La quercetina migliora lo stato redox miocardico nei ratti con diabete di tipo 2

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Obbiettivo. I dati emergenti lo indicanolo stress ossidativoè strettamente associato alla patogenesi delle malattie cardiovascolari nel diabete mellito di tipo 2 (DM2). Il presente studio mirava a valutare l'effetto del flavonoide più abbondante nella dieta umanaquercetina(Q) sullo stato redox miocardico nei ratti con T2DM.

Metodi. Il T2DM è stato indotto nei ratti Wistar maschi da una dieta ad alto contenuto calorico (per 14 settimane) e due iniezioni di streptozotocina (25 mg/kg di peso corporeo) applicate in quattro settimane di dieta, una volta alla settimana per due settimane. Il Q è stato somministrato per via intragastrica mediante sonda gastrica in una dose di 10 o 50 mg/kg di peso corporeo per 8 settimane a partire dall'8° giorno dopo l'ultima iniezione di streptozotocina. I ratti di controllo hanno ricevuto tampone citrato e sette giorni dopo l'ultima iniezione di STZ, i livelli di glucosio basale sono stati misurati in tutti gli animali.

Risultati. La somministrazione di Q ha aumentato la sensibilità all'insulina nei ratti diabetici con un effetto più pronunciato a una dose di 50 mg/kg di peso corporeo Il Q ha anche ridotto l'ossidazione dei radicali liberi nei mitocondri cardiaci degli animali diabetici, limitando così la formazione di prodotti proteici di ossidazione avanzata in una dose- modo dipendente e normalizzato l'attività degli enzimi antiossidanti (superossido dismutasi, glutatione perossidasi, glutatione reduttasi) nei mitocondri cardiaci indipendentemente dalla dose utilizzata. Inoltre, il Q in entrambe le dosi ha impedito lo sviluppo di stress ossidativo nei ratti T2DMcardiomiocitiriducendo le attività della NADPH ossidasi e della xantina ossidasi.

Conclusioni. I risultati dimostrano che Q in entrambe le dosi 10 mg/kg e 50 mg/kg può proteggere dallo sviluppo dello stress ossidativo nei cardiomiociti nei ratti diabetici. I dati attuali indicano che l'uso di Q può contribuire al miglioramento del rischio cardiovascolare nei pazienti con T2DM.

Parole chiave: quercetina, diabete mellito di tipo 2, cardiomiociti, stress ossidativo

Diabetemellitus (DM) è una delle emergenze sanitarie globali in più rapida crescita del 21* secolo. Secondo l'International Diabetes Federation, nel 2019 463 milioni di persone in tutto il mondo avevano il diabete e si presume che questo numero raggiungerà i 700 milioni entro il 2045. Il DM è associato a un'ampia gamma di condizioni cardiovascolari che collettivamente aumentano il rischio di morte cardiovascolare di 132 percentuale nei diabetici rispetto agli individui senza DM (IDF Diabetes Atlas 2019).

È noto che il DM provoca cambiamenti specifici nella struttura del miocardio e la funzione indipendente dalla malattia coronarica o l'ipertensione è comunemente definita come cardiomiopatia diabetica (DCM). Il DCM si manifesta con disfunzione diastolica seguita da anomalie nella funzione sistolica, che possono portare a insufficienza cardiaca (Liu et al.2014). È anche noto che i disturbi metabolici nei cardiomiociti a DCM (ipertrofia, infiammazione, apoptosi, fibrosi) sono strettamente associati allo sviluppo dello stress ossidativo (Kayama et al.2015).

