Le analisi di proteomica e citochine distinguono i casi di encefalomielite mialgica/sindrome da stanchezza cronica dai controlli Parte 1

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SfondoL'encefalomielite mialgica/sindrome da stanchezza cronica (ME/CFS) è una malattia complessa ed eterogenea caratterizzata da stanchezza persistente inspiegabile e altre caratteristiche tra cui deterioramento cognitivo, mialgie, malessere post-sforzo e disfunzione del sistema immunitario. Le citochine sono presenti nel plasma e incapsulate in vescicole extracellulari (EV), ma ci sono stati solo pochi rapporti sulle caratteristiche e sul carico delle EV nella ME/CFS. Diversi piccoli studi hanno precedentemente descritto le proteine ​​plasmatiche o i percorsi proteici associati alla ME/CFS.

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MetodiAbbiamo preparato vescicole extracellulari (EV) da campioni di plasma congelato da una coorte di casi e controlli di encefalomielite mialgica/sindrome da stanchezza cronica (ME/CFS) con dati precedentemente pubblicati sulle citochine plasmatiche e sulla proteomica plasmatica. Il contenuto di citochine delle vescicole extracellulari derivate dal plasma è stato determinato mediante un test multiplex e sono state valutate le differenze tra pazienti e controlli. Abbiamo quindi eseguito analisi statistiche multi-omiche che hanno considerato non solo questi nuovi dati ma anche ampi dati clinici che descrivono la salute dei soggetti.

Risultatinei casi di ME/CFS hanno mostrato dimensioni e concentrazione maggiori di EV nel plasma. I test del contenuto di citochine nei veicoli elettrici hanno rivelato che IL2 era significativamente più alto in alcuni casi. Abbiamo osservato numerose correlazioni tra citochine EV, citochine plasmatiche e proteine ​​plasmatiche dalla proteomica della spettrometria di massa. Correlazioni significative tra dati clinici e livelli proteici suggeriscono il ruolo di particolari proteine ​​e percorsi nella malattia. Ad esempio, livelli più elevati delle citochine pro-infiammatorie Fattore stimolante le colonie di granulociti-monociti (CSF2) e Fattore di necrosi tumorale (TNF) erano correlati con maggiori sintomi fisici e di affaticamento nei casi di ME/CFS. Un livello più elevato di serina proteasi SERPINA5, che è coinvolta nell’emostasi, è stato correlato con punteggi di salute generale SF-36 più alti nella ME/CFS. I classificatori di machine learning sono stati in grado di identificare un elenco di 20 proteine ​​in grado di discriminare tra casi e controlli, con XGBoost che ha fornito la migliore classificazione con una precisione dello 86,1% e un valore AUROC con convalida incrociata di { {15}}.947. Random Forest ha distinto i casi dai controlli con una precisione del 79,1% e un valore AUROC di 0,891 utilizzando solo 7 proteine.

ConclusioniQuesti risultati si aggiungono al numero sostanziale di differenze oggettive nelle biomolecole che sono state identificate negli individui con ME/CFS. Le correlazioni osservate delle proteine ​​importanti nelle risposte immunitarie e nell'emostasi con i dati clinici implicano ulteriormente un disturbo di queste funzioni nella ME/CFS.

Parole chiaveEncefalomielite mialgica/sindrome da stanchezza cronica, Vescicole extracellulari, Plasma, Proteomica, Citochine

