina nell'immunità tumorale da tre prospettive: 1) coinvolgimento del ciclo cancro-immunità nelle risposte antitumorali, 2) produzione di interferone di tipo I (IFN) e relative vie di segnalazione e 3) meccanismi di resistenza intrinseca del tumore. Utilizzando queste prospettive, forniamo prove che evidenziano i nuovi ruoli fisiologici dei PRMT nell'immunità del cancro e chiediamo se gli inibitori del PRMT possono essere combinati con l'immunoterapia per ottenere effetti terapeutici massimi e duraturi nel cancro.

2 PRM

2.1 Classificazione PRMT

La metilazione dell'arginina si riferisce principalmente all'aggiunta di gruppi metilici dalla S-adenosilmetionina (SAM) ai gruppi guanidino della catena laterale dell'arginina, che è catalizzata dai PRMT (9). Cinque potenziali donatori di legami idrogeno si trovano nel gruppo guanidino, con la metilazione del residuo di arginina che rimuove un potenziale donatore di legame idrogeno, alterando così la forma del residuo di arginina senza neutralizzare le cariche cationiche e generando effetti fisiologici nella maggior parte delle cellule (10, 11). 

Attualmente, nove PRMT (PRMT 1–9) sono stati identificati in cellule di mammifero e sono divisi in tre gruppi distintisecondo l'attività catalitica: 1) w-NG-monometilarginina (MMA) si riferisce a un singolo gruppo metilico aggiunto all'atomo terminale di azoto, 2) asimmetrico w-NG-dimetilarginina (aDMA) si riferisce a un altro gruppo metilico posto sullo stesso guanidino gruppo basato su MMA, e se posto sull'altro guanidino azoto terminale, questo si riferisce a 3) w-NG simmetrico, N'Gdimethylarginine (CDMA). Gli enzimi di tipo I (PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT4 (CARM1), PRMT6 e PRMT8) catalizzano aDMA (12), mentre gli enzimi di tipo II (PRMT5 e PRMT9) catalizzano CDMA (13) e gli enzimi di tipo III (PRMT7) catalizzano solo MMA (Figura 1). I PRMT partecipano a molti processi biologici, tra cui la regolazione dell'espressione genica, le risposte al danno del DNA e la segnalazione cellulare (Tabella supplementare 1). I PRMT sono predominanti ed essenziali per le cellule umane, in particolare il PRMT1, che è responsabile dell'85% dell'aDMA e mostra una drammatica perdita di metilazione quando eliminato (14).

Inoltre, si ipotizza che esistano molte diafonia tra i PRMT (15). La perdita di PRMT1 provoca il rilascio di diversi substrati perché non sono più bloccati da una modifica aDMA, facendo passare questi substrati a target PRMT di tipo II e III (15). Tuttavia, i PRMT hanno funzioni che si escludono a vicenda anche se si applicano a una varietà di substrati identici in vitro (16).

2.2 Funzioni del PRMT nella biologia del cancro

Studi precedenti hanno riportato che l'elevata espressione di PRMT era correlata alla tumorigenesi e alla prognosi sfavorevole in diversi tumori (17-19) (Tabella supplementare 2). Ad oggi, la maggior parte dei PRMT è implicata nella regolazione dei processi cellulari associati al mantenimento del cancro, inclusa l'espressione genica mediata dall'epigenetica, lo splicing dell'mRNA e le risposte al danno del DNA (20). Tra questi percorsi, la regolazione epigenetica è un meccanismo importante che influenza l'attività cellulare, principalmente a causa dell'attivazione del deposito di PRMT (istone H4R3me2a, H3R2me2s, H3R17me2a e H3R26me2a) o repressiva (H3R2me2a, H3R8me2a, H3R8me2s e H4R3me2s) dei segni istonici, che promuovono o sopprimono (rispettivamente) geni chiave correlati al tumore (21). I primi studi sulla metilazione non istonica hanno identificato i ruoli dei PRMT nella regolazione dello splicing costitutivo e alternativo (22, 23). Infatti, l'inibizione di PRMT5 e PRMT di tipo I ha soppresso le funzioni sDMA e aDMA nelle proteine ​​leganti l'RNA coinvolte nella regolazione dello splicing, portando a risposte di soppressione del tumore in modelli di leucemia animale con mutazioni del fattore di splicing (24). La down-regulation della riparazione del danno al DNA è stata a lungo riconosciuta come un aumento dell'instabilità del genoma per generare lo sviluppo incontrollato del cancro (25). Dato che la metilazione dell'arginina delle proteine ​​​​correlate alla riparazione del danno al DNA, tra cui MRE11, 53BP1 e hnRNPUL1, è necessaria per la riparazione del DNA mediante riparazione per ricombinazione omologa e giunzione terminale non omologa, gli inibitori PRMT sono stati combinati con la chemioterapia per superare la resistenza ai trattamenti citotossici (26 –28).

Questi risultati incoraggianti suggeriscono ruoli potenti ed entusiasmanti per i PRMT nel trattamento del cancro. Un'altra scoperta inaspettata è stata l'effetto sinergico dell'inibizione del PRMT in combinazione con gli inibitori del checkpoint immunitario (ICI) (19). Pertanto, gli studi che chiariscono i meccanismi molecolari alla base della deplezione o dell'inibizione del PRMT potrebbero aiutare a identificare nuovi bersagli "farmaci" per l'immunoterapia.

3 PRMT NELL'IMMUNITÀ DEL CANCRO

Recentemente, l'immuno-oncologia è diventata un'area di primo piano nel trattamento del cancro, con gli ICI identificati come promettenti monoterapie o terapie combinate per il trattamento di diversi tipi di cancro (29). Gli eventi graduali coinvolti nell'induzione e nell'esecuzione delle risposte immunitarie antitumorali, il cosiddetto ciclo immunitario del cancro, forniscono una base teorica per l'immunoterapia del tumore (30). In questo contesto, è importante comprendere l'interazione tra PRMT e componenti nel ciclo cancro-immunità, poiché il targeting di una o più fasi del ciclo potrebbe migliorare le risposte immunitarie antitumorali in corso e/o stimolarne di nuove. Molti studi hanno ora dimostrato che l'interferone di tipo I (IFN) è fondamentale per le risposte immunitarie antitumorali poiché l'IFN è un importante regolatore e mediatore in ogni fase del ciclo immunitario del cancro (31, 32).

Pertanto, lo sviluppo di agonisti sicuri ed efficienti per stimolare l'IFN di tipo I potrebbe rappresentare strategie promettenti per l'immunoterapia del cancro. In effetti, i difetti intrinseci del tumore stanno emergendo come fattori molecolari chiave che dettano il contesto immunitario di diversi tipi di cancro, con ruoli di ostacolo nelle risposte immunitarie antitumorali locali (33). Lo sfruttamento delle relazioni tra eventi genetici tumorali intrinseci e PRMT è necessario per massimizzare l'efficacia degli inibitori e sviluppare strategie di intervento immunitario personalizzate. Collettivamente, l'identificazione degli eventi di metilazione nel ciclo cancro-immunità, la caratterizzazione della produzione di IFN di tipo I e lo svelamento dei percorsi oncogenici forniranno approfondimenti completi e approfonditi sui PRMT in immuno-oncologia e aiuteranno a identificare nuovi bersagli.