Le specie reattive dell'ossigeno (ROS), inclusi l'anione superossido, il radicale idrossile e il perossido di idrogeno, sono molecole di segnalazione critiche con ruoli importanti sia nella fisiologia cardiaca che nella malattia. Sia le fonti citosoliche, comprese le NADPH ossidasi (NOX), la xantina ossidasi (XO), le ciclossigenasi e gli enzimi del citocromo P450, sia le fonti mitocondriali, come la catena respiratoria e le monoamino ossidasi, contribuiscono al pool di ROS intracellulare. In condizioni fisiologiche, la segnalazione del ROS cardiaco regola lo sviluppo del cuore e la maturazione dei cardiomiociti, la manipolazione del calcio cardiaco, l'accoppiamento eccitazione-contrazione e il tono vascolare. Tuttavia, condizioni patologiche di produzione non regolata di ROS portano a livelli elevati di ROS, che possono provocarelo stress ossidativoattraverso il danno ossidativo del DNA, delle proteine ​​e dei lipidi, nonché la disfunzione mitocondriale e la morte cellulare (Peoples et al. 2019). In effetti, la produzione disregolata di ROS e lo stress ossidativo sono stati implicati in molte malattie cardiache, inclusa la cardiomiopatia diabetica (Ritchie e Abel 2020).

L'eccessiva produzione di ROS da parte dei mitocondri può influenzare direttamente la funzione contrattile del miocardio mediante modifica ossidativa di enzimi e canali ionici che partecipano alla regolazione del ciclo di eccitazione-rilassamento (Brown e Griendling 2015; Bai et al. 2016). Inoltre, I ROS stimolano la proliferazione dei cardiomiociti e attivano i fibroblasti e le metalloproteinasi della matrice, che portano all'ipertrofia e al rimodellamento del miocardio con conseguente formazione di insufficienza cardiaca (DOria et al.2020). Pertanto, si suggerisce che l'azione farmacologica volta a ridurre la sovrapproduzione di ROS possa essere efficace per la prevenzione e la correzione delle complicanze cardiovascolari del diabete.

Allo stato attuale, è stato stabilito che l'assunzione con la dieta di polifenoli naturali, in particolare flavonoidi, può ridurre il rischio di diabete e malattie cardiovascolari e i meccanismi protettivi possono non solo dipendere dagli effetti antiossidanti e antinfiammatori dei flavonoidi, ma includere anche i loro proprietà che influenzano la glicemia, l'utilizzo del glucosio e la secrezione di insulina (Ghorbaniet al.2019; Lutz et al.2019).

Quercetina(Q;3,5,7,34-pentaidrossiflavone)è il flavonoide più abbondante nella dieta umana. Esiste un'ampia gamma di funzioni biologiche di Q, inclusi gli effetti sui percorsi coinvolti nell'infiammazione, nel diabete e nelle malattie cardiovascolari (Zahedi et al. 2013). Diversi studi hanno dimostrato i meccanismi degli effetti antidiabetici del Q, tra cui

diminuzione della perossidazione lipidica, aumento dell'attività degli enzimi antiossidanti (es. superossido dismutasi, SOD; glutatione perossidasi, GPX; catalasi, CAT), ridotto assorbimento di glucosio nell'intestino a causa dell'inattivazione del trasportatore GLUT2 e altri (Shi et al.2019; Salehi et al.2020). L'effetto cardioprotettivo di Q su differenziatocardiomiociti, a causa dell'inattivazione delle vie di segnalazione della protein chinasi e della proteina chinasi B attivate dal mitogeno (Daubney et al.2015).

La ricerca futura dedicata alla comprensione dei meccanismi di azione cardioprotettiva nel diabete potrebbe contribuire al miglioramento della cura del diabete.

Lo scopo del presente lavoro era di studiare l'effetto della quercetina sullo stato redox dei cardiomiociti nei ratti con diabete mellito di tipo 2 (DM2).

Materiali e metodi

Sostanze chimiche. Tutte le sostanze chimiche utilizzate erano di qualità per reagenti analitici e acquistate da Sigma Chemical Co.(St.Louis, MO, USA). La quercetina è stata fornita dall'impianto chimico-farmaceutico PJSCSICBorshchahivskiy (Kiev, Ucraina) e conteneva un minimo del 96,5% della sostanza attiva.