Sfondo

L’encefalomielite mialgica/sindrome da stanchezza cronica (ME/CFS) è una malattia grave che può essere diagnosticata dopo 6 mesi di nuova fatica debilitante, malessere post-sforzo, sonno non ristoratore e uno o entrambi due sintomi aggiuntivi, difficoltà cognitiva o intolleranza ortostatica. 1]. La maggior parte dei pazienti riferisce che i sintomi sono insorti dopo una malattia di tipo virale, ma l'identità dell'infezione precedente è quasi sempre sconosciuta, sebbene talvolta sia stata implicata la famiglia degli enterovirali [2, 3]. Si stima che prima del 2020, 65 milioni di persone in tutto il mondo soffrissero di ME/CFS [4]. Dalla pandemia di SARS-COV2, un sottogruppo di individui che hanno sofferto di COVID acuto-19 ha continuato a manifestare sintomi [5], e alcune vittime di COVID a lungo termine-19 soddisfano la diagnosi ME/CFS criteri sopra descritti [6]. Allo stesso modo, gli individui che soffrono della Malattia della Guerra del Golfo hanno sintomi che si sovrappongono sia al COVID lungo che alla ME/CFS [7]. Tuttavia, diversi test, come il neuroimaging [8], distinguono la malattia della Guerra del Golfo e la ME/CFS. Non è ancora noto se anche il COVID lungo e la ME/CFS non associati all’infezione da SARS-CoV-2 verranno differenziati attraverso l’imaging o altre misure.

È stato riportato che le proteine ​​legate al sistema immunitario innato e coinvolte nella cascata del complemento così come nei percorsi legati alla segnalazione della dopamina sono arricchite nei pazienti ME/CFS rispetto ai controlli in studi che analizzano il liquido cerebrospinale [9, 10 ]. Attraverso l’analisi della spettrometria di massa del plasma, sono state riportate anche disregolazioni nel metabolismo energetico, lipidico e degli aminoacidi nella ME/CFS [11–13]. Ma più recentemente, un’analisi del proteoma plasmatico correlato alla ME/CFS utilizzando cromatografia liquida ultra-prestazioni non mirata e spettrometria di massa tandem ha identificato diversi profili tra pazienti ME/CFS, così come sottogruppi ME/CFS (con o senza IBS), e controlli e un insieme di proteine ​​che possono predire lo stato della ME/CFS con un grado di accuratezza ragionevolmente elevato (Area sotto la curva (AUC)=0.774–0.838) [14].

È noto che la funzione immunitaria e le risposte infiammatorie sono regolate da citochine che agiscono come modulatori e che la loro secrezione può avvenire in modo classico o tramite incapsulamento in vescicole extracellulari, proteggendole dagli enzimi degradanti [15]. I veicoli elettrici sono uno dei principali partecipanti alla comunicazione cellula-cellula e guidano patologie infiammatorie, autoimmuni e infettive [16-19] e rapporti precedenti hanno mostrato un aumento del numero di veicoli elettrici circolanti, non solo nei tumori e nel morbo di Alzheimer [17, 20–22], ma anche nella ME/CFS [23–25]. Un recente studio sugli EV isolati da pazienti ME/CFS e da soggetti con stanchezza cronica idiopatica e depressione clinica è stato in grado di distinguere i due gruppi con un’AUC di 0,802 utilizzando esclusivamente i numeri di EV circolanti, che hanno consentito una diagnosi corretta nel 90-94% dei pazienti. Casi di ME/CFS [24].

È urgentemente necessaria un’ulteriore caratterizzazione molecolare della ME/CFS per fornire approfondimenti sui disturbi che si verificano nella malattia. Gli studi multi-omici condotti sullo stesso insieme di soggetti hanno un alto potenziale per fornire nuove ipotesi. Inoltre, essere in grado di distinguere i soggetti ME/CFS dai controlli sani con elevata sensibilità e specificità consentirebbe il monitoraggio dell’effetto delle terapie sperimentali. L’utilizzo di campioni di sangue per valutare le anomalie associate alla ME/CFS sarebbe particolarmente prezioso rispetto ai metodi che sono più invasivi o ingombranti.