3.1 Il ruolo dei PRMT nel ciclo dell'immunità contro il cancro

Prove considerevoli suggeriscono che l'immunità tumorale non è un processo isolato, ma richiede una serie di eventi graduali chiamati "ciclo di immunità cancro", o un processo di auto-amplificazione in cui ogni fase influenza lo sviluppo e la prognosi del tumore migliorando i segnali regolatori positivi o inibendo quelli negativi. segnali regolatori (30, 34, 35). La rimozione completa dei tumori maligni è teoricamente realizzabile (30). In questo modello, la fuga delle cellule tumorali si ottiene interrompendo passaggi specifici nel ciclo immunitario del cancro. Il ciclo immunitario del tumore inizia con il rilascio di neoantigeni associati al tumore dalle cellule tumorali, che sono riconosciuti dalle cellule presentanti l'antigene come le cellule dendritiche (DC), le cellule B e i macrofagi, per formare l'istocompatibilità del peptide antigenico (MHC) complessi. Le DC mature migrano dal tumore agli organi linfoidi secondari (SLO) per fornire complessi antigenici peptide-MHC alle cellule CD4 plus T e CD8 plus T (36). I recettori delle cellule T (TCR) riconoscono questi complessi e generano un primo segnale, seguito dall'up-regulation della proteina transmembrana CD40L sulla superficie delle cellule Th. E poi il CD40L si lega al CD40 sulla superficie delle DC, il che aumenta notevolmente l'espressione di B7, e successivamente si lega più fortemente al CD28 sulla superficie delle cellule Th. Questo doppio segnale avvia la costimolazione delle cellule T e produce citochine, portando all'attivazione delle cellule T effettrici contro gli antigeni specifici del cancro. Le cellule T effettrici attivate viaggiano quindi verso il tumore attraverso la circolazione e creano cellule immunitarie che si infiltrano nel tumore.

Infine, i TCR sulle cellule CD8 plus T riconoscono il complesso antigenico peptide-MHC-I e uccidono le cellule tumorali bersaglio, con antigeni rilasciati dalle cellule tumorali morte nel ciclo successivo (30) Le potenziali alterazioni regolate dalla metilazione dell'arginina nel ciclo cancro-immunità sono mostrati (figura 2).

3.1.1 PRMT e presentazione dell'antigene tumorale

Molti tumori eludono il rigetto immunitario sopprimendo l'elaborazione e la presentazione dell'antigene MHC di classe I (MHC-I). L'MHC-I ha attirato notevole attenzione in quanto presenta antigeni peptidici endogeni alle cellule CD8 più T, inibisce l'interferenza con il riconoscimento del tumore e riduce la citotossicità delle cellule CD8 più T, che è l'effettore primario dei tipi cellulari per il successo dell'ICB (4). La down-regulation di MHC-I è stata osservata nel 40% -90% dei tumori umani, il che influisce sulle interazioni MHC: TCR e riduce il riconoscimento delle cellule tumorali da parte delle cellule CD8 più T. I fattori regolatori dell'IFN (IRF) e il dominio CARD della famiglia NLR (leucine-rich repeat-containing) del dominio legante i nucleotidi contenente 5 (NLRC5) sono spesso associati alla down-regulation dell'MHC-I (37-40). Le molecole MHC di classe II (MHC-II) sono espresse principalmente da cellule specializzate presentanti l'antigene (APC) e presentano antigeni peptidici esogeni principalmente alle cellule CD4+T (41). La sottoregolazione dell'MHC-I o dell'MHC-II è collegata a una prognosi del cancro infausta, risposte ICB compromesse e tassi di rigetto del tumore ridotti nei modelli murini (42-44).

Uno studio recente ha riportato che PRMT5 controllava l'abbondanza di MHC-I e la presentazione dell'antigene che influenzava la trascrizione di NLRC5 (19). La down-regulation di PRMT5 o l'inibizione farmacologica dell'attività di PRMT5 ha aumentato l'espressione di NLRC5 e dei suoi geni bersaglio, che erano implicati nell'elaborazione e nella presentazione dell'antigene. NLRC5 è un attivatore trascrizionale dei geni MHC-I quando accoppiato con fattori di trascrizione che interagiscono con elementi regolatori del promotore MHC-I, come il modulo SXY (39, 45). Il knockdown di PRMT5 ha anche aumentato l'espressione di NLRC5 dopo il trattamento con IFN-g ed è stato accompagnato da una maggiore espressione di superficie MHC-I (19). L'espressione di NLRC5 era inversamente correlata con l'espressione di PRMT5 nelle cellule tumorali (46). Pertanto, il targeting di PRMT5 potrebbe essere una strategia promettente per aumentare l'abbondanza di MHC-I e promuovere la presentazione dell'antigene. Oltre a PRMT5, è stato dimostrato che molti altri PRMT regolano negativamente i livelli di MHC-I.

Nei monociti, l'inibizione di PRMT1 ha ridotto l'arricchimento del legame dell'elemento di risposta dell'adenosina monofosfato ciclico (cAMP) (CREB) nel sito CRE sul promotore HLA-B (Major Histocompatibility Complex, Class I, B) per aumentare i livelli di MHC-I (47). Nelle cellule di melanoma murino B16 knockdown PRMT7 o PRMT7 trattato con inibitori, anche i regolatori del gene MHC-I come Nlrc5 e i suoi geni bersaglio sono sovraregolati, in modo simile al gruppo MS023 (inibitore PRMT1) (48).

È stato dimostrato che PRMT1 metila il transattivatore di classe II (CIITA), che è un regolatore chiave dell'espressione di MHC-II, e si associa e coopera con il fattore di trascrizione che si lega al promotore di MHC-II (49). La metilazione dell'arginina di CIITA ha portato alla sua successiva degradazione e alla down-regulation dei livelli di mRNA e proteine ​​di MHC-II (49). Uno studio recente ha riportato che PRMT5 regola negativamente l'espressione di MHC-II nel carcinoma epatocellulare guidato da MYC (50). L'MHC-II era significativamente aumentato su CD45.1 infiltrante il tumore più leucociti e DC quando i topi transgenici con sovraespressione di MYC sono stati trattati con l'inibitore PRMT5, GSK3326595 (50). Il silenziamento di PRMT5 nelle cellule di carcinoma epatocellulare con sovraespressione di MYC regolava direttamente l'espressione di MHC-II diminuendo l'arricchimento in vitro di H3R8me2 e H4R3me2 sui promotori CIITA e CD74 (50).

