La proteomica quantitativa rivela differenze significative tra le formazioni cerebrali di topo

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Astratto:L'invecchiamento è associato ad un generale declino delle funzioni cognitive, che sembra essere dovuto ad alterazioni delle quantità di proteine ​​coinvolte nella regolazione della plasticità sinaptica. Qui, presentiamo un'analisi quantitativa delle proteine ​​coinvolte nella neurotrasmissione in tre regioni del cervello, vale a dire, l'ippocampo, la corteccia cerebrale e il cervelletto, in topi di età compresa tra 1 e 22 mesi, utilizzando la tecnica dell'approccio proteico totale. Descriviamo che sebbene il titolo di alcune proteine ​​coinvolte nella neurotrasmissione e nella plasticità sinaptica sia influenzato dall'invecchiamento in modo simile in tutte le formazioni cerebrali studiate, in realtà ciascuna delle formazioni rappresenta una propria modalità di invecchiamento. Generalmente i proteomi ippocampali e corticali sono molto più instabili durante la vita rispetto al proteoma cerebellare. I dati qui presentati forniscono un quadro generale dell'effetto dell'invecchiamento fisiologico sulla plasticità sinaptica e potrebbero suggerire potenziali bersagli farmacologici per terapie anti-invecchiamento.

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Parole chiave:trasmissione glutamatergica e GABAergica; Camk2; OXPHOS; matrice extracellulare; approccio proteico totale;ippocampo;corteccia;cervelletto

1. Introduzione

L'invecchiamento fisiologico è correlato a un graduale declino delle funzioni cognitive, come la formazione e la ritenzione della memoria, la velocità di elaborazione e il ragionamento concettuale [1]. È ampiamente accettato che i cambiamenti associati all'invecchiamento siano causati principalmente dalla perdita di cellule neuronali; tuttavia, numerosi studi hanno suggerito che la struttura della rete neuronale, piuttosto che il numero di neuroni, è influenzata durante l'invecchiamento [2-4]. È stato dimostrato che l'invecchiamento è associato all'accorciamento dei dendriti e alla diminuzione del loro numero, alla perdita delle spine dendritiche, alla diminuzione del numero di assoni all'interno di una rete e al livello della loro mielinizzazione e alla perdita di sinapsi [5]. Inoltre, è stato dimostrato che i meccanismi molecolari alla base dei fenomeni di plasticità cerebrale come il potenziamento a lungo termine e la depressione delle sinapsi glutamatergiche (LTP e LTD) e GABAergiche (iLTP e iLTD) e l'efficacia di vari sistemi neuromodulatori diminuiscono con l'avanzare dell'età. 6,7]. Diversi studi hanno dimostrato che i cambiamenti cognitivi legati all'invecchiamento sono accompagnati da cambiamenti nell'espressione e/o nella localizzazione delle proteine ​​coinvolte nella trasmissione sinaptica e nella plasticità [6,8]. L'espressione delle proteine ​​in varie regioni del cervello dei roditori è stata studiata intensamente mediante tecniche proteomiche basate sulla spettrometria di massa[9,10] e microarrays[11,12].colesterolo delle cistanzeTuttavia, ad eccezione dello studio di Walter e Mann [10] e dello studio di Duda et al. [8], tutte le indagini hanno utilizzato approcci semiquantitativi che non forniscono informazioni sull'accurata concentrazione di proteine ​​nei campioni studiati.

Recentemente, abbiamo misurato le concentrazioni di proteine ​​coinvolte nella plasticità neuronale nell'ippocampo, nella corteccia cerebrale e nel cervelletto in topi giovani ({0}}di un mese) e adulti (12-di un mese--) [8 ]. Abbiamo scoperto che, mentre la quantità totale di proteine ​​​​non è cambiata durante la vita, i titoli proteici correlati alla neurotrasmissione e alla neuroplasticità differivano significativamente tra animali giovani e adulti, il che indica che i sintomi della trasmissione del segnale e dell'indebolimento della neuroplasticità possono essere osservati a metà topi invecchiati a livello proteomico [8].

cistanche può antinvecchiamento

In questo documento, forniamo i risultati di un'analisi quantitativa approfondita dei proteomi ippocampali, corticali e cerebellari correlati alla plasticità neuronale di giovani ({2}}mesi) e anziani ({4}}mesi ) topi, concentrandosi principalmente sui cambiamenti legati all'invecchiamento nella concentrazione di proteine ​​coinvolte nella segnalazione di glutammato, GABA, acetilcolina e monoammina. Discutiamo anche dei cambiamenti nella concentrazione di proteine ​​coinvolte nel rilascio di neurotrasmettitori e nella formazione di connessioni sinaptiche, come le proteine ​​dell'adesione cellulare trans-sinaptica e le reti perineuronali.