In questo studio, abbiamo isolato vescicole extracellulari (EV) da campioni di sangue raccolti prima del 2020 da soggetti ME/CFS e controlli sani e misurato il loro contenuto di citochine. Questi dati appena generati insieme ai dati già pubblicati da un'analisi proteomica del plasma con spettrometria di massa tandem [14] e dalla determinazione dei livelli di citochine plasmatiche [26] sugli stessi campioni sono stati utilizzati insieme per molteplici analisi statistiche. Abbiamo identificato una serie di citochine EV che differiscono significativamente nei livelli tra soggetti ME/CFS e controlli. Abbiamo osservato correlazioni tra i livelli di diverse citochine EV, tra i livelli di citochine plasmatiche, tra citochine EV e citochine plasmatiche e tra citochine e altre proteine ​​plasmatiche. Abbiamo anche rilevato relazioni tra le citochine plasmatiche e la gravità di alcuni sintomi della ME/CFS. Nei controlli, i livelli di quattro proteine ​​plasmatiche erano correlati a misure sanitarie. Una proteina coinvolta nell'emostasi, SERPINA5, era correlata positivamente con punteggi di funzione SF-36 più elevati. Utilizzando l'apprendimento automatico, abbiamo identificato le 20 proteine ​​con i valori di importanza delle caratteristiche più elevati. Utilizzando questi 20 analiti e XGBoost, abbiamo potuto discriminare i soggetti ME/CFS e quelli di controllo con sensibilità e specificità estremamente elevate (AUC=0.947).

Metodi

Studio della popolazione

Una sottopopolazione di 49 casi di ME/CFS e 49 controlli sani dalla coorte della Chronic Fatigue Initiative [27] sono stati analizzati nel quadro di questo attuale studio. Tutti i casi soddisfacevano i criteri di consenso canadesi del CDC Fukuda del 1994 [28] e/o del 2003 per la ME/CFS [29]. Il giorno del prelievo del sangue, i sintomi clinici e lo stato di salute di base sono stati valutati utilizzando la scala Short Form 36 Health Survey (SF-36) ​​[30] e la scala Multidimensional Fatigue Inventory (MFI) [31]. Il sangue periferico è stato prelevato in provette di preparazione cellulare BD VacutainerTM con citrato di sodio e centrifugato per sedimentare i globuli rossi. I campioni di plasma risultanti sono stati ricevuti da quattro località dai medici supervisori, come mostrato: Salt Lake City, Utah (Lucinda Bateman), Incline Village, Nevada (Daniel Peterson), Miami, Florida (Nancy Klimas) e New York City, New York (Susan Levine) e conservato a – 80 gradi e spedito dalla Columbia University alla Cornell University su ghiaccio secco e conservato a – 80 gradi prima del trattamento per l'isolamento delle vescicole extracellulari. Il consenso scritto è stato ottenuto da tutti i partecipanti e tutti i protocolli sono stati approvati dall'Institutional Review Board presso l'Irving Medical Center della Columbia University.

Purificazione delle vescicole extracellulari

Le vescicole extracellulari (EV) sono state isolate dai campioni di plasma mediante precipitazione utilizzando il reagente ExoQuick™ (System Biosciences, Palo Alto, CA, USA) come precedentemente descritto [25]. In breve, i campioni di plasma di ciascun soggetto sono stati scongelati su ghiaccio e centrifugati a 3000×g per 15 minuti a temperatura ambiente per rimuovere cellule e detriti. È stata aggiunta trombina (611 U/ml) (System Bioscience, Palo Alto, CA, USA) e i campioni sono stati incubati per 5 minuti a temperatura ambiente per rimuovere il fibrinogeno, centrifugati a 10,000×g per 5 minuti e è stato raccolto il surnatante. I campioni sono stati quindi incubati con ExoQuick™ per 60 minuti a 4 gradi, centrifugati a 12.000×g per 5 minuti e il pellet risultante è stato risospeso in 250 ul di soluzione salina sterile tamponata con fosfato 1X, pH 7,4. I campioni sono stati suddivisi in aliquote per la quantificazione di citochine/chemochine e fattori di crescita.

Dimensioni e quantificazione delle vescicole extracellulari

La concentrazione e la distribuzione dimensionale dei veicoli elettrici isolati sono state analizzate nei campioni utilizzando uno strumento NanoSight NS300 (Malvern, Worcestershire, Regno Unito) presso la Cornell Nanoscale Science and Technology Facility. I campioni sono stati scongelati e diluiti a 1:2000 in PBS 1X e 1 ml è stato iniettato attraverso la camera laser (NanoSight Technology, Londra, Regno Unito). Le registrazioni dell'albero di 60 video digitali di ciascun campione sono state acquisite e analizzate dal software NanoSight NTA 2.3 per determinare la dimensione e la concentrazione delle nanoparticelle. I risultati sono stati mediati insieme.

