Le analisi di proteomica e citochine distinguono i casi di encefalomielite mialgica/sindrome da stanchezza cronica dai controlli Parte 2

Le correlazioni dei livelli proteici con i metadati clinici indicano la loro importanza nello stato patologico

Tutte le proteine ​​sono state analizzate per correlazioni con i metadati clinici utilizzando gli stessi metodi precedentemente descritti. Solo i risultati significativi dopo aggiustamento per confronti multipli (q<0.1) are shown in Table 2. There were significant correlations between plasma cytokines, plasma proteomics, and the clinical metadata, but none were found with the EV cytokine dataset (Table 2).

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All'interno del set di dati sulle citochine plasmatiche, sia il Fattore Stimolante delle Colonie 2 (CSF2) che la leptina erano correlati negativamente con il sesso e correlati positivamente con il BMI sia nei gruppi ME/CFS che in quelli di controllo (Fig. 6a). È interessante notare che gli individui con ME/CFS e IBS hanno concentrazioni più elevate di CSF2 e leptina rispetto alle persone con ME/CFS e senza IBS, e queste correlazioni non sono state osservate nel gruppo di controllo (Fig. 6b).

La coorte ME/CFS ha anche rivelato correlazioni significative uniche con i dati del questionario sanitario relativi alla funzione fisica (SF{{0}}) e all'affaticamento (MFI-20) che non sono state trovate nel gruppo di controllo. Il CSF2 e la leptina erano correlati negativamente con la funzione fisica (r=− {{10}}.539, q=0.002 per CSF2; r{{9 }}− 0,558, q=0.002 per leptina) e il riepilogo dei componenti fisici (r=− 0,459, q=0.035 per CSF2; r=− 0,445 , q=0.035 per la leptina) e correlato positivamente con l'affaticamento generale (r=0.439, q=0.047 per CSF2; r=0.436, q =0.047 per leptina) (Tabella 2, Fig. 6c).

Abbiamo trovato altre correlazioni significative tra le citochine e i dati clinici nei soggetti ME/CFS che non sono state trovate nei controlli: CCL2, CXCL1{{30}} e CCL11 erano positivamente correlati con l'età (r{{3} }.440, q=0.060 per CCL2; r=0.394, q=0.099 per CXCL10; r=0.431, q=0 .060 per CCL2) (Fig. 6d). Entrambi (TNF e IL1RA erano correlati positivamente con il BMI (r=0.543, q=0.001 e r=0.468, q=0.010 rispettivamente), e correlato negativamente con la categoria Funzione fisica dell'SF-36 (r=− 0,508, q=0.004 e r=− 0,480, q=0. 007 rispettivamente per TNF e IL1RA) (Fig. 6e). Infine, IL13 era correlato positivamente con il punteggio di attività ridotta del questionario MFI- 20 (r=0.482, q=0.025 ).

Come accennato in precedenza, sono state trovate ulteriori correlazioni significative tra il set di dati sulla proteomica del plasma e i metadati clinici. Ci sono state 9 correlazioni significative nel gruppo di controllo e solo due nei soggetti ME/CFS (Tabella 2, parte inferiore). Nei campioni di controllo, Protein S (PROS1) e Fc Receptor-Like 3 (FCRL3) erano correlati negativamente con la vitalità (r=− 0.590, q=0 .015 per PROS1, r=− 0.538, q=0.039 per FCRL3). Inoltre, PROS1 era correlato negativamente con il riepilogo dei componenti fisici SF-36 (r=−0,608, q=0.008) e correlato positivamente con il punteggio di fatica generale MFI-20 (r=0.590, q=0.016). La proteina di trasferimento degli esteri del colesterolo (CETP) era correlata positivamente con l'affaticamento generale (r=0.547, q=0.032) e i punteggi totali dell'MFI-20 (r{{35} }.557, q=0.025) e la subunità emoglobina alfa 1 (HBA1) erano correlati negativamente con i due stessi punteggi (r=−0.558, q=0.046 e r=− 0,556, q=0.025 rispettivamente) (Fig. 7a). Nel gruppo ME/CFS, Serpin Family A Member 5 (SERPINA5) era correlato positivamente con la salute generale (r=0.646, q=0.004) e il funzionamento sociale (r=0 .593, q=0.027) dal questionario SF-36 (Fig. 7b).