Utilizzando il metodo dell'approccio delle proteine ​​totali senza etichetta (TPA), abbiamo misurato i titoli di oltre 7000 proteine ​​in ciascuna delle regioni cerebrali studiate [13]. In questo documento, presentiamo, finora, la descrizione proteomica quantitativa più approfondita dei cambiamenti relativi alla plasticità sinaptica durante l'invecchiamento fisiologico dei topi. Per quanto ne sappiamo, questa è, finora, la descrizione proteomica quantitativa più approfondita dei cambiamenti legati alla plasticità sinaptica durante l'invecchiamento fisiologico dei topi.

2. Materiali e metodi

2.1. Animali e preparazione dei tessuti

I cervelli sono stati isolati da cinque topi femmine C57BL/10J a P30 (giovani) e cinque topi di 22-mesi (di età). Gli animali sono stati trattati come descritto in [8]. In breve, gli animali sono stati anestetizzati con isoflurano e decapitati e i cervelli sono stati espiantati in un tampone ghiacciato (87mMNaCl,2.5mMKCl,1.25mMNaHNPO4,25mMNaHCO3,0.5mMCaClz,7mMMgSO, 25mM di glucosio,75mM di saccarosio, pH7.4) . Per la proteomica quantitativa sono state utilizzate le regioni cerebrali intere: l'ippocampo destro, la corteccia frontale dell'emisfero destro e l'emisfero destro del cervelletto, di ciascun animale.cistanche deserticola effetti collateraliTutte le procedure sono state approvate dal comitato etico locale (Comitato etico di Wroclaw, autorizzazione n.10/2018) ed è stato compiuto ogni sforzo per ridurre al minimo il numero di animali utilizzati per gli esperimenti.

2.2.Preparazione dei lisati tissutali

I lisati sono stati ottenuti come descritto in [13]. Le strutture isolate sono state omogeneizzate in tampone di lisi (0.1 M Tris/HCl, 2% SDS, 50 mM DTT, pH8.0) e incubate per 5 minuti a 99 gradi. I campioni sono stati conservati a{10}} laurea fino all'analisi proteomica. La fluorescenza del triptofano è stata impiegata per determinare la concentrazione proteica totale nei campioni [14].

2.3.Preparazione del campione con filtro a digestione multienzimatica (MED FASP)

I lisati contenenti 80 ug di proteine ​​totali sono stati utilizzati per il MED FASP[15] senza alchilazione della cisteina [16]. Le proteine ​​sono state scisse durante la notte con LysC e quindi digerite con tripsina per 3 ore. Il rapporto enzima-proteina era 1:40. Le digestioni sono state effettuate a 37 gradi in Tris-HCl 50 mM con l'aggiunta di 1 mM DTI, pH 8,5. [13] Aliquote contenenti 8 ug di peptide totale sono state concentrate e conservate a -20 gradi fino all'analisi con spettrometria di massa.

2.4. Cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem

L'analisi delle miscele di peptidi è stata eseguita come descritto in precedenza[13] utilizzando lo spettrometro di massa QExactive HF (ThermoFisher Scientific, Palo Alto, CA, USA). I dati sono stati depositati nel Consorzio ProteomeXchange tramite il repository dei partner PRIDE [17]. L'identificatore del set di dati: PXD025978(nome utente: revisore_pxd025978@ebi.ac.uk;password: QL3YI7nP).

2.5.Analisi dei dati proteomici

MaxQuant v1.2.6.20[18] è stato utilizzato per l'analisi dei dati MS. Il database UniProtKB/Swiss-Prot è stato impiegato per identificare le proteine ​​utilizzando i dati dei peptidi MS e MS/MS.