Profilazione immunitaria del plasma e delle vescicole extracellulari

Le molecole immunitarie nel plasma sono state precedentemente misurate utilizzando un test immunologico 61-plex basato su sfere magnetiche (test immunologico ProcartaTM personalizzato, Affymetrix) [26]. Il profilo immunitario delle vescicole extracellulari è stato eseguito presso il laboratorio del servizio di chimica nutrizionale umana della Cornell University utilizzando un kit di sfere magnetiche umane 48-plex (Bio-Plex Pro Human Cytokine Screening Panel, 48-plex, Bio-Rad ). Prima dell'analisi, i campioni di EV sono stati trattati con Triton 1% per consentire il rilascio di citochine incapsulate [32]. Ciascun campione è stato misurato in duplicato su un sistema multiplexing MAGPIX® (Luminex Corp.). Per ciascun pozzetto, abbiamo utilizzato l'intensità mediana della fluorescenza di tutte le sfere misurate per un dato analita e calcolato la media dei due replicati; i risultati sono stati accettati quando il coefficiente di variazione (CV) era inferiore al 15%.

Proteomica del plasma

La profilazione proteomica del plasma è stata condotta presso la Columbia University come precedentemente descritto [14]. I campioni dai 49 casi di ME/CFS e dai 49 controlli inclusi in questo studio sono stati analizzati in due lotti di 20 campioni (11 casi di ME/CFS, 9 controlli) e 78 campioni (38 casi di ME/CFS, 40 controlli). I 20 campioni del primo lotto sono stati selezionati casualmente. I casi e i controlli sono stati abbinati in frequenza sulle stesse variabili di corrispondenza della popolazione totale dello studio. Un totale di 257 e 279 proteine ​​annotate sono state misurate rispettivamente nel 20-set di campioni soggetto e nel 78-set di campioni soggetto, con una sovrapposizione di 207 proteine ​​annotate in entrambi i set di campioni.

analisi statistica

Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando la versione R 4.0.2 (2020-06-22) tramite RStudio. Per ciascun analita proteico, i valori non rilevabili sono stati sostituiti con la metà del loro valore minimo. I livelli proteici sono stati quindi trasformati in logaritmo con la base 2 e standardizzati per ulteriori analisi. I punteggi Z e i valori P sono stati calcolati per l'analisi dei valori anomali. I test non parametrici dei ranghi di Wilcoxon sono stati eseguiti per testare la significatività delle differenze (p<0.05) between cases and controls for age, BMI, SF-36 survey scores, and EV sizes and concentrations. The robust linear regression was performed using the lm function in the MASS package for determining the significance of differences for each analyte in control and ME/CFS groups with age, BMI, Irritable Bowel Syndrome (IBS), and sex as confounding variables. Robust linear regression was performed to eliminate contamination with outliers or influential observations. Robust linear regression is a form of weighted least squares regression, and we chose M-estimation with Huber weighting [33, 34] for further analysis.

L'analisi delle componenti principali (PCA) è stata utilizzata per semplificare i dati e aumentare l'interpretabilità riducendo la dimensionalità dei set di dati sui livelli proteici. La PCA è stata eseguita utilizzando il pacchetto di statistiche nei coefficienti di correlazione dei ranghi di R. Spearman sono stati stimati anche all'interno degli analiti proteici e tra le proteine ​​e i metadati (età, BMI, sesso, punteggi SF-36, IBS). Le correlazioni punto-biseriali sono state utilizzate quando una delle variabili era binaria (ad esempio, femmina vs maschio, con vs senza IBS). Le variabili categoriali sono state codificate come segue: Coorte: controllo=0; ME/CFS=1; Sesso: femmina=0; maschio=1; IBS: nessun IBS=0; con IBS=1. In tutto, tutti i valori p sono stati aggiustati per più ipotesi utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg (FDR) [35, 36].