Una robusta regressione lineare rivela ulteriori relazioni tra alcune proteine ​​e informazioni cliniche

Per comprendere meglio la relazione tra proteine ​​e metadati, abbiamo eseguito una robusta regressione lineare e test t per i coefficienti stimati. È stata eseguita una regressione lineare robusta rispettivamente per le citochine EV, le citochine plasmatiche e la proteomica plasmatica. Ogni modello includeva un livello proteico specifico come variabile prevista e la coorte (ME/CFS o controllo), sesso, età, BMI e sindrome dell'intestino irritabile (IBS) come covariata. Nel modello sono state incluse anche le interazioni tra la coorte e le covariate dei metadati. Le interazioni testano l'ipotesi che la relazione tra i metadati e il livello di una proteina sia diversa nella ME/CFS rispetto al gruppo di controllo. Gli effetti significativi sono riepilogati nella Tabella 3. È pratica standard in biostatistica includere entrambi gli effetti principali ogni volta che due variabili hanno un'interazione statisticamente significativa. Il ragionamento qui è che l’interazione mostra che le variabili hanno effetti anche se l’effetto principale non raggiunge la significatività statistica. Abbiamo seguito questa pratica. Nella Tabella 3, Maschio è una variabile fittizia (indicatore o 0–1) che equivale a 1 per i maschi e 0 per le femmine. Allo stesso modo, ME/CFS è una variabile fittizia che è 1 o 0 rispettivamente per i casi o i controlli, e IBS è una variabile fittizia pari a 1 o {{10}} per i soggetti con o senza IBS, rispettivamente. ME/CFS: L'età è il prodotto di ME/CFS ed età e quindi è uguale a 1 per i casi di ME/CFS e uguale a 0 per i controlli. ME/CFS: Il maschio è il prodotto di due variabili fittizie e quindi è uguale a 1 per i maschi nel gruppo ME/CFS e uguale a 0 per tutti gli altri soggetti. ME/CFS: (+) IBS è uguale a 1 per i casi di ME/CFS con IBS e 0 negli altri casi.

Nei campioni di citochine EV, l'età era significativa per predire il livello di CXCL1 (=− 0.013, q=0.035) e il livello di CCL11 (=0.032, q{ {9}}.035). Pertanto, CXCL1 diminuisce con l'età ma CCL11 aumenta con l'età. (Tabella 3).

Nelle citochine plasmatiche, sia il BMI che i maschi hanno predetto in modo significativo i livelli di leptina e CSF2. L'effetto per la variabile fittizia Maschile è la differenza tra le medie per maschi e femmine. Ad esempio, la media della variabile Leptina (o CSF2) è, a parità di condizioni, 1,119 (o 1,230) inferiore per i maschi rispetto alle femmine. Sia per CCL2 che per CSF3, l’effetto principale dell’età e il termine di interazione tra età e coorte erano significativi. Le intercetta per la regressione di CCL2 sull'età sono 0.690 e 0.690−2.696= − 2.{{27} }06 rispettivamente per controlli e casi. Per ogni anno di aumento dell'età, la media di CCL2 diminuirà di 0.037 nei controlli e aumenterà di 0.075–0.037=0.038 nei casi. Le intercetta per la regressione del CSF3 sull'età sono 0,576 e 0,576−1.994=−1,418 rispettivamente per i controlli e i casi. Per ogni aumento di età di un anno, la media di CFS3 diminuirà di 0,047 nei controlli e aumenterà di 0,075–0,047=0,028 nei casi.

Nei dati di proteomica del plasma, anche l'età era significativa per predire il livello di SAA1 (=0.047, q=0.049). Per PFN1, l'interazione tra ME/CFS e sesso era significativa (=−1.901, q=0.03{{20} }). La media di PFN1 è 0.809 per i controlli femminili, 0.809−0.996=−0,187 per i casi femminili, 0.809+0 .081=0.890 per i controlli maschili e 0.809+0.081−0.996−1.901=−2.007 per i casi maschili. Pertanto, il PFN1 medio è più alto nei controlli rispetto ai casi per entrambi i sessi, ma la differenza è molto maggiore nei maschi (0,809+0.187=0,996 per le femmine contro 0,890+2. 007=2.897 per i maschi).