La carbamidometilazione della cisteina è stata impostata come modifica fissa.cistance dosaggio redditLa deviazione di massa iniziale consentita dello ione precursore era fino a 6 ppm e per le masse del frammento era fino a 20 ppm. Il tasso massimo di scoperta di falsi peptidi è stato specificato come 0,01. Il metodo dell'approccio proteico totale [19,20] è stato utilizzato per calcolare la concentrazione molare proteica utilizzando la relazione in cui la quantità di singole proteine ​​(c(i) è stata calcolata come il rapporto tra la loro intensità (MSsegnale(i)) e la somma di allintensities(totalMSsignal) nel campione misurato,moltiplicato per il peso molecolare (MW(i)) delle singole proteine.

2.6.Analisi statistica

I dati sono presentati come media ± SD. L'uguaglianza delle varianze è stata calcolata utilizzando il test F di Fisher. Per determinare le differenze tra due gruppi sperimentali qualsiasi, è stato utilizzato il test t di Student. L'analisi è stata eseguita utilizzando il software SigmaPlot 11 (software Systat).

3. Risultati

I dati proteomici completi sono stati depositati nel ProteomeXchange Consortium e sono disponibili con l'identificatore del set di dati: PXD0255978(username: reviewer_pxd025978@ebi.ac.uk;password: QL3YI7nP).L'analisi degli spettri ha consentito di la quantificazione di 7547 proteine ​​attraverso i campioni analizzati.Benefici dell'estratto di cistancheNell'analisi sono state utilizzate proteine ​​identificate con almeno un peptide unico. In dettaglio, i dati di espressione per 7324, 7088 e 7343 proteine ​​rispettivamente nell'ippocampo, nella corteccia e nel cervelletto di vecchi animali sono stati determinati quantitativamente e depositati al ProteomeXchange Consortium tramite il repository partner PRIDE. Per gli animali giovani, vi sono stati depositati i dati per 7347, 7323 e 7526 proteine ​​rispettivamente nell'ippocampo, nella corteccia e nel cervelletto.

4. Trasmissione glutammatergica

Il glutammato, il principale neurotrasmettitore eccitatorio nel cervello, agisce attraverso i recettori ionotropici e metabotropici (mGluRs, Grm). I recettori ionotropici rientrano in una delle quattro classi seguenti: o-ammino-3-idrossi{2}}metil-4-recettori dell'acido isossazolo propionico (recettori AMPA, Gria), recettori N-metil-D-aspartato( Recettori NMDA, Grin), recettori kainati (Grik) e recettori delta (Grid). 4.1.Gria

Il nostro studio rivela che i recettori del glutammato più abbondanti nell'ippocampo sono Gria. Sono proteine ​​eterotetrameriche [21] e abbiamo scoperto che la subunità Gria2 era espressa al titolo più alto sia negli ippocampi murini giovani che in quelli anziani (Figura 1A). L'invecchiamento non ha avuto alcun effetto sull'espressione dei recettori Gria nell'ippocampo, ad eccezione di Gria4, il cui livello era significativamente ridotto negli animali anziani. Tuttavia, il titolo di Gria4 era in generale molto basso rispetto ad altri membri della famiglia Garcia.

Nella corteccia cerebrale, Gria erano i recettori ionotropici del glutammato più onnipresenti solo nei vecchi animali (Figura 1B, D). Statisticamente, i cambiamenti nei titoli delle singole subunità Gria durante l'invecchiamento nella corteccia non erano significativi, ma la concentrazione totale della proteina Gria era significativamente aumentata nei vecchi animali (Figura 1B).cistanche gengis khanSimile all'ippocampo, Gria2 era l'isoforma principale nella corteccia.

Nel cervelletto, i recettori del glutammato più abbondanti erano Grial e Gria2, che erano espressi a livelli molto simili e l'invecchiamento non ha influenzato la loro concentrazione (Figura 1C). 4.2.Sorridi

I recettori NMDA sono canali eterotetramerici dipendenti dal glutammato per gli ioni calcio e sodio che sono cruciali per la plasticità sinaptica [2] e sono composti da isoforme di Grin [23]. Abbiamo scoperto che la forma principale di Grin espressa in tutte le strutture cerebrali studiate era Grin1 (Figura 1A-C). La concentrazione di questa isoforma non è stata influenzata dall'invecchiamento nell'ippocampo e nel cervelletto; tuttavia, è stato significativamente ridotto nella corteccia (Figura 1B). Complessivamente, la concentrazione totale di tutte le subunità NMDA, ad eccezione di Grin3a (il cui livello non era influenzato dall'invecchiamento ed espresso a un livello molto basso rispetto ad altre proteine ​​Grin), era diminuita nella corteccia invecchiata, mentre era invariata nel cervelletto ( Figura 1B, C). Nell'ippocampo, l'invecchiamento si rifletteva in una diminuzione statisticamente significativa della quantità totale di proteine ​​Grin e anche delle isoforme Grin2b e Grin3a.