Pertanto, il targeting di PRMT5 utilizzando piccoli inibitori molecolari potrebbe indurre l'infiltrazione di cellule immunitarie nei tumori del fegato e promuovere la presentazione dell'antigene attraverso l'up-regulation di MHC-II. Tuttavia, un altro studio ha mostrato che il PRMT5- mediava l'accumulo di istone dimetilato simmetricamente, H3R2 (H3R2me2s) in risposta alla stimolazione con IFN-g ed era accompagnato dall'arricchimento di CIITA al promotore MHC-II; PRMT5 ha attivato la trascrizione di MHC-II in modo dipendente dall'attività (51). Questi effetti differenziali di PRMT5 sui processi trascrizionali MHC-II potrebbero essere dovuti a modelli diversi, pertanto sono necessari ulteriori studi per chiarire questi problemi. CARM1 ha anche attivato la trascrizione MHC-II stimolata da IFN-g indotta da CIITA in modo dipendente dall'attività dell'arginina metiltransferasi. Inoltre, CARM1 ha metilato la proteina legante CREB nelle posizioni R714, R742 e R768, facilitando così un'associazione con il promotore MHC-II e attivando sinergicamente la trascrizione MHC-II da parte di CIITA (52). Insieme, i PRMT hanno influenzato l'induzione mediata da CIITA di MHC II da parte di IFN attraverso meccanismi diversi.

3.1.2 I PRMT mediano la migrazione delle cellule immunitarie regolando le chemochine, CXCL10 e CXCL11

Per eseguire azioni antitumorali, le cellule T migrano attraverso il sistema circolatorio verso il tumore dopo l'inizio nei linfonodi. L'asse CXCL9, -10, -11/CXCR3 regola principalmente la migrazione, la differenziazione e l'attivazione delle cellule immunitarie. CXCR3 è un recettore espresso in superficie per le chemochine CXCL9, CXCL10 e CXCL11 sulle cellule immunitarie e tumorali. Le chemochine reclutano CTL, natural killer (NK), cellule NK-T e macrofagi, quindi facilitano l'infiltrazione nel tessuto tumorale attraverso un gradiente chemiotattico, provocando la migrazione direzionale in risposta all'IFN-g, che è sinergicamente aumentata dal fattore di necrosi tumorale-a ( TNF-a) (53). L'iniezione sottocutanea di dosi letali o sub-letali di cellule di melanoma B16 nei topi CXCR3-/-stabilisce un ruolo critico per CXCR3 come recettore per CXCL9, CXCL10 e CXCL11 durante la migrazione dei CTL (54). Le chemochine derivate dal tumore sono anche responsabili del reclutamento di cellule Th2, Treg e cellule mieloidi soppressori (MDSC) (53). Pertanto, CXCL9, CXCL10 e CXCL11 hanno ruoli cruciali, non ridondanti, cellulari autonomi che mediano l'infiltrazione di cellule immunitarie nei tumori e inducono un'efficace immunità antitumorale. Inoltre, la metilazione dell'istone lisina mediata dall'omologo zeste 2 (EZH2) e la metilazione del DNA mediata dalla DNA metiltransferasi-1 (DNMT-1) hanno soppresso rispettivamente la produzione di CXCL9 e CXCL10 e quindi hanno inibito il tumore a cellule T homing.

Pertanto, i trattamenti con modulatori epigenetici possono eliminare questa soppressione e, in ultima analisi, migliorare il trattamento del cancro (55). Queste osservazioni suggeriscono che la riprogrammazione epigenetica dei tumori può regolare il reclutamento delle cellule T e l'efficacia clinica dell'immunoterapia tumorale e la metilazione dell'arginina come modalità epigenetica diffusa e critica, influenza questi processi.

Il dominio strutturale catalitico di CARM1 interagisce direttamente con p65, che si trova nel dominio di omologia Rel del fattore nucleare kappa-B (NF-kB) e funge da motivo essenziale di dimerizzazione (56). Nelle cellule knockdown CARM1 stimolate da TNF-a, il reclutamento di p65 al promotore CXCL10 era significativamente difettoso e la metilazione di H3R17 sul promotore non era rilevabile, mentre la reintroduzione di CARM1 ha completamente salvato queste risposte, suggerendo che CARM1 era necessario per il reclutamento di p65 al promotore CXCL10 e Metilazione di H3R17 (56). PRMT5 regola anche l'associazione di p65 con il promotore CXCL10, poiché PRMT5 innesca la dimetilazione dei siti R30 e R35 su p65 e il legame al DNA e la traslocazione nucleare di p65 (57). L'induzione del TNF-a di CXCL10 nelle cellule endoteliali richiedeva la metilazione dell'arginina p65 mediata da PRMT5-. Secondo altre ricerche di questo team, PRMT5 ha indotto la dimetilazione di R174 su p65 per modificare il legame con il promotore CXCL11 (58).

Coerentemente, la dimetilazione simmetrica PRMT5 di p65 a R30 ha aumentato la sua affinità per il DNA e ha attivato l'espressione genica indotta da NF-kB (59). Al contrario, l'attenuazione dell'attività di PRMT5 mediante RNA a forcina corta o il piccolo inibitore molecolare EPZ015666 nelle cellule di melanoma B16 ha aumentato l'espressione di CCL5 e CXCL10 dopo la stimolazione (19). PRMT5 ha anche metilato IFI16, attenuato il suo legame con il DNA intracellulare a doppio filamento (dsDNA) e quindi ha indotto l'espressione di CCL5 e CXCL10 (19). Sebbene le interazioni tra PRMT1 e CXCL10 o CXCL11 non siano state descritte, PRMT1 ha dimetilato asimmetricamente il residuo R30 conservato di p65 (60). Il sito di metilazione PRMT1 si trova nel motivo RxxRxRxxC dell'anello L1 legante il DNA di p65 (60). La p65 metilata ha una scarsa affinità per gli oligonucleotidi condivisi NF-kB; regolava negativamente il legame con il DNA di p65 e l'attività trascrizionale, impedendo così il reclutamento di NF-kB per colpire i promotori genici (60).

Pertanto, ipotizziamo che PRMT1 possa regolare le chemochine a livello trascrizionale. PRMT1, CARM1 e PRMT5 si legavano tutti direttamente al dominio di omologia Rel di p65, poiché l'interazione era mediata da una regione centrale contenente il dominio strutturale della metiltransferasi, che era evolutivamente conservato (61). Nel complesso, le interazioni PRMT-chemochine sono dinamiche e dipendenti dal contesto, in modo tale che la dimetilazione simmetrica e asimmetrica possa compensare e verificarsi in vari stadi delle reazioni NF-kB, reclutando molecole effettrici distinte e producendo diversi effetti biologici. La produzione di chemochine dovrebbe essere promossa per facilitare il reclutamento di linfociti infiltranti il ​​tumore mirando selettivamente a PRMT distinti.