Per IGHA2, l'interazione tra ME/CFS e IBS è stata significativa (=3.467, q < 0.001). La media di IGHA2 è 0.454 per controlli senza IBS, {{20}}.454−2.048=−1.594 per casi di ME/CFS senza IBS, {{33 }}.454−2.811=− 2.357 per controlli con IBS e 0.45 4−2.048−2.811+3.{ {26}}− 0.938 per casi con IBS. Pertanto, l'IGHA2 medio è più alto per i controlli rispetto ai casi per i soggetti senza IBS ma più alto nei casi rispetto ai controlli per i soggetti con IBS. Per LRG1, l'interazione tra ME/CFS e IBS è stata significativa (=3.093, q < 0.001). La media di LRG1 è 0,261 per i controlli senza IBS, 0,261−1.082=− 0,821 per i casi di ME/CFS senza IBS, 0,261−2.502=− 2,241 per i controlli con IBS e 0,261−1,082 −2.502+3.093= 0.230 per i casi con IBS. Vediamo che la media di LRG1 è più alta nei controlli rispetto ai casi di soggetti senza IBS ma più alta nei casi rispetto ai controlli di soggetti con IBS (Tabella 4).

L'IBS ha effetti opposti nei casi e nei controlli su IGHA2 e LRG1 (Tabella 4). Sebbene queste differenze siano statisticamente significative, va notato che c’era un solo soggetto di controllo affetto da IBS.

Tre approcci di machine learning danno origine a modelli predittivi e discriminativi

I primi 20 analiti proteici e i valori di importanza delle caratteristiche per ciascuno dei tre approcci di apprendimento automatico possono essere trovati nella Tabella 5. Tutti e tre i metodi hanno avuto prestazioni eccellenti nel distinguere la ME/CFS dai controlli utilizzando i primi 2{{ 16}} analiti proteici con 250 repliche di convalida incrociata quintupla. La Figura 8 mostra le curve ROC e i valori AUROC di questi tre classificatori con le prime 20 proteine ​​classificate in base alle misurazioni di importanza. Il classificatore XGBoost ha ottenuto i migliori risultati con un elevato grado di precisione (86.1%, File aggiuntivo 1: Fig. S3a) con un valore AUROC con convalida incrociata di 0.947 (95% CI { {26}}.895–0.998). Inoltre, utilizzando le prime 8 proteine ​​di ciascun classificatore, la regressione logistica (LASSO) ha fornito i migliori risultati con un'AUC di 0,873 (IC al 95% 0,792–0,953) e un'accuratezza del 78,6% (Fig. 8b e file aggiuntivo 1: Fig. S3b). Infine, Random Forest con 7 analiti proteici comuni a tutti e tre i primi 20 elenchi (proteine ​​in grassetto nella Tabella 5) ha distinto la ME/CFS dai controlli con un valore AUROC di 0,891 (95% CI 0,817–0,966) e un'accuratezza del 79,1% (Fig 8c e Scheda aggiuntiva 1: Fig. S3c).

Discussione

In questo studio, abbiamo utilizzato campioni e dati provenienti da 98 dei 100 soggetti che in precedenza avevano fornito campioni che erano stati analizzati per la metagenomica fecale e le citochine plasmatiche [26] e anche per le proteine ​​plasmatiche analizzate mediante spettrometria di massa [14]. Inoltre, da questi 98 campioni sono state isolate vescicole extracellulari e abbiamo scoperto che la dimensione media e le concentrazioni delle particelle erano significativamente più alte nella ME/CFS (Fig. 2). Sebbene un precedente rapporto che utilizzava lo stesso metodo di purificazione degli EV del presente studio avesse rilevato che la dimensione media degli EV ME/CFS era ridotta [42], gli autori hanno analizzato gli EV isolati da 10 pazienti ME/CFS e 5 controlli sani contro 49 ME/ CFS e 49 controlli in questo studio non hanno utilizzato la trombina per rimuovere il fibrinogeno e hanno utilizzato basse forze centrifughe per sedimentare gli EV (1500 g contro 12,000 g in questo studio). Nel complesso ciò potrebbe spiegare i diversi risultati osservati con il nostro studio attuale. Infine, i nostri risultati hanno confermato altri risultati che riportavano concentrazioni più elevate di vescicole nella ME/CFS [24, 25, 42] e queste osservazioni sono state osservate anche in condizioni come il morbo di Alzheimer [17] e la malattia cerebrovascolare [20].