4.3.Griglia

Gridl e Grid2 sono recettori ionotropici espressi quasi esclusivamente nel cervelletto e sono coinvolti nella regolazione della plasticità sinaptica [24]. Abbiamo scoperto che nel cervelletto, l'isoforma principale è Grid2 e che il suo titolo non è influenzato dall'invecchiamento (Figura 1C). Nell'ippocampo e nella corteccia, la concentrazione di, rispettivamente, Gridl e Grid2 è significativamente più bassa negli animali anziani; tuttavia, il titolo di questi recettori è in generale molto basso (Figura 1A,B).

4.4.Grik

I recettori kainati sono canali eteromerici del sodio che mediano la trasmissione ionotropica e metabotropica [25,26]. La nostra analisi ha rivelato che la concentrazione di quasi tutti i membri della famiglia delle proteine ​​Grik era diminuita nei vecchi ippocampi e cortecce (Figura 1A, B). Al contrario, il titolo delle proteine ​​Grik, ad eccezione dell'isoforma Grik2, non è stato influenzato dall'invecchiamento nel cervelletto (Figura 1C).

4.5.gr

Abbiamo identificato sette membri dei recettori metabotropici glutammato-dipendenti, Grm, in tutte le formazioni cerebrali studiate: Grml-7 (Figura 1A-C). La concentrazione totale delle proteine ​​Grm nell'ippocampo e nella corteccia è stata ridotta negli animali anziani ( Figura 1A, B), mentre il titolo totale di Grms cerebellare non è stato modificato in modo significativo dall'invecchiamento (Figura 1C).

Un'analisi dettagliata ha rivelato che i livelli delle isoforme più abbondanti di Grm (Grm2, Grm3 e Grm5) nell'ippocampo erano significativamente diminuiti nei topi vecchi (Figura 1A), mentre nella corteccia i cambiamenti nei titoli delle isoforme più abbondanti non sono stati significativamente alterati (Figura 1B).

5. Trasmissione GABAergica

L'acido y-aminobutirrico è il neurotrasmettitore inibitorio più abbondante nel cervello e può interagire con due tipi di recettori: il recettore ionotropico GABAA, che è un canale del cloro, e il recettore metabotropico GABAg. I recettori GABA sono proteine ​​pentameriche composte da varie subunità∶ a（Gabra）, （Gabrb）,y（Gabrg）e δ（Gabrd）【27】GABAg è un recettore eterodimerico accoppiato a proteine ​​G formato dalle subunità Gabbrl e Gabbr2[28] . 6.GABAA-Gabr

La nostra analisi ha dimostrato che la concentrazione totale della proteina GABA era significativamente ridotta nell'ippocampo e nella corteccia di vecchi topi, ma non era influenzata dall'invecchiamento nel cervelletto (Figura 2A). Questi cambiamenti sono stati riflessi dalle alterazioni nell'espressione delle singole subunità del recettore GABAA (Figura 2B-D). 6.1.Gabra(subunità a)

Abbiamo scoperto che la concentrazione complessiva delle subunità Gabra non è stata influenzata dall'invecchiamento in tutte le formazioni cerebrali studiate (Figura 2B-D). L'isoforma più abbondante era Gabral. All'interno delle subunità a, solo l'espressione di Gabra3 e Gabra5 è stata influenzata dall'invecchiamento (Figura 2B-D). L'unico cambiamento statisticamente significativo è stato associato a Gabra4, il cui titolo è stato ridotto nella corteccia degli animali anziani (Figura 2C). 6.2.Gabrb(subunità)