3.1.3 Superare le reti inibitorie nella TME

Il TME è ora visto come un complesso ecosistema tumorale piuttosto che come un modello di crescita centrato sulle cellule tumorali (62). Per capire meglio come funziona il TME, dobbiamo capire la sua matrice extracellulare e la composizione delle cellule stromali. Le cellule stromali sono classificate come segue; cellule immunitarie infiltranti (IIC), cellule vascolari angiogeniche e fibroblasti associati al cancro (63). Le cellule immunitarie infiltranti antigene-specifiche comprendono tipi di cellule immunitarie innate (macrofagi (Mjs), cellule dendritiche (DC), MDSC, NK, mastociti, neutrofili e cellule immunitarie adattative (linfociti T e B) che rispondono a una varietà di stimoli) (64). Sebbene inizialmente reclutate dal tessuto circostante o dal midollo osseo per avvolgere il tessuto tumorale, queste cellule vengono infine "rieducate" per diventare diversi tipi di cellule che generano infiammazione cronica e angiogenesi.

In questo ambiente, le cellule tumorali e lo stroma circostante interagiscono tra loro sopprimendo i geni immunologicamente benefici e inducendo una via di segnalazione aberrante, producendo infine potenti citochine e chemochine che influenzano la sorveglianza immunitaria dell'ospite per sostenere la crescita, la progressione e le metastasi delle cellule tumorali. Molte prove cliniche ora mostrano che la TME ha un impatto significativo sull'efficacia dell'immunoterapia e sugli esiti clinici e che i PRMT possono fornire nuovi bersagli terapeutici per l'immunoterapia del tumore modulando la TME verso un'elevata infiltrazione dei linfociti.

3.1.3.1 Mirare alla proliferazione e differenziazione delle cellule T

Poiché le cellule T CD{0}}efficaci sono le più potenti cellule che uccidono il tumore, le popolazioni di cellule T sono temi di ricerca di grande attualità. CD8 più cellule T citotossiche e CD4 più cellule T helper costituiscono le sottopopolazioni di cellule T nella TME. Le cellule naive CD4 plus si differenziano principalmente in quattro popolazioni distinte: cellule T helper 1 (Th1), Th2, Th17 e T regolatorie (Treg). La loro differenziazione è determinata dai modelli di segnali ricevuti durante le loro interazioni iniziali con gli antigeni (65). Le cellule T nella TME non solo esercitano funzioni effettrici antitumorali, ma alcune promuovono la crescita tumorale. Tra questi, i linfociti T CD8 più citotossici e i linfociti Th1, comunemente noti come CTL, hanno ruoli di uccisione del tumore. Queste ultime cellule sono caratterizzate dalla produzione di IFN-g, TNF-a e interleuchina (IL)-2, che supportano il primo tipo cellulare o agiscono come cellule T citotossiche per rimuovere direttamente le cellule tumorali (66). Le cellule Th2 supportano le cellule B rilasciando IL-4, IL-5 e IL-13, mentre le cellule Th17 promuovono la crescita tumorale producendo IL-17, IL-21 e IL22 (65, 67). Inoltre, le Treg attenuano le risposte immunitarie antitumorali mediate dalle cellule T inibendo direttamente la funzione delle cellule T e la produzione di citochine, o inibendo indirettamente la presentazione dell'antigene per ostacolare l'attivazione delle cellule T (68, 69). Un alto rapporto tra Treg e CD8 più cellule T di solito indica una prognosi infausta del cancro (70). Le cellule T CD8 più citotossiche spesso non riescono a inibire la formazione del tumore durante la tumorigenesi a causa dell'esaurimento delle cellule T, che è definito come l'espressione persistente dei recettori inibitori delle cellule T e la progressiva perdita della produzione di IFN-g e delle funzioni di degranulazione in risposta a fattori a lungo termine come l'infiammazione cronica o la stimolazione del cancro (71). IL-12 e IFN-g polarizzano i linfociti T naïve CD4 plus verso i linfociti Th1 attraverso l'azione del trasduttore di segnale e dell'attivatore del fattore di trascrizione T box T-bet. La differenziazione delle cellule Th2 richiede GATA3, che è a valle di IL-4. La differenziazione delle cellule Th17 richiede il recettore orfano correlato ai retinoidi (ROR) gt, che è un fattore di trascrizione indotto dal fattore di crescita trasformante (TGF-b) in combinazione con IL-6, IL-21 e IL{{55 }}. La differenziazione delle cellule Treg richiede anche il forkhead box P3 (FOXP3) come fattore trascrizionale.

La caratterizzazione completa della metilazione dell'arginina nelle cellule T primarie ha identificato i ruoli normativi dei PRMT nelle decisioni sul destino delle cellule T. Utilizzando la spettrometria di massa, Geoghegan et al. identificato 2.502 siti di metilazione dell'arginina in 1.257 proteine ​​nelle cellule T umane (72). Nell'elenco c'erano componenti del macchinario del segnale del recettore dell'antigene delle cellule T e fattori chiave di trascrizione che regolano la determinazione del destino delle cellule T. Inoltre, questi autori hanno quantificato i cambiamenti nell'occupazione della metilazione dell'arginina durante la differenziazione primaria delle cellule T e hanno dimostrato i cambiamenti nella stechiometria della metilazione dell'arginina durante la stimolazione cellulare in un sottoinsieme di proteine ​​critiche per la differenziazione delle cellule T (72).

Tre studi indipendenti che hanno utilizzato topi con deficienza di PRMT5- specifici delle cellule T hanno corroborato il ruolo chiave di PRMT5 nel mantenere le cellule T periferiche e guidare la transizione delle cellule T naive a un fenotipo effettore/memoria (73-75). Inue et al. riferito che, rispetto ai topi di controllo, i topi con deficit omozigote specifici delle cellule T PRMT5 avevano numeri di cellule T NK (iNK) invarianti inferiori, CD4 più T e CD8 più T. Inoltre, PRMT5 era necessario per la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule T (74). Tanaka et al. hanno mostrato che PRMT5 era fondamentale per la transizione delle cellule T da un fenotipo naïve a uno attivato e anche per il mantenimento di cellule T già mature (73). Lindsey et al. ha anche confermato che PRMT5 era necessario per mantenere le normali popolazioni di cellule T periferiche iNKT, CD4 più T e CD8 più (75). Sia l'attività della dimetilazione simmetrica dell'arginina che i livelli di espressione di PRMT5 sono stati significativamente indotti nelle cellule T attivate.

Inoltre, Inoue et al. ha anche riferito che PRMT5 ha facilitato lo splicing pre-mRNA da Il2rg e Jak3 per aumentare i loro livelli di espressione per mantenere le popolazioni di cellule T. Il2rg codifica per gc, che è una subunità del recettore condivisa dalle citochine, tra cui IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21 (76). La famiglia delle citochine gc regola strettamente lo sviluppo dei linfociti e funziona tramite le tirosina chinasi JAK1 e JAK3 (77). Lo sviluppo difettoso dei linfociti, comprese le cellule T, B, NK e iNKT, è osservato nei topi carenti di gc o JAK3. Questi autori hanno anche dimostrato che la dimetilazione simmetrica dei residui di arginina nelle proteine ​​Sm da parte di PRMT5 potrebbe spiegare i cambiamenti di splicing causati dal deficit di PRMT5 (74).