Il nostro lavoro dimostra il valore dell'utilizzo di test multipli sugli stessi campioni e anche l'importanza di eseguire correlazioni con i dati clinici. Ciò ci ha permesso di identificare diverse associazioni di particolari proteine ​​con i sintomi dei pazienti. È importante sottolineare che dimostriamo che i dati possono distinguere tra pazienti e controlli con elevata precisione. La ME/CFS è stata a lungo erroneamente vista da alcuni come una malattia psicologica. Riuscire a separare pazienti e controlli attraverso l'analisi del plasma è una forte dimostrazione della natura biologica della malattia. Un riepilogo dei nostri test sperimentali e dei risultati principali è mostrato in Fig. 9.

La nostra attuale analisi di 98 campioni concorda con il precedente confronto delle citochine plasmatiche in 100 ME/CFS e controlli, che non ha identificato alcuna differenza significativa tra le coorti dopo aggiustamento per test multipli [26]. Al contrario, abbiamo identificato 17 citochine EV che distinguono pazienti e controlli con valori p aggiustati inferiori a 0,2, tutti più alti nei soggetti ME/CFS. Di queste 17 proteine, la maggior parte (10 su 17) sono note per essere citochine/chemochine proinfiammatorie (TNF, IL1, CXCL8, CXCL1, IL15, CCL7, IL17, CCL5, IL1 e IL1R1), 5 sono correlate all'immunità adattativa (IL2, CSF2, IL3, IL4 e IL7), IL12p40 ha proprietà antinfiammatorie e l'NGF è sia pro che antinfiammatorio. Livelli più elevati di citochine proinfiammatorie sono in linea con i rapporti precedenti [43-45].

Sebbene le differenze nei livelli di citochine EV non abbiano raggiunto la significatività statistica dopo la correzione per confronti multipli in un precedente studio pilota con solo 38 soggetti, 13 delle 17 citochine EV nel presente studio sono state trovate anche a livelli più alti nelle EV dei soggetti ME/CFS in confronto con i controlli [25]. La differenza più significativa era IL2 (q=0.007, Fig. 3). IL2 è una citochina secreta prodotta dai linfociti T CD4+ e CD8+ attivati ​​e promuove una forte proliferazione delle cellule B attivate e successivamente la produzione di immunoglobuline. Svolge un ruolo fondamentale nella regolazione del sistema immunitario adattativo controllando la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule T regolatorie. I livelli di IL2 sono risultati più alti nel liquido cerebrospinale [46] e nel plasma dei pazienti ME/CFS [47]. I livelli più alti di IL2 riscontrati negli EV nel presente studio potrebbero essere parte di una risposta immunitaria specifica nella ME/CFS. Diverse citochine/chemochine di cui è stata osservata una disregolazione sono prodotte dalle cellule B o sono anche regolatrici delle cellule B (ad esempio CXCL1 e CXCL12).

Le correlazioni delle citochine con altre citochine forniscono informazioni sulle reti di interazioni tra le molecole di segnalazione. Diversi altri studi hanno dimostrato che le reti di citochine nel plasma o nelle vescicole extracellulari differiscono tra soggetti ME/CFS e controlli [25, 41, 44, 48]. Abbiamo scelto di visualizzare le correlazioni tra i tre tipi di dati: citochine plasmatiche ed EV e proteomica plasmatica, utilizzando correlogrammi. L'ispezione della rappresentazione visiva di queste interazioni proteina-proteina rivela immediatamente che esistono correlazioni positive tra le citochine EV e tra le citochine plasmatiche che si verificano nei casi ma non nei controlli e viceversa (Fig. 5). Un’osservazione particolarmente sorprendente è un numero maggiore di correlazioni positive tra le citochine plasmatiche nella ME/CFS rispetto ai controlli (Fig. 5b), indicando che la segnalazione delle citochine è sostanzialmente diversa, forse riflettendo un ambiente infiammatorio.

Settantuno proteine ​​caratterizzate dalla spettrometria di massa hanno mostrato correlazioni significative con altre proteine ​​plasmatiche (Fig. 5c). Ad esempio, F2 ha mostrato 31 correlazioni positive con altre proteine, di cui undici sono state osservate nei casi ma non nei controlli. F2 è il fattore II della coagulazione o trombina e converte il fibrinogeno in fibrina e attiva i fattori V, VII, VIII e XIII. La trombina promuove l’attivazione e l’aggregazione piastrinica, ma si ritiene che abbia anche altre funzioni durante l’infiammazione e la guarigione delle ferite [49].