La nostra analisi ha mostrato che la subunità era la subunità GABAA più onnipresente in tutte le strutture cerebrali studiate, sia negli animali giovani che in quelli vecchi (Figura 2B-D), e l'isoforma principale della subunità era Gabrb2 (Figura 2B-D). La concentrazione di Gabr2b era il più alto nel cervelletto, mentre nell'ippocampo e nella corteccia i suoi titoli erano simili (Figura 2B-D). Non abbiamo osservato alcun cambiamento significativo associato all'invecchiamento nell'espressione delle isoforme della subunità nell'ippocampo e nel cervelletto. Tuttavia, nella corteccia, il titolo totale di Gabrb è stato significativamente ridotto e ciò era correlato a una diminuzione del titolo di Gabrb2 (Figura 2C).

6.3.Gabrg（subunità）

Tra le subunità y del recettore GABAA, Gabrg2 era espresso al livello più alto nella corteccia e nel cervelletto (Figura 2C, D) ed era l'unica subunità y che potevamo rilevare nell'ippocampo (Figura 2B). Nell'ippocampo e corteccia, la concentrazione totale dell'isoforma Gabrg era quasi due volte superiore negli animali giovani rispetto a quelli anziani (Figura 2A,B). D'altra parte, la concentrazione totale della subunità y non è stata influenzata dall'invecchiamento nel cervelletto (Figura 2D). 6.4.Gabrd（subunitàδ）

Nei topi vecchi, la subunità $ era espressa principalmente nel cervelletto (Figura 2B-D). Il titolo di Gabrd nel cervelletto dei topi anziani era circa dieci volte superiore a quello della corteccia e più di 25 volte superiore a quello dell'ippocampo (Figura 2B-D). L'invecchiamento non ha avuto alcun effetto sull'espressione di Gabrd nell'ippocampo e nel cervelletto, ma nella corteccia il titolo del recettore è stato ridotto più di tre volte dall'invecchiamento (Figura 2C). 7.GABAb-Gabbr

Gabbr è un recettore metabotropico eterodimerico formato dalle subunità Gabbrl e Gabbr1, e la sua funzione è accoppiata all'attivazione di una proteina G e alla modulazione delle attività degli effettori a valle come l'adenilato ciclasi [29]. Abbiamo scoperto che l'espressione di entrambe le subunità del recettore metabotropico era diminuita nell'ippocampo degli animali anziani (Figura 2B). Nel cervelletto, la quantità di Gabbr non è stata influenzata dall'invecchiamento. Abbiamo anche potuto osservare una riduzione significativa della somma delle concentrazioni delle subunità di Gabbr nella corteccia, sebbene separatamente i cambiamenti nei titoli delle subunità non fossero statisticamente significativi (Figura 2C). 8.Gad

Gad è un enzima decarbossilante glutammato per la produzione di GABA [30]. I nostri dati mostrano che l'espressione della principale isoforma di Gad nell'ippocampo, Gad2, non è stata influenzata dall'invecchiamento; tuttavia, il livello di un'altra isoforma di Gad, Gad1, era significativamente elevato (Figura 2B). Abbiamo anche potuto osservare aumenti significativi dei titoli di entrambe le isoforme di Gad nel cervelletto di animali anziani (Figura 2D), ma non ci sono stati cambiamenti nell'espressione di Gad nella corteccia di vecchi topi (Figura 2C).

9. Chinasi dipendenti da calcio/calmodulina

L'attivazione della proteina chinasi calcio/calmodulina-dipendente (Camk) è il primo stadio della trasformazione della segnalazione del calcio in varie forme di plasticità sinaptica (per una rassegna, vedere [31,32]). 9.1.Camk1

L'unica isoforma di Camkl che abbiamo trovato nella nostra analisi era Camkld. Abbiamo anche osservato alcuni peptidi associati a Camkl, ma non siamo stati in grado di annotarli con precisione su isoforme di Camkl selezionate (sono descritti come "Camkl", Figura 3A-C). Nella nostra analisi, non abbiamo osservato alcun significativo invecchiamento associato cambiamenti nella concentrazione di quel gruppo di Camk nell'ippocampo e nella corteccia (Figura 3A, B). D'altra parte, il titolo di Camkl è stato significativamente aumentato nel cervelletto di vecchi topi (Figura 3C).