È stato utilizzato un approccio di machine learning per identificare le variabili che discriminano i due gruppi di campioni (selezione delle caratteristiche). La classificazione dei campioni come ME/CFS o controlli sani è stata effettuata utilizzando tre algoritmi di apprendimento supervisionato: foresta casuale [37] implementata utilizzando la funzione Random Forest di R; XGBoost [38] utilizzando il pacchetto xgboost di R e la penalità dell'operatore di selezione e ritiro assoluto minimo (LASSO) [39] applicata alla regressione logistica utilizzando la funzione R glmnet. Come caratteristiche, gli algoritmi hanno utilizzato tutti i 353 analiti proteici, citochine EV, citochine plasmatiche e proteomica plasmatica. È stata calcolata l'importanza delle funzionalità per ciascun classificatore. Per LASSO, i coefficienti delle caratteristiche "non importanti" sono ridotti a zero, quindi l'importanza delle caratteristiche può essere valutata in base alla "percentuale" (su 250 iterazioni di convalida incrociata di ricampionamento casuale) in cui la stima del parametro del predittore nel modello più adatto è diversa da zero. Per la foresta casuale, la "Diminuzione media dell'accuratezza (MDA)" di una caratteristica è la diminuzione dell'accuratezza della classificazione dovuta alla permutazione casuale dei valori in quella caratteristica. Per i predittori non importanti, la permutazione dovrebbe avere un effetto minimo o nullo sull'accuratezza del modello, mentre la permutazione dei valori di predittori importanti dovrebbe ridurla in modo significativo. Pertanto, maggiore è l'importanza di una caratteristica, maggiore sarà la diminuzione della precisione quando i suoi valori vengono permutati. Infine, per XGBoost, la metrica "Gain" indica il guadagno medio su tutti gli alberi in cui viene utilizzata la funzionalità, che descrive il contributo relativo di ciascuna funzionalità.

L'importanza delle funzionalità è stata calcolata mediante la media di oltre 250 repliche di cinque volte la convalida incrociata. Gli analiti proteici classificati tra i primi 20 in termini di misurazioni di importanza in tutti e tre i classificatori (Tabella 5) sono stati nuovamente inseriti come predittori negli stessi classificatori. Le curve delle caratteristiche operative del ricevitore (ROC) e l'area sotto la curva (AUC) utilizzate per ottimizzare la selezione delle funzionalità sono state calcolate utilizzando il simbolo del pacchetto R. I dati sono stati trasformati in logaritmo e ridimensionati automaticamente prima della generazione delle curve ROC. Una penalità lazo viene utilizzata quando vengono selezionati molti predittori e variabili importanti per la previsione. Poiché stavamo utilizzando variabili già determinate come importanti, nella Figura 8 è stata utilizzata la regressione logistica non regolarizzata anziché la penalità del lazo. Le AUC medie sono state calcolate con 250 ripetizioni di cinque volte la convalida incrociata, che ha lo scopo di derivare una stima più accurata del modello prestazione della previsione. L'importanza delle funzionalità è stata calcolata per ciascuno dei tre algoritmi di machine learning.

Risultati

Studiare le caratteristiche della popolazione

All'interno della popolazione dello studio, c'erano 41 femmine e 8 maschi e 40 femmine e 9 maschi rispettivamente nei gruppi ME/CFS e controlli sani (Tabella 1). Tutti i pazienti che sono stati selezionati soddisfacevano la definizione Fukuda del 1994 per la ME/CFS. L'età media e l'Indice di Massa Corporea (BMI) erano simili tra i soggetti ME/CFS e quelli di controllo e anche nel confronto dei sessi tra i gruppi (Tabella 1). Il 79% dei pazienti ME/CFS era in grado di identificare una malattia acuta, spesso come una malattia che precedeva immediatamente l'esordio della malattia, mentre il 20% non era a conoscenza di un evento iniziale e considerava il suo esordio come graduale (Tabella 1) e 45 pazienti su 49 presentavano la malattia da più di 3 anni. I punteggi MFI-20 descrivono la tendenza opposta della condizione dei soggetti ME/CFS rispetto ai controlli, con un punteggio più alto che riflette il livello funzionale inferiore dei pazienti rispetto al punteggio più piccolo dei controlli pienamente funzionali (Tabella 1, p < 0,001 ). Inoltre, sia i punteggi delle componenti fisiche che quelli mentali (rispettivamente PCS e MCS) derivati ​​dal breve sondaggio SF-36 erano, come previsto, più alti nel gruppo di controllo (p < 0,001, Tabella 1).