Design sperimentale. Il presente studio è stato approvato dal comitato di bioetica del "V. Dani-levsky Institute for Endocrine Pathology Problems of National Academy of Medical Sciences of Ukraine" (Kharkiv, Ucraina) ed eseguito in conformità con la Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati Utilizzato per scopi sperimentali e altri scopi scientifici (Strasburgo, 1986).

Gli esperimenti sono stati condotti su 32 ratti Wistar maschi (12-di una settimana, 200-230 g di peso corporeo, p.c.), che sono stati alloggiati in gabbie di plexiglas (3 animali per gabbia) a una temperatura di 22±1 grado C in un ciclo di 12-ora luce/buio costante.

È stato utilizzato il modello animale di T2DM indotto da una dieta ipercalorica combinata con iniezioni multiple di streptozotocina a basse dosi (STZ). Il modello prevede lo sviluppo di due caratteristiche principali del T2DM: la dieta ad alto contenuto calorico avvia la resistenza all'insulina e l'STZ a basse dosi induce una lieve compromissione della secrezione di insulina. Pertanto, il modello imita la storia naturale degli eventi della malattia (dalla resistenza all'insulina alla disfunzione cellulare) nonché le caratteristiche metaboliche del DM2 umano (Skovso 2014).

I ratti intatti di controllo (n=8) sono stati alimentati con una dieta standard per 14 settimane. I ratti sperimentali (n=24) sono stati nutriti con una dieta ipercalorica contenente il 15% di strutto, il 25% di saccarosio, l'1% di sali biliari e il 59% di mangime standard per 14 settimane. Gli animali avevano libero accesso all'acqua. In quattro settimane, i ratti sperimentali sono stati iniettati per via intraperitoneale (p.p. con STZ (25 mg/kg p.c.) una volta alla settimana per due settimane (Lin et al. 2010). I ratti di controllo hanno ricevuto tampone citrato seguendo lo stesso schema. Sette giorni dopo il l'ultima iniezione di STZ, il glucosio basale è stato misurato in tutti gli animali e i ratti sperimentali sono stati divisi in tre gruppi: ratti diabetici non trattati (diabete, n{11}}) e ratti diabetici trattati con Qin a una dose di 10 mg/kg di peso corporeo (diabete più Q10,n=8) o 50 mg/kg di peso corporeo (Diabete più Q50, n{17}}) una volta al giorno per via intragastrica mediante sonda gastrica per 8 settimane dopo l'induzione del diabete. I ratti diabetici non trattati hanno ricevuto veicoli insieme allo stesso schema .

Gli animali sono stati sacrificati secondo il protocollo del comitato etico.

Misurazione dell'omeostasi del glucosio. Il test di tolleranza all'insulina intraperitoneale (IPITT) è stato eseguito in ratti a digiuno durante la notte. Le concentrazioni di glucosio nel sangue sono state inizialmente misurate alla condizione basale ({{0}} min), quindi gli animali sono stati somministrati ani. p. iniezione di insulina 0,25 U/kg di peso corporeo (Actrapid, Novo Nordisk, Agsvaerd, Danimarca) seguita da un'iniezione ip di glucosio (2 g/kg) (Bowe et al.2014). Successivamente, i livelli di glucosio nel sangue della coda sono stati misurati utilizzando un analizzatore di glucosio Eksan-G (Analita Firm Joint Stock Company Ltd., Vilnius, Repubblica di Lituania) a 15, 30,60,90 e 120 minuti dopo il carico di glucosio.

Isolamento dei mitocondri. I mitocondri sono stati isolati con procedure convenzionali. Il cuore di ratto appena asportato è stato omogeneizzato in un mezzo contenente {0}}.18 M KCl, 10 mM EDTA, 0,5 percento di albumina di siero bovino (BSA), 10 mM HEPES, pH7,4. Gli omogenati sono stati eliminati dai detriti e nuclei mediante centrifugazione due volte a 500 g (10 min a 4 gradi). I mitocondri sono stati pellettati dai supernatanti a 10000 g (15 minuti a 4 gradi) e risospesi in un tampone di isolamento.