CD8 ad alta densità più cellule T citotossiche sono associate a una prognosi migliore in molti tumori (78). Pertanto, le correlazioni tra PRMT, CD8 più proliferazione delle cellule T e capacità di produzione di citochine sono state studiate in numerosi studi. Kumar et al. ha dimostrato che l'inibizione di CARM1 ha aumentato il numero di cellule CD8 più T infiltranti il ​​tumore, ha promosso l'espressione del granzima B e IFN-g e la proliferazione del marcatore Ki-67, che ha facilitato una maggiore capacità di uccisione del tumore nelle cellule CD8 più T, suggerendo l'inibizione di CARM1 aumento della proliferazione di CD8 plus T e della produzione di citochine (79). Kumar et al. hanno anche mostrato che le cellule T Carm1-knockout esprimevano livelli più elevati di memoria CD8 più fattori di trascrizione associati alle cellule T, come Tcf7 e Myb (79). Myb ha promosso la memoria CD8 più la formazione di cellule T attraverso l'attivazione trascrizionale della repressione di Tcf7 e Zeb2 (80). In particolare, le cellule T Carm1-knockout co-esprimevano bassi livelli dei recettori inibitori PD-1 e TIM3, che sono marcatori di esaurimento delle cellule T (79). Distinta da CARM1, l'inibizione di PRMT5 ha soppresso in vitro l'induzione di cellule CD8 plus T tumorali specifiche (81). Le reazioni di metilazione PRMT hanno convertito la SAM, come cofattore donatore di metile, in Sadenosil-l-omocisteina (SAH), mentre la SAM è stata anche convertita in metiltioadenosina (MTA). Sia SAH che MTA hanno inibito PRMT nei cicli di feedback, mentre MTA ha effettivamente inibito l'attività PRMT5 (82). L'MTA ha ridotto la proliferazione e la vitalità delle cellule CD8 più T, in quanto ha inibito le funzioni effettrici nelle cellule T CD8 più citotossiche antigene-specifiche umane riducendo la capacità di degranulazione delle cellule T CD8 più e inibendo la secrezione di IFN-g e IL-2 in modo dose-dipendente (81). Strobl et al. hanno riferito che l'inibitore della metiltransferasi specifico del PRMT5-, EPZ015666, sopprimeva la proliferazione, la vitalità e la funzionalità delle cellule T e CD8 (83).

Inoltre, questi autori hanno associato PRMT5 allo splicing selettivo MDM4 che ha indotto la trasduzione della cascata di segnalazione p53 per mediare l'arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi nelle cellule CD8 plus T. L'inibizione di PRMT5 ha anche ridotto la segnalazione della proteina chinasi B (AKT)/bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR), che ha compromesso la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule CD8 più T (83).

Il CD28 legato a B7 sulle APC e la co-stimolazione con TCR ha ridotto la soglia di attivazione delle cellule T, promuovendo così la differenziazione delle cellule CD4 più T e l'espressione delle citochine di tipo Th2- (84). Blanchet et al. hanno riferito che i segnali di co-stimolazione del CD28 inducevano la metilazione dell'arginina nelle cellule T (85). Dato che SAH è stato rapidamente eliminato dall'S-adenosil-L-omocisteina idrolasi (SAHase) e SAH ha inibito le attività PRMT, SAHase funge da attivatore di PRMT. I bloccanti farmacologici SAHase hanno fortemente inibito l'attivazione di diverse proteine ​​chiave stimolate dalla segnalazione TCR, tra cui AKT, chinasi proteiche regolate extracellulari (ERK) 1/2 e NF-kB. porta a compromissione dell'attivazione delle cellule CD4 più T (86).

Pertanto, i PRMT possono avere ruoli importanti nell'attivazione e differenziazione delle cellule CD4 più T. Inibitori selettivi per PRMT5 potrebbero sopprimere la proliferazione delle cellule Th2 (87). Webbb et al. osservato che nei topi con deficit omozigote specifici delle cellule T PRMT5, la proporzione di cellule T IFN-g plus T-bet plus, IFN-g plus e T-bet plus aumentava durante la differenziazione delle cellule Th1, ma il numero totale di cellule Th1 differenziate era ridotta, più che probabile a causa della ridotta proliferazione di Th1 (75). Inoltre, questi autori hanno osservato che la percentuale di cellule T GATA-3 plus IL-4 plus e IL-4 plus aumentava durante la differenziazione Th2 (75). Quindi l'inibizione di PRMT5 ha migliorato la differenziazione delle cellule CD4 più T ma ha soppresso la proliferazione. Dal punto di vista meccanicistico, è stato dimostrato che gli inibitori della SAHase riducono la metilazione dell'arginina del fattore 1 di scambio di nucleotidi guanina di Vav (Vav1), una molecola essenziale, portando a un'attivazione limitata delle cellule CD4 più T (86, 88). Coerentemente, l'arginina metilato Vav1 si è accumulato nel nucleo e ha attivato il fattore nucleare complesso trascrizionale delle cellule T attivate (NFAT) e NF-kB per promuovere la produzione di IL-2 e la proliferazione delle cellule T (85). PRMT5 regola anche la trascrizione di IL-2 metilando particolari proteine ​​contenenti sDMA (89).

Inoltre, la ridotta secrezione di IL-2 da parte degli inibitori PRMT5 ha contribuito a sopprimere la proliferazione e la differenziazione delle cellule Th1 (87). PRMT1 ha anche metilato la proteina che interagisce con NFAT, NIP45, che ha facilitato un'associazione con NFAT, una modifica necessaria per il potente aumento indotto da NIP45- della transattivazione di NFAT e la co-attivazione di PRMT1 del promotore IL-4 (90, 91). Collettivamente, gli inibitori SAHase controllavano parzialmente le proteine ​​stimolate dalla segnalazione TCR attraverso la ridotta metilazione di Vav1, inibendo così l'attivazione delle cellule T e CD4. PRMT5 ha anche promosso la produzione di IL-2 metilando Vav1 o NF-45 e NF-90. Dato che IL-2 ha ruoli critici nella polarizzazione delle cellule CD4 più T naive al fenotipo Th2 e nella proliferazione delle cellule T, gli alti livelli di espressione di IL-2 indotti da PRMT5 hanno contribuito a cellule T CD4 più differenziazione e proliferazione (92, 93).

Studi recenti hanno dimostrato che la disregolazione della metilazione dell'arginina ha contribuito alla differenziazione Th17. Da un lato, l'inibizione farmacologica di PRMT1 ha impedito la generazione di cellule Th17 (94). Meccanicamente, in risposta a IL-6 e al fattore di crescita trasformante-b (TGF-b), PRMT1 ha interagito con un fattore di trascrizione chiave nella differenziazione delle cellule Th17, RORgt, e ha indotto la trascrizione e l'espressione di IL-17, che caratterizzato il fenotipo Th17 (94). Dopo la combinazione con RORgt, PRMT1 è stato reclutato nel promotore IL-17 e nell'istone 4 arginina 3 dimetilato asimmetricamente (H4R3). La metilazione di H4R3 ha stabilizzato STAT3 attivato da IL-6 e rimosso STAT5 attivato da IL-2, attenuando così l'effetto inibitorio di STAT5 sul promotore di IL-17 e incoraggiando la differenziazione Th17 (95).