9.2.Camk2

Camk2 appartiene alle proteine ​​più onnipresenti in tutte le strutture cerebrali [8,3]. Abbiamo scoperto che tra le isoforme di Camk2, il titolo di Camk2a è il più alto in tutte le strutture cerebrali studiate (Figura 3A-D) e che la sua concentrazione nell'ippocampo e nella corteccia è molte volte superiore al titolo di Camk2b, il secondo più abbondante isoforma di Camk2 (Figura 3A,B). L'invecchiamento non ha avuto alcun effetto sulle concentrazioni delle isoforme Camk2, ad eccezione di Camk2d, il cui livello è stato ridotto nell'ippocampo di vecchi topi (Figura 3A).

9.3.Camk4

Il ruolo molecolare di Camk4 nella plasticità sinaptica è diverso da Camk2. Active Camk4 si localizza nel nucleo cellulare e regola la trascrizione dei geni coinvolti nella fase tardiva della formazione della memoria [32].

Il nostro studio rivela che la concentrazione di Camk4 era significativamente, quasi due volte, ridotta in tutte le formazioni cerebrali analizzate di vecchi animali (Figura 3A-D). Il titolo proteico era il più basso nell'ippocampo e il più alto nel cervelletto (Figura 3A-D).

9.4.Camkk

Le protein chinasi calcio/calmodulina-dipendenti (Camkk) fosforilano e regolano l'attività delle proteine ​​Camk. La nostra analisi ha rivelato che la concentrazione totale di Camkk non era statisticamente significativamente influenzata dall'invecchiamento nell'ippocampo e nella corteccia (Figura 3A, B, D). Nel cervelletto, il livello dell'isoforma Camkkl era più di 3- volte maggiore negli animali anziani, mentre la concentrazione di Camkk2 era più di due volte inferiore negli animali anziani (Figura 3C).

10.Proteina chinasi dipendente da Prka-cAMP (PKA)

La Prka è una proteina chinasi della serina conservata con un'ampia distribuzione e una specificità relativamente bassa, che può fosforilare varie subunità dei recettori AMPA e NMDA e modulare la loro funzione [34]. 10.1.Subunità catalitiche PKA-Prkac

La nostra analisi ha dimostrato che nell'ippocampo, le subunità catalitiche più abbondanti di PKA sono Prakaca e Prkacb (Figura 4). Le concentrazioni delle singole subunità non sono state influenzate dall'invecchiamento; tuttavia, la concentrazione proteica totalPrkac era leggermente ma statisticamente significativamente ridotta nei topi anziani (Figura 4A,D). Simile all'ippocampo, nella corteccia e nel cervelletto, le subunità catalitiche più onnipresenti della PKA erano Prakaca e Prkacb; tuttavia, le concentrazioni delle proteine ​​non differivano tra animali giovani e vecchi (Figura 4B, C). 10.2.Subunità regolatorie PKA——Prkar

Abbiamo scoperto che l'espressione complessiva delle isoforme di Pekar era la più alta nella corteccia, mentre nell'ippocampo e nel cervelletto il livello di Prkar era simile (Figura 4A-D). L'invecchiamento non ha avuto alcun effetto sulla concentrazione totale di Prkar e l'unica differenza legata all'età era un livello ridotto di Prkar2b nell'ippocampo di vecchi topi (Figura 4A).

11. Chinasi proteiche attivate da mitogeni: mappa

Le proteine ​​Mark regolano un ampio spettro di processi citoplasmatici e nucleari coinvolti nella plasticità neuronale [35].

I risultati qui presentati dimostrano che l'acero era il Mapk più abbondante nell'ippocampo (Figura 4A). La concentrazione totale di Mapk nell'ippocampo non è stata influenzata dall'invecchiamento (Figura 4A, D); tuttavia, l'espressione di Mapk3 era circa il 23% più alta negli anziani animali (Figura 4A) e Mapk15 è stato aumentato quasi sette volte negli ippocampi anziani (Figura 4A).

Sia nella corteccia che nel cervelletto, la concentrazione totale di Mapk non è stata influenzata dall'invecchiamento e Mapk1 era la principale chinasi espressa nelle due strutture cerebrali (Figura 4B, C).

Questo articolo è stato estratto da Cells 2021, 10, 2021. https://doi.org/10.3390/cells10082021 https://www.mdpi.com/journal/cells