Le frazioni surnatanti post mitocondriali sono state utilizzate per la determinazione delle attività di XO e NOX. Per rimuovere EDTA e albumina, i pellet mitocondriali sono stati centrifugati a 10 000 g (15 min, 4 gradi) e risospesi in tampone di lavaggio contenente 0,18 M KCl e 10 mM HEPES (pH7.4) due volte (DiLisa et al.1994) .

Spettrofotometria. Tutta la spettrofotometria è stata eseguita utilizzando lo spettrofotometro UV-VIS a doppio raggio Shimadzu UV-1800 (Shimadzu Corporation, Kyoto, Giappone).

Misurazione dei prodotti proteici di ossidazione avanzata (AOPP). La determinazione dei livelli di AOPP è stata eseguita con il metodo modificato di Witko-Sarsat e colleghi (Sagor et al.2015). I mitocondri cardiaci (0.2 mg di proteina) sono stati trattati con Triton-X100 allo 0,1% e diluiti in una soluzione PBS(pH7.4).KI (1,16 M) è stato aggiunto al mezzo di analisi, seguito 2 minuti dopo per aggiunta di acido acetico glaciale. L'assorbanza della miscela di reazione è stata immediatamente letta a 340 nm rispetto al bianco. Le concentrazioni di AOPP sono state espresse come proteina T/mg di clorammina nmol-equivalente.

Misurazione dell'attività enzimatica. L'attività di NOX è stata esaminata come produzione di O2 NADPH-dipendente dalla frazione surnatante post mitocondriale utilizzando la riduzione del ferricitocromo c inibibile da SOD (Li et al. 2002). La frazione postmitocondriale dell'omogenato cardiaco (1 mg di proteina) è stata integrata con Tris-HCl 10 mM (pH7.8), 500 μMcytochrome c, 100 μM NADPH, è stata incubata a 37 gradi C per 30 minuti con o senza 200 U/ml SOD. La riduzione del citocromo è stata misurata leggendo l'assorbanza a 550 nm (8=21 mM-1 cm-).

L'attività di XO è stata analizzata in una soluzione PBS (pH7.4) equilibrata con aria che conteneva una frazione postmitocondriale dell'omogenato cardiaco (1 mg di proteina) a 37 gradi dopo l'aggiunta di xantina (concentrazione finale 360μM) mediante misurazione della produzione di acido urico dal cambiamento in assorbanza a 295 nm (e=9500M-'cm-') (Lee et al.2014).

L'attività Mn-SOD nella sospensione mitocondriale è stata rilevata dall'inibizione della riduzione del nitroblue tetrazolio (NBT) causata dal sistema xantina-XO come generatore di O2 e l'assorbanza è stata infine determinata a 560 nm. La miscela di reazione conteneva mitocondri cardiaci (0.{11}}2 mg di proteina),0.05M tampone carbonato (pH10.2),0,1 mM EDTA,0,1 mM xantina,25μM NBT,1 mU/ml XO. I risultati sono stati espressi in unità arbitrarie (au) di attività SOD per mg di proteina. Uno indica la quantità di enzima che causa un'inibizione del 50% del tasso di riduzione dell'NBT (Wang et al. 2018).

L'attività della glutatione reduttasi (GR) è stata misurata monitorando l'ossidazione del NADPH a 340 nm nella reazione di riduzione del glutatione ossidato (GSSG). Per eseguire la reazione, i mitocondri del cuore (0.1 mg di proteina) sono stati incubati per 10 min a 37 gradi in un tampone contenente 20 mM di Tris-HCl (pH7,4) 0,25 mM EDTA, 10 μM FAD, 3 mM GSSG e 0,1 mM NADPH (Raza e John 2004).