Tuttavia, d'altra parte, la differenziazione Th17 è stata gravemente ostacolata in un modello con deficit di PRMT5 specifico per le cellule T, con il numero di cellule RORgt plus IL17 plus, IL-17 plus e RORgt plus Th17 molto basse in questo modello (96). Questa situazione potrebbe essersi verificata a causa di quanto segue: PRMT5 SREBP1 dimetilato simmetricamente a R321, che ha inibito la sua fosforilazione a S430 e ha impedito la degradazione di SREBP1 attraverso la via ubiquitina-proteasoma (96). Questo cambiamento ha promosso la stabilità e l'attività trascrizionale di SREBP1, un transattivatore genico che promuove la biosintesi del colesterolo, con conseguente accumulo di un potente agonista RORg endogeno, il desmosterolo (75, 97).

Oltre ai suoi effetti sulla biosintesi del colesterolo, PRMT5 ha anche migliorato il meccanismo glicolitico per regolare la differenziazione Th17. L'inibizione di PRMT5 ha soppresso l'espressione del fattore di regolazione della glicolisi, fattore inducibile dall'ipossia 1-a (HIF-1a) per promuovere la differenziazione Th17 attraverso l'attivazione trascrizionale diretta di RORgt e la promozione della via glicolitica ( 75, 83, 98). Nel complesso, metilando gli istoni per attivare il promotore IL-17 e regolare la riprogrammazione metabolica, inclusa la glicolisi e il metabolismo lipidico in seguito all'attivazione delle cellule T, i PRMT hanno promosso la differenziazione Th17.

Per le cellule Treg, FOXP3 è stato riportato come regolatore trascrizionale determinante il destino, con alti livelli di FOXP3 e stabilità richiesta per l'attività immunosoppressiva delle cellule Treg (99, 100). I PRMT regolavano attivamente la differenziazione e l'attività soppressiva delle Treg regolando FOXP3. Il PRMT1- ha catalizzato la metilazione diretta di FOXP3 a R48 e R51 potenziando la funzione soppressiva delle cellule Treg (101). Allo stesso modo, PRMT1 potrebbe anche aver influenzato l'attività delle Treg regolando altre proteine ​​che interagiscono con FOXP3, come la proteina O1 Forkhead box (FOXO1) e il fattore di trascrizione Runt-related factor 1 (Runx1) (102, 103). PRMT1 ha metilato FOXO1 a R248 e R250 per stabilizzare la proteina, e ha anche metilato Runx1 a R206 e R21 per potenziare la sua attività trascrizionale (104, 105).

Inoltre, il trattamento con AMI-1 dell'inibitore di PRMT1 ha rafforzato la sensibilità delle Treg all'espressione di FOXP3 indotta da TGF-beta e ha aumentato la frequenza e l'effetto soppressivo delle Treg migliorando direttamente l'espressione di FOXP3 (106, 107). Oltre a PRMT1, PRMT5 regolava anche l'espressione di FOXP3 nelle cellule T naive influenzando l'espressione di DNMT1 che controllava la metilazione di CpG nel promotore di FOXP3 e quindi migliorava l'accessibilità trascrizionale alle regioni regolatorie di FOXP3 (108, 109). Inoltre, l'inibizione di PRMT5 ha influenzato la modifica di H3K27me3 nel promotore di FOXP3 e ha facilitato l'espressione di FOXP3 (106). Poiché PRMT5 ha interagito con EZH2, culminando in un aumento della deposizione di H3K27me3, le alterazioni di H3K27me3 nelle cellule carenti di PRMT5 potrebbero essere state indotte dalle interazioni PRMT5-EZH2 (110).

Al contrario, Yasuhiro et al., in un modello di deficit di PRMT5-specifico delle cellule Treg, hanno osservato che l'attività soppressiva e il fenotipo degli effetti/memoria delle Treg erano ridotti, a causa della diminuzione del marcatore di dimetilazione simmetrica del locus FOXP3 R51 (111 ). Tuttavia, questi autori hanno scoperto in seguito che il deficit di PRMT5 era probabilmente collegato a manutenzione, attivazione e proliferazione difettose delle cellule Treg tramite segnalazione gc alterata piuttosto che FOXP3 metilato (73).

3.1.3.2 Attivazione e differenziazione delle cellule B mirate

Mentre le cellule T sono state a lungo al centro della ricerca sull'immunità tumorale, altri sottoinsiemi di cellule immunitarie sono rilevanti in questo campo, in particolare per quanto riguarda il concetto di struttura linfoide terziaria (TLS). Piuttosto che richiedere alle DC di migrare dal sito del tumore agli SLO, l'ipotesi TLS postula che questo fenomeno si verifichi direttamente negli organi linfoidi ectopici, generati da tessuto non linfoide che si infiltra nei margini del tumore e nello stroma (112). Tali strutture sono costituite da una zona di cellule CD3 più T e una zona di cellule CD20 più B, con la prima contenente DC positive per glicoproteina di membrana associata al lisosoma DC e reticolociti di fibroblasti, e la seconda contenente centri germinativi, plasmacellule, DC follicolari e complessi antigene-anticorpo (113). Nel TLS, gli antigeni associati al tumore attivano la trasformazione delle cellule B in un fenotipo effettore/memoria che produce anticorpi e presenta antigeni tumorali alle cellule T, potenziando così la funzione prognostica delle cellule T CD8 più e promuovendo la crescita delle cellule T (113). Elevati livelli di cellule T CD8 plus e CD4 plus co-localizzanti con una considerevole infiltrazione di cellule CD20 plus B sono stati associati alla sopravvivenza clinica a lungo termine (114).

Inoltre, diverse chemochine sono state secrete dalle cellule B per reclutare DC, cellule T e cellule NK (113). Sia gli studi clinici di coorte che quelli analitici della TME hanno identificato correlazioni positive tra le risposte dei pazienti alla terapia con ICB e l'infiltrazione di cellule B e la formazione di TLS. Questi studi hanno evidenziato il ruolo finora non apprezzato delle cellule B nell'immunità antitumorale umana, pertanto i tumori insensibili all'ICB potrebbero rispondere meglio alle terapie emergenti mirate all'attività delle cellule B (115-117).