L'analisi delle componenti principali presentata in Fig. 1 è stata eseguita sui dati ottenuti dai questionari SF-36 e MFI-20. I primi due componenti principali spiegavano 86.9% (PC-1 75.1%; PC-2 11.8%, Fig. 1a) e 92.6% (PC-1 86. 89%; PC-2 5.73%, Fig. 1b) della varianza totale all'interno del set di dati rispettivamente per SF-36 e MFI-20 e sono stati osservati due cluster significativi, che separano i gruppo ME/CFS dal gruppo di controllo. Né la stagione né il luogo in cui è stato raccolto il sangue hanno potuto distinguere i gruppi (file aggiuntivo 1: Fig. S1).

Le dimensioni e le concentrazioni delle vescicole extracellulari sono diverse tra la ME/CFS e i controlli sani

Le vescicole extracellulari sono state purificate da campioni di plasma di pazienti ME/CFS e individui sani mediante precipitazione e le loro dimensioni e concentrazioni sono state analizzate mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per indagare se ci fossero differenze tra i gruppi clinici. Tutte le nanoparticelle purificate erano più piccole di 500 nm, la maggior parte di esse rientrava nel tipico intervallo di dimensioni dell'esosoma di 30-130 nm [40]. L'NTA ha rivelato che le dimensioni medie delle particelle EV differivano tra individui sani (136,2±18,3 nm, intervallo 97–188 nm) e pazienti ME/CFS (145,3±16,6 nm, intervallo 113–177 nm) (p=0.01 , Figura 2a). La concentrazione totale media di particelle/ml di plasma (controlli: 8,0±3,8× 108; ME/CFS: 10,5±3,9× 108, p<0.001, Fig. 2b), the mean concentration of EVs that ranged from 30 to 130 nm in size (controls:4.3±1.8× 108,  ME/CFS:5.3±2.4× 108, p=0.05, Fig. 2c) and the mean concentration of particles greater than 130 nm (controls: 3.7±2.9× 108; ME/CFS: 5.6±2.7× 108, p<0.001, Fig. 2d) also exhibited a statistically significant difference between groups.

L'analisi dei valori anomali comporta la rimozione dei dati di alcuni soggetti da ulteriori considerazioni

Abbiamo esaminato il numero di analiti anomali nei set di dati. Qualsiasi analita con più della metà dei valori non rilevabili è stato scartato, quindi 6 delle 61 citochine plasmatiche sono state rimosse. Per ciascun soggetto e ciascun analita è stato calcolato un punteggio z. Qualsiasi coppia soggetto/analita con un valore q bilaterale (valore p aggiustato per FDR) inferiore a 0,05 è stata considerata un valore anomalo. I valori q risultanti suggeriscono che due pazienti ME/CFS presentavano profili anomali non inizialmente sospettati dalle loro caratteristiche cliniche e quindi dovrebbero essere rimossi dal dataset delle citochine EV in quanto rappresentavano rispettivamente il 43% e il 50% dei valori anomali (21 e 24 valori anomali su 48 citochine). Per il set di dati sulle citochine plasmatiche, nessun soggetto aveva una percentuale particolarmente elevata di valori anomali, e per la proteomica plasmatica, un paziente ME/CFS ha presentato il 35% di valori anomali (73 valori anomali su 208 proteine ​​plasmatiche) e quindi non è stato utilizzato in ulteriori analisi.