La stima dell'attività GPX è stata effettuata in base alla capacità dell'enzima di catalizzare la degradazione del tertbutil idroperossido utilizzando il glutatione ridotto (GSH) come substrato. La miscela di reazione (pH7.0) conteneva mitocondri cardiaci (0,1 mg di proteina), 0,56 mM NADPH,1.0 U/ml GR,7,5 mM di sodio azide, 5 mM GSH, 5 mM EDTA e 0.05 M tampone fosfato. È stato aggiunto terz-butil idroperossido (23 mM) per avviare la reazione. La velocità di formazione del GSSG è stata determinata mediante reazione GR da una diminuzione dell'assorbanza delle sonde a 340 nm (Antunes et al.2002).

Misurazione del contenuto proteico nei campioni. La proteina mitocondriale è stata determinata con il metodo Lowry modificato da Miller, con BSA come standard (Lowry et al.1951; Miller 1959).

Analisi statistica. I dati sono presentati come media ± errore standard della media (SEM). Il test Shapiro-Wilk è stato utilizzato per testare la normalità della distribuzione dei dati. Per confronti multipli di dati con una distribuzione normale, è stata eseguita un'analisi parametrica della varianza unidirezionale (ANOVA) ed è stato utilizzato il metodo Student-Newman-Keuls per testare le differenze nelle medie. I valori sono stati considerati statisticamente significativi a p<>

Risultati

Abbiamo rivelato che il livello di glucosio basale nei ratti alimentati con una dieta ad alto contenuto calorico e iniettati con STZ era significativamente più alto rispetto al gruppo di controllo (Tabella 1). Inoltre, le aree sotto le curve glicemiche (AUC) ottenute durante IPITT erano quasi tre volte più grande negli animali diabetici rispetto a quelli di controllo (Tabella 1, Figura 1).Questi dati confermano lo sviluppo di carenza di insulina relativa e resistenza all'insulina nei ratti sperimentali.

La somministrazione di Q non ha avuto un impatto significativo sull'iperglicemia basale degli animali diabetici. Tuttavia, Q ha influenzato la sensibilità all'insulina nei ratti con T2DM in modo dose-dipendente, diminuendo l'AUC dell'IPITT del 27% nel gruppo sperimentale che ha ricevuto 10 mg/kg del farmaco e del 41% nel gruppo che ha ricevuto 50 mg/kg di Q rispetto agli animali che ricevono il veicolo (Tabella 1, Figura 1).

Il livello di AOPP nei mitocondri cardiaci dei ratti sperimentali è stato aumentato del 66% confermando lo sviluppo dello stress ossidativo nel T2DM (Figura 2). La somministrazione ha comportato una riduzione dell'accumulo di AOPP nel cuore degli animali diabetici a secondasulla dose del farmaco. Nel gruppo sperimentale che ha ricevuto 50 mg/kg di Q, la concentrazione di AOPP è diminuita al livello del gruppo di controllo, suggerendo proprietà antiossidanti di Q (Figura 2).

Come si può vedere nella Figura 3, lo stress ossidativo nei mitocondri cardiaci dei ratti con T2DM era accompagnato dall'attività indotta degli enzimi antiossidanti -Mn-SOD, GPO e GR. La somministrazione di Q in entrambe le dosi ha normalizzato le attività degli enzimi antiossidanti studiati negli animali diabetici al livello del gruppo di controllo (Figura 3).

È stato riscontrato che il T2DM era associato a un aumento del 65% e del 52% delle attività di NOX e XO, due fonti citosoliche primarie di O2 nei cardiomiociti, rispettivamente, nella frazione postmitocondriale del cuore omogenato di ratti sperimentali (Figura 4). L'uso di Q ha portato alla normalizzazione delle attività di NOX e XO nel cuore degli animali diabetici indipendentemente dalla dose (Figura 4).

Discussione

Allo stato attuale, si ritiene che lo stress ossidativo definito come un aumento sostenuto dei radicali liberi a causa di uno squilibrio nella loro produzione e utilizzo sia un meccanismo universale che combina le varie vie patogenetiche delle complicanze cardiovascolari diabetiche (Huynh et al.2014).