Nonostante non si siano osservate differenze significative nei livelli di citochine plasmatiche tra le due coorti, abbiamo osservato correlazioni delle citochine plasmatiche con i dati clinici. Il CSF2, noto anche come fattore di stimolazione delle colonie di granulociti e monociti (GM-CSF), è più basso nei maschi sia nella ME/CFS che nei controlli e aumenta con il BMI in entrambe le coorti secondo la robusta regressione lineare e le analisi di correlazione (Fig. 6a, Tabelle 2 e 3). Nella coorte ME/CFS, con l’aumento del CSF2, i punteggi sulla funzione fisica SF36 e sulle scale MFI-fatica indicano un impatto maggiore dei sintomi fisici e della fatica, rispettivamente. Un aumento del GM-CSF è associato all’infiammazione cronica [50]. Il GM-CSF induce i monociti classici a differenziarsi in cellule dendritiche e macrofagi derivati ​​​​da monociti in vitro [51]. I monociti classici mostrano un modello di espressione genica unico nella ME/CFS rispetto ai controlli [52], e livelli elevati di GM-CSF potrebbero essere un fattore di segnalazione coinvolto in questa risposta.

Secondo le correlazioni di Spearman, gli aumenti dei livelli di tre citochine, CCL2, CXCL10 e CCL11 sono stati associati all’aumento dell’età solo nella coorte ME/CFS. CCL2, noto anche come MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1), attrae i monociti attraverso l'endotelio nei tessuti [53] e potrebbe anche essere un fattore nel profilo alterato dell'espressione genica dei monociti [54]. È stato anche osservato che CCL2 diminuisce con l'età nella coorte totale sia mediante una robusta regressione lineare che mediante la correlazione di Spearman, ma aumenta nella coorte ME/CFS con l'aumentare dell'età, secondo la correlazione di Spearman (Fig. 6d, Tabella 3). Utilizzando una regressione lineare robusta, il CCL11 plasmatico non aumentava in modo significativo con l'età, ma si prevedeva che il CCL11 EV fosse più elevato con l'aumentare dell'età. CXCL10 (IP10) è anche coinvolto nella migrazione cellulare, in particolare nell’attrazione di macrofagi, monociti e cellule T e NK attivate [55]. È noto che CCL11, noto anche come eotaxina, aumenta con l’età e livelli più elevati sono associati a una diminuzione della neurogenesi [56]. Due ampi studi avevano precedentemente osservato un’associazione di leptina, GM-CSF, IP10 ed eotassina con la gravità della ME/CFS [43] o con livelli più elevati di eotassina nei casi di ME/CFS a lungo termine [41]. Quasi tutti i soggetti ME/CFS in questo studio sono malati da più di 3 anni.

Una leptina più elevata è correlata al sesso femminile e a un BMI più elevato sia nei pazienti che nei controlli mediante robuste analisi di regressione lineare e correlazione (Tabelle 2 e 3). Un livello più elevato di leptina è anche associato all'IBS nella coorte di pazienti (Fig. 6b). L'aumento della leptina è anche correlato a punteggi peggiori sulle misure della funzione fisica SF36 e sulla scala della fatica MFI (Fig. 6c). La leptina era precedentemente correlata con l'affaticamento e la gravità nella ME/CFS [43, 54]. Livelli crescenti di un’altra citochina infiammatoria, il TNF, sono correlati anche con punteggi inferiori della funzione fisica del paziente sull’SF36 e in precedenza è stato segnalato che sono elevati nella ME/CFS [41, 57, 58] (Fig. 6e).

Livelli più elevati di IL1-RA, che antagonizza le citochine infiammatorie di IL1, sono stati associati a un BMI più elevato e a una funzione fisica SF-36 inferiore nei casi di ME/CFS (Fig. 6e). Sebbene IL1-RA possa essere considerato antinfiammatorio, è noto che i livelli di IL1-RA sono più alti nell'obesità [59] e livelli più alti sono considerati un marcatore di disregolazione metabolica [60] , che potrebbe comportare una minore capacità fisica.

Abbiamo osservato che livelli più bassi della citochina antinfiammatoria IL13 erano associati ad una minore attività nei casi di ME/CFS. Precedentemente è stato segnalato che l'IL-13 è più basso nelle donne con ME/CFS rispetto ai controlli [61]. Al contrario, in uno studio [43], un IL13 più elevato era correlato con un aumento della gravità dei sintomi, mentre in un altro non è stata osservata alcuna differenza tra casi e controlli [41].

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