Alcuni livelli di citochine EV e di citochine plasmatiche differiscono tra i gruppi ME/CFS e quelli di controllo

Abbiamo studiato le differenze nei livelli di analiti tra pazienti ME/CFS e controlli utilizzando test di Wilcoxon non parametrici con ranghi con segno. Tra le citochine EV, i livelli di interleuchina 2 (IL2) erano significativamente diversi tra controlli e pazienti (q=0.007) e le seguenti 16 citochine EV mostravano {{32} }.1 < q < 0,2: IL12P40, TNF, IL1, CXCL8, CXCL1, IL15, CCL7, IL17, IL4, GM-CSF/CSF2, IL3, CCL5, NGF, IL1, IL7, IL1R1. La Figura 3 mostra i boxplot dei livelli proteici trasformati in log di queste 17 citochine. Per le citochine plasmatiche [41] e la proteomica plasmatica [14], nessun analita era significativamente diverso tra casi e controlli dopo correzione per confronti multipli (FDR < 0,2). I valori p dettagliati, i valori q e i rapporti del livello medio di analita proteico per il gruppo ME/CFS rispetto ai controlli possono essere trovati nel file aggiuntivo 2: Tabelle.

Inoltre, abbiamo confrontato i tipi di campioni all'interno dei soggetti con l'analisi delle componenti principali. Per questa analisi sono stati utilizzati un totale di 36 analiti comuni provenienti dai test immunologici 48-plex EV e 55-plex plasma. La percentuale di variabilità spiegata da ciascuna dimensione era del 46,2% per il primo asse e del 15% per il secondo asse e sono stati osservati due cluster significativi (Fig. 4).

Esistono numerose correlazioni all'interno e tra i set di dati sulle proteine

Le analisi di correlazione di Spearman sono state eseguite tra set di dati e sono tracciate come correlogrammi che mostrano solo correlazioni significative con il coefficiente r maggiore o uguale a 0.6 (Fig. 5). Un totale di 316 correlazioni significative positive sono state trovate nei soggetti ME/CFS e 300 nei controlli tra i livelli di citochine nei campioni EV (q<0.01) and 88 and 73 had strong Spearman correlation coefcients (r ≥0.6) in the ME/CFS and control groups, respectively (Fig. 5a). Tirty-four of them were common to both groups (pink squares, Fig.  5a). When correlating plasma cytokines to each other, the ME/CFS cohort had 710 signifcant correlations including 327 at r ≥0.6 (q<0.01), and the control group had 394 with 146 at r ≥0.6 (q<0.01); 136 were common to both groups (Fig. 5b). In both EV and plasma cytokine correlation analysis, no signifcant negative correlations were found, and there was a higher number of positive correlations in the ME/CFS cohort as compared to the healthy individuals (Fig. 5a, b).

Abbiamo anche studiato le correlazioni tra i livelli di citochine plasmatiche 55 e 48 EV (file aggiuntivo 1: Fig. S2). In entrambi i gruppi non sono state trovate correlazioni significative negative e poche positive (15 e 13 per ME/CFS e controlli rispettivamente con r maggiore o uguale a 0.5, con 4 comuni a entrambi i gruppi). Tra queste correlazioni significative, i livelli di LIF negli EV erano correlati con 8 citochine plasmatiche nella ME/CFS (CCL3, IL15, LIF, IL17, IL21, IFN, TGF e TGF) e 5 nel gruppo di controllo (CCL3, IL1, IL17, IL21 e IFN) (Figura 2 supplementare).

Per la proteomica del plasma, sono state trovate 160 e 130 correlazioni positive significative nei gruppi ME/CFS e di controllo, rispettivamente, con un coefficiente di Spearman r maggiore di 0.8 (q < 0.01) (Fig. 5c) e 42 erano comuni a entrambi i gruppi (quadrati rosa, Fig. 5c). Sei coppie di proteine ​​erano significativamente e negativamente correlate solo nel gruppo ME/CFS (quadrati arancioni, Fig. 5c), con 3 che includevano SERPINA7, e una unica per il gruppo di controllo (SERPINA1/KNG1, r=−0,82 , q < 0,01, quadrato azzurro, Fig. 5c).

Analizzando le relazioni tra il set di dati sulla proteomica plasmatica e i set di dati sulle citochine EV o sulle citochine plasmatiche, è stata trovata solo una correlazione significativa tra una proteina EV e una proteina analizzata mediante spettrometria di massa nel gruppo di controllo (CXCL12-ev/PROZ , r=0.69, q=0.014).

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