Lo stress ossidativo indotto dall'iperglicemia gioca un ruolo di primo piano nella patogenesi del T2DM (Shah and Brownlee 2016). Le principali caratteristiche patologiche del T2DM sono la ridotta secrezione di insulina e la ridotta sensibilità all'ormone nei tessuti periferici. Nella prima fase del nostro studio, la resistenza all'insulina è stata modellata nei ratti utilizzando una dieta ipercalorica. Per quattro settimane, i ratti che hanno ricevuto una dieta ipercalorica sono stati. p. iniettato con STZ per produrre una relativa carenza di insulina. Livelli elevati di glicemia basale e aumento dell'AUC in IPITT hanno indicato lo sviluppo di carenza di insulina e insulino-resistenza negli animali modello.

La somministrazione di Q non ha influenzato i livelli di iperglicemia basale dei ratti diabetici, ma ha migliorato la sensibilità all'insulina in modo dose-dipendente. I risultati sono coerenti con i dati di altri studi sulla capacità di Q di ridurre la resistenza all'insulina (Shi et al. 2019). Il Q aumenta l'utilizzo del glucosio nei tessuti periferici e riduce la produzione di glucosio epatico. Si dice che il flavonoide attivi un meccanismo indipendente dall'insulina che coinvolge la protein chinasi AMP-dipendente, che stimola la traslocazione del trasportatore del glucosio GLUT4 nella membrana plasmatica del muscolo scheletrico e sottoregola gli enzimi chiave della gluconeogenesi nel fegato (fosfoenolo-piruvato carbossichinasi e glucosio {{ 6}}fosfatasi)(Eid e Haddad 2017). Il miglioramento della sensibilità all'insulina da parte di Q può anche essere dovuto alla sua capacità di aumentare l'espressione dell'adiponectina nel tessuto adiposo bianco indipendentemente dall'espressione dei recettori attivati ​​dal proliferatore del perossisoma (Wein et al. 2010).

L'effetto antidiabetico di Q può essere realizzato anche riducendo l'assorbimento di glucosio nell'intestino attraverso l'inattivazione del trasportatore del glucosio GLUT2 (Gaueret al.2018) e l'inibizione dell'attività delle glucosidasi intestinali (Pereira et al. 2011). Inoltre, è stato dimostrato che la Q inibisce l'enzima 1l-idrossisteroide deidrogenasi-1, che svolge un ruolo chiave nello sviluppo dell'obesità e del DM2 influenzando l'azione degli ormoni glucocorticoidi nel fegato, nel tessuto adiposo e nel pancreas -cellule (Torres-Piedra et al.2010).

Si presume che sia lo sviluppo che la progressione delle complicanze diabetiche siano dovuti a un aumento della produzione di ROS (Kayama et al. 2015). Nei cardiomiociti, i ROS sono generati dalla catena di trasporto degli elettroni mitocondriali (ETC), NOX e XO (Tsutsui). et al.2011). Si può affermare che i mitocondri sono i principali contributori di stress ossidativo al T2DM (Shah e Brownlee 2016). Lo sviluppo dello stress ossidativo nei mitocondri è accompagnato dall'interruzione delle vie di segnalazione redox-sensibili, dalla diminuzione della fosforilazione ossidativa e dalla produzione di ATP, dal danno del DNA mitocondriale e, di conseguenza, da un ulteriore aumento della produzione di ROS. Di conseguenza, la cascata patogena di eventi molecolari, che si amplifica, porta al lancio di vie di segnalazione proapoptotiche e alla morte cellulare. Data l'importanza dei mitocondri nel metabolismo cellulare, la loro disfunzione può portare a varie malattie, inclusa la patologia cardiovascolare. La disfunzione mitocondriale si verifica in pazienti con malattia coronarica, cardiomiopatia, insufficienza cardiaca, ictus e T2DM (Bai et al.2016).