PRMT1, PRMT5 e PRMT7 regolano la proliferazione e la differenziazione delle cellule pre-B, la formazione del centro germinale e le risposte anticorpali. Nei topi con deficit di PRMT1-specifico delle cellule B, il numero di cellule B nel midollo osseo e in altri organi linfoidi periferici era significativamente ridotto (118), mentre lo sviluppo delle cellule B era gravemente ridotto allo stadio pre-cellulare (119 ). Le cellule B attivate hanno mostrato un aumento dei livelli di proteina PRMT1 e arginina-metilata. Sottoregolando i geni che attivano la ricombinazione, Rag1 e Rag2, FOXO1 ha bloccato la progressione della differenziazione delle cellule B oltre lo stadio delle cellule pro-B (120). Yamagata et al. hanno mostrato che PRMT1 metilava direttamente FOXO1 per inibire la fosforilazione da parte di AKT e la successiva degradazione proteasomica (105). Inoltre, PRMT1 ha anche metilato la subunità Iga del recettore delle cellule B (BCR) per inibire l'attivazione Syk indotta da BCR e la segnalazione della fosfoinositide 3-chinasi (PI3K), ha bloccato la degradazione della proteina FOXO e ha promosso la differenziazione delle cellule pre-B piuttosto che proliferazione (121, 122).

Pertanto, PRMT1 ha regolato negativamente gli eventi di segnalazione delle cellule B come la ricombinazione del cambio di classe e la selezione dell'antigene tramite la segnalazione PI3K-FOXO1, facilitando così lo sviluppo dalle cellule pre-B alle cellule B immature. Inoltre, PRMT1 ha mediato la metilazione dell'arginina del CDK4, ha destabilizzato il complesso CDK4-ciclina-D3, ha indotto l'arresto del ciclo cellulare e ha promosso la differenziazione delle cellule pre-B (119). In un modello murino carente di PRMT1-del compartimento periferico delle cellule B, la proliferazione e la differenziazione delle cellule B mature dopo la stimolazione erano gravemente ostacolate, la generazione delle cellule del centro germinale B (GC-B) era difettosa e l'attivazione e la proliferazione delle cellule B di memoria erano notevolmente ridotto (121). PRMT1 ha anche mantenuto il numero di cellule follicolari B (FO-B) e promosso la formazione del centro germinale (GC) dopo l'attivazione delle cellule FO-B (118). PRMT1 proteggeva le cellule B attivate dall'apoptosi regolando l'espressione delle proteine ​​pro-sopravvivenza della famiglia BCL2, MCL1, BCL2, A1 e BCLX (121).

Litzler et al. hanno riferito che sia la proteina PRMT5 che i livelli di sDMA erano sovraregolati negli stadi di proliferazione delle cellule B e che PRMT5 promuoveva la sopravvivenza delle cellule B attivate (123). PRMT5 era necessario per lo sviluppo delle cellule B nelle cellule Pro-B e Pre-B. PRMT5 proteggeva le cellule B mature dall'apoptosi e promuoveva la proliferazione e la formazione di GC regolando la trascrizione delle cellule B e la fedeltà dello splicing (123). Inoltre, PRMT5 interagiva direttamente con e metilava BCL6 per facilitare la repressione trascrizionale mediata da BCL6-, regolando così la formazione di GC (124). Anche i geni bersaglio BCL6 Irf4 e Prdm1, che mediano la differenziazione plasmacellulare, sono stati sottoregolati da PRMT5 (123).

Utilizzando un modello di topo knockout PRMT7 specifico per le cellule B, Ying et al. hanno dimostrato che la perdita di PRMT7 compromette lo sviluppo delle cellule B, riduce le cellule della zona marginale B (MZ-B), aumenta le cellule FO-B e promuove la formazione di GC dopo l'immunizzazione (125). L'esaurimento di PRMT7 ha aumentato l'espressione di Bcl6 reclutando H4R3me1 e H4R3me2 simmetrico al promotore di Bcl6. Anche la differenziazione dei sottotipi di plasmacellule secernenti IgA e IgG1- era diminuita nei topi carenti di PRMT7-, probabilmente perché la perdita di PRMT7 induceva l'up-regulation di Bcl6 e inibiva Irf4 e Prdm1 nelle cellule GC-B (125 ).

3.1.3.3 Mirare alla differenziazione dei macrofagi associati al tumore (TAM) e all'espressione di altre cellule immunitarie

Prove crescenti hanno ora indicato che la TME altera le cellule immunitarie per sopprimere la sorveglianza immunitaria e le risposte immunologiche (126). I macrofagi M1 classicamente attivati ​​tendono a fagocitare le cellule tumorali stabilendo un ambiente pro-infiammatorio e facilitando le risposte Th1 e CTL.

Tuttavia, i macrofagi M2 attivati ​​in alternativa come i TAM promuovono la crescita e l'invasione tumorale aumentando la polarizzazione Th2, l'angiogenesi tumorale e inibendo le risposte immunitarie antitumorali (127). Le DC sono specializzate nell'elaborazione e nella presentazione dell'antigene, mentre le NK identificano efficacemente le cellule tumorali e utilizzano la citotossicità mediata da perforina/granzima per limitare la crescita tumorale, mentre le MDSC accumulate esercitano importanti effetti immunosoppressivi piuttosto che differenziarsi in cellule mieloidi mature (128).

Utilizzando un modello murino knock-out PRMT1 specifico per la mieloide, Tikhanovich et al. ha mostrato che PRMT1 era richiesto per la differenziazione dei macrofagi M2. L'induzione di PRMT1 è stata osservata durante la differenziazione da monociti a macrofagi, che ha portato alla deposizione di H4R3me2a sul promotore del recettore g attivato dal proliferatore del perossisoma (PPARg) che ha migliorato l'espressione di PPARg (un fattore di trascrizione chiave richiesto per la differenziazione del fenotipo M2). La delezione specifica dei macrofagi di PPARg ha compromesso la maturazione dei macrofagi M2 alternativamente attivati ​​(129, 130). In linea con questo studio, PRMT1 ha indotto la polarizzazione dei macrofagi ai tipi M2 e ha aumentato l'espressione di IL-6 e STAT3 a valle promuovendo l'efferocitosi macrofagica PPARg-dipendente per consumare corpi apoptotici in un modello murino di carcinoma epatocellulare alcol-dipendente (131).

Inoltre, il deficit di PRMT1 ha ridotto i tipi M2 attraverso la via PPARg mediata da c-Myc, che ha influenzato il traffico, l'efferocitosi, la fagocitosi e l'attivazione alternativa dei macrofagi (132-134). PRMT1 ha anche metilato c-Myc a R299 e R346 per aumentare la sua capacità di legarsi a p300, invece che a HDAC1. Questo potenziamento del reclutamento del complesso c-Myc-p300 nei geni ha innescato la successiva trascrizione M2, come i promotori di PPARg e del recettore del mannosio C-tipo 1 (MRC1) (129).

Inoltre, i PRMT hanno influenzato l'espressione e la funzione di c-MYC in altre linee cellulari come segue: 1) PRMT1 e CARM1 hanno depositato marcatori H4R3me2a sul promotore del gene cMYC, che sono stati letti dalla proteina 3 contenente il dominio Tudor (TDRD3)-topoisomerasi IIIB (TOP3B ) trascrizione c-MYC complessa e facilitata (135). 2) PRMT5 ha metilato i siti R218 e R225 nella ribonucleoproteina nucleare eterogenea A1 (hnRNP A1) per regolare la traduzione dipendente dal sito di ingresso del ribosoma interno (IRES) di c-MYC (136). 3) L'inibizione enzima-dipendente della poliubiquitinazione di c-MYC da parte di PRMT3 ha eliminato la degradazione di C-MYC mediata dall'ubiquitina (137) e 4) l'etichettatura H4R3me2 mediata da PRMT5- era ricca di legame di c-Myc a CANNTG E- elementi scatolari e funzione MYC regolata (138).