Nel nostro studio, lo sviluppo dello stress ossidativo nei mitocondri cardiaci dei ratti diabetici è evidenziato dall'accumulo di AOPP. La concentrazione di AOPP è un marcatore relativamente nuovo di stress ossidativo, che riflette lo stato redox generale delle proteine ​​nelle cellule e nei tessuti. È stato riportato che l'AOPP è elevato nei pazienti con DM, malattie cardiovascolari, ipertensione, aterosclerosi (Conti et al.2019) e il livello è correlato all'insulino-resistenza e alla presenza di gravi complicanze diabetiche (Gradinaru et al. 2013; Taylor et al. 2015). Le modificazioni delle proteine ​​ossidative svolgono un ruolo chiave nello sviluppo della disfunzione miocardica diabetica. I cambiamenti redox delle strutture proteiche possono provocare la dissociazione delle subunità catalitiche degli enzimi, il dispiegamento, l'aggregazione o la frammentazione delle proteine ​​coinvolte nella contrattilità, nell'accoppiamento eccitazione-contrazione, nel ripiegamento delle proteine, nella difesa antiossidante, nel metabolismo e nella manipolazione del Ca2* nel cuore diabetico (Varga et al. 2015). È stato anche scoperto che l'AOPP induce la segnalazione proapoptotica nei cardiomiociti portando allo sviluppo di DCM (Zhang et al.2016).

Negli animali trattati con Q in una dose di 10 mg/kg, è stata osservata una significativa riduzione di AOPP nei mitocondri del cuore, mentre una dose di 50 mg/kg di Q ha completamente normalizzato questo marker rispetto ai ratti che hanno ricevuto il veicolo.

L'effetto antiossidante del Q nei mitocondri può includere diversi meccanismi principali. I flavonoidi hanno la capacità di eliminare i ROS a causa della configurazione ossidrile dell'anello B nella struttura (Kumar e Pandey 2013). Lo scavenging diretto di O, generato nel complesso mitocondriale II dell'ETC nei mitocondri isolati del cuore di ratto è stato dimostrato per Q (Dudy-lina et al. 2019). Inoltre, i flavonoidi possono attenuare la formazione di ROS nei mitocondri attraverso l'inibizione del complesso I e III dell'ETC. L'inibizione della Q dell'attività del complesso I ha ridotto significativamente la produzione di H2O2 nei mitocondri isolati del cuore di ratto (Lagoa et al.2011). Inoltre, è stato riscontrato che la riduzione della generazione di ROS mitocondriali da parte dei flavonoidi è associata a proprietà di disaccoppiamento parziale, in particolare nei mitocondri cardiaci (Bernatoniene et al.2014). Inoltre, è stato dimostrato che i flavonoidi stimolano la biogenesi mitocondriale attraverso l'induzione del co-attivatore trascrizionale PGC-la e del suo regolatore a monte SIRT1. Quest'ultimo porta alla stimolazione di una serie di fattori di trascrizione (NRF1, NRF2 e estrogen-related-a), coinvolti nella regolazione del metabolismo energetico e nella conservazione dell'omeostasi nei mitocondri (Kicinska e Jarmuszkiewicz 2020).

Come risultato del nostro esperimento, l'aumento dello stress ossidativo nei mitocondri cardiaci dei ratti diabetici è stato accompagnato dall'induzione dell'attività degli enzimi antiossidanti-Mn-SOD, GPO e GR. È ben noto che un meccanismo importante nella difesa cellulare contro lo stress ossidativo è l'attivazione della via di segnalazione dipendente da Keapl/Nrf-2-, che controlla l'espressione di geni i cui prodotti proteici sono coinvolti nella disintossicazione e nell'eliminazione di ossidanti reattivi (Nguyen et al. 2009). A questo proposito, l'induzione osservata di enzimi antiossidanti nel cuore degli animali da esperimento è l'implementazione di feedback negativi volti a mantenere l'omeostasi redox.