PRMT6 ha anche promosso la progressione del tumore facilitando la differenziazione dei macrofagi al fenotipo M2 piuttosto che al fenotipo M1 e supportando la neoangiogenesi tumorale. PRMT6 ha interagito con ILF2 nell'adenocarcinoma polmonare per regolare la sintesi dei fattori inibitori della migrazione dei macrofagi per indurre l'attivazione alternativa del TAM (139, 140).

La metilazione dell'arginina ha colpito anche altre cellule immunitarie, ad eccezione dei macrofagi. L'inibitore della piccola molecola CARM1, i tumori trattati con EZM2302 sono stati infiltrati da un gran numero di cellule dendritiche, cellule cDC1 a presentazione incrociata e cellule NK. Coerentemente, in un modello tumorale knockdown PRMT 5-, è stata osservata una maggiore abbondanza di NK, DC e MDSC rispetto al modello knockdown di controllo (19, 79).

Quando combinati, i PRMT hanno ruoli essenziali nella regolazione della differenziazione dei macrofagi e della proliferazione delle cellule NK, DC e MDSC. Queste funzioni non solo forniscono nuove prospettive per l'attivazione alternativa dei macrofagi, ma potrebbero identificare nuovi bersagli terapeutici per il cancro.

3.2 PRMT e segnalazione IFN di tipo I

Gli IFN di tipo I facilitano l'immunosorveglianza del cancro, l'immunità antitumorale e l'efficacia dell'immunoterapia in diversi modi, in particolare stimolando la maturazione delle DC e migliorando la loro capacità di elaborare e presentare gli antigeni nel ciclo dell'immunità innata del cancro (141). Gli IFN di tipo aumentano anche l'espressione dei mediatori citotossici nei CTL e impediscono alle cellule NK di eliminare i CD8 più i CTL attivati, mantenendo contemporaneamente il fenotipo della memoria e influenzando le funzioni soppressive delle Treg (142). Quando diverse classi di recettori per il riconoscimento del pattern (PRR), inclusi i recettori Toll-like (TLR), i recettori I-like (RLR) del gene retinoico sensibile all'RNA (RIG) e i sensori del DNA citosolico riconoscono i pattern molecolari associati ai patogeni o modelli molecolari associati al danno, viene indotto il reclutamento di TBK1, insieme alla successiva attivazione di IRF3/7 e NF-kB, che convenzionalmente aumentano l'espressione del gene stimolato dall'IFN (ISG) e la generazione di IFN di tipo I (143). È concepibile che la stimolazione appropriata degli IFN di tipo I e le relative vie di segnalazione possano essere sviluppate come efficaci immunoterapie antitumorali.

3.2.1 Percorsi PRMT e TLR

Il riconoscimento del modello molecolare associato al patogeno da parte dei TLR contribuisce alla sovraregolazione trascrizionale di geni distinti. Il fattore 6 (TRAF6) associato al recettore del fattore di necrosi tumorale (TNFR) è stato identificato come chiave per la via di segnalazione dipendente dalla risposta primaria 88 (MyD88) della differenziazione mieloide con funzioni immunoregolatorie, che era a valle dei TLR (143). PRMT1 ha metilato e disattivato TRAF6 per sopprimere la via TLR dipendente da TRAF6-. Questa soppressione è stata invertita dal dominio jumonji contenente 6 (JMJD6), con TRAF6 demetilato da JMJD6. Il rapporto PRMT1/JMJD6 ha determinato l'attivazione del percorso TLR dipendente da MyD88-. La metilazione dell'arginina di TRAF6 è stata associata a una minore attività di TRAF6 e NF-kB a valle, mentre l'esposizione al ligando TLR ha ridotto transitoriamente PRMT1, portando alla demetilazione di TRAF6 da parte di JMJD6 e attivazione di NF-kB, quindi, una volta terminato il segnale, PRMT1 ha ri- bloccato il percorso dipendente da TRAF6- (144) (Figura 3).

3.2.2 PRMT e percorso RIG-I

Nel percorso RIG-I, è stato identificato un ruolo importante per PRMT5 nella metilazione IFI16/IFI204; La metilazione di IFI16/IFI204 ha attivato le risposte dell'interferone di tipo I mediate da RIG-I/TLR3- indotte da dsRNA, anche se IFI16/IFI204 di solito serviva come proteina di rilevamento del DNA (19, 145). PRMT7 ha formato aggregati alla proteina di segnalazione antivirale mitocondriale mono-metilata (MAVS) a R52, inibendo la sua interazione con RIG-I e TRIM31-ha attivato la poliubiquitinazione legata a MAVS K63- in modo cataliticamente dipendente. L'attivazione di MAVS e gli eventi molecolari indotti dal virus a valle (fosforilazione di IRF3, IkB e STAT1) sono stati inibiti da PRMT7, ma salvati dall'inibitore di PRMT7, SGC3027 (146). MAVS ha reclutato sia TRAF3 che TRAF6 per formare il complesso MAVS/TRAF3/TRAF6 che ha interagito con TBK1 e IKK per attivare la produzione di IRF3 e IFN di tipo I (147). Nelle prime fasi dell'infezione virale, PRMT7 è stato auto-metilato a R32, disabilitando la sua attività enzimatica e l'aggregazione. SMURF1 è stato quindi reclutato in PRMT7 in modo dipendente da MAVS per catalizzare la poliubiquitinazione legata a K48- di PRMT7 per garantire la sua tempestiva degradazione proteasoma e la successiva attivazione di RIG-I-MAVS, mentre SMURF1 ha degradato MAVS, TRAF3, TRAF6 o USP25 negli stadi successivi dell'infezione virale per evitare un'eccessiva attivazione del segnale RLR (146).

In zebrafish, PRMT2, PRMT3 e PRMT7 hanno attenuato le risposte antivirali sopprimendo la via di segnalazione RIG-IMAVS. L'auto-ubiquitinazione di TRAF6 legata a Lys63- è stata impedita dalla dimetilazione asimmetrica mediata da PRMT2- di R100 a TRAF6, inattivando così la segnalazione Nemodipendente TBK1/IKKϵ (148). PRMT2 ha anche gareggiato con MAVS per il legame TRAF6 e ha impedito il reclutamento di TBK1/IKKϵ in MAVS (148). Attraverso i due meccanismi sopra menzionati, PRMT2 controllava negativamente la fosforilazione di IRF3/IRF7 e l'espressione dei geni IFN di tipo I a valle (148). Questi autori hanno anche suggerito che sia PRMT3 che PRMT7 influenzassero la fosforilazione di IRF3 e sopprimessero la produzione di IFN interagendo con RIG-I (149, 150) (Figura 4).