La somministrazione di Q in entrambe le dosi ha portato a una diminuzione dell'attività di Mn-SOD, GPO e GR nei mitocondri cardiaci degli animali da esperimento a valori statisticamente indifferenti rispetto al gruppo di controllo. Sebbene sia noto che Q induce l'attività degli enzimi di cui sopra (Shi et al.2019), i nostri risultati indicano che l'effetto antiossidante di Q nei cardiomiociti nel T2DM è realizzato maggiormente dalla sua capacità di prevenire l'iperproduzione di ROS e di conseguenza lo sviluppo di disfunzione mitocondriale, che per stimolazione del sistema di difesa antiossidante. In precedenza, è stato dimostrato che l'uso di Q aumenta la capacità ossidativa dei mitocondri e l'attività di alcuni enzimi del ciclo di Krebs nel cuore di ratti con T2DM (Gorbenko et al.2019).

Come notato sopra, i mitocondri sono la fonte primaria, ma non l'unica, di ROS nei cardiomiociti. Il secondo fattore importante nello sviluppo dello stress ossidativo nel cuore diabetico è NOX, con NOX2 e NOX4 come principali isoforme del miocardio. La funzione principale di NOX è generare ROS. NOX2 è localizzato nella membrana plasmatica e partecipa alla segnalazione intracellulare di redox del recettore dell'angiotensina II e altri, mentre NOX4 ha in particolare un segnale di localizzazione mitocondriale ed esibisce attività costitutiva (Cave et al. 2005). È stato dimostrato che l'incubazione di cardiomiociti di ratto con proteine ​​glicate precocemente stimolava la produzione di ROS attraverso un'attivazione di NOX2 dipendente dalla protein chinasi C(PKC) (Zhang et al. 2006). Inoltre, è stato riscontrato che l'ipertrofia cardiaca, la fibrosi e l'apoptosi sono associate a NOX2 sovraregolato nel cuore di topi con DM di tipo 1 e di tipo 2 (Ritchie et al.2007; Huynh et al.2013). Un'ulteriore fonte di ROS nei cardiomiociti è l'XO, che catalizza l'ossidazione dell'ipoxantina e della xantina in acido urico utilizzando O, come recettore degli elettroni e producendo O, e H2O2, nel processo. Sebbene il contributo della reazione dell'XO allo sviluppo dello stress ossidativo nel diabete non sia stato studiato a sufficienza, è stato dimostrato che gli inibitori dell'XO migliorano la disfunzione cardiovascolare nel modello di insufficienza cardiaca indotta da stimolazione (Amado et al. 2005). Nel nostro studio, il T2DM ha portato a un aumento significativo delle attività di NOX e XO nel cuore dei ratti sperimentali. Allo stesso tempo, la somministrazione di Q indipendentemente dalla dose ha normalizzato l'attività degli enzimi. Ad oggi, diversi studi hanno dimostrato la capacità di Q di inibire l'attività di NOX sia riducendo le espressioni delle sue subunità sia impedendone l'attivazione attraverso stimoli extracellulari. Il secondo meccanismo potrebbe essere realizzato riducendo la fosforilazione della subunità regolatrice p47phox a causa dell'effetto inibitorio dei flavonoidi sulla PKC (Redondo et al.2012; Jimenez et al. 2015). Inoltre, O e i suoi metaboliti sono noti per inibire l'attività di XO in modo selettivo, formando la struttura coniugata a tre anelli con il sito attivo e specifiche interazioni di legame idrogeno con residui cataliticamente rilevanti dell'enzima (Taka-Hama et al. 201l; Cao et al.2014).

In sintesi, il nostro studio ha mostrato che Q in modo dose-dipendente ha ridotto l'ossidazione dei radicali liberi nei mitocondri del miocardio di ratti con T2DM, limitando così la formazione di AOPP. Inoltre, il Q in una dose di 10 mg/kg e 50 mg/kg ha impedito lo sviluppo di stress ossidativo nel cuore dei ratti diabetici riducendo le attività di NOX e XO. I dati ottenuti suggeriscono che l'uso di Q può contribuire al miglioramento del rischio cardiovascolare nel T2DM.