Determinazione rapidamente simultanea di sei componenti efficaci in Cistanche tubulosa mediante spettroscopia nel vicino infrarosso
Mar 06, 2022
Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Xinhong Wang, Xiaoguang Wang e Yuhai Guo
Astratto:
La determinazione quantitativa di più componenti efficaci in una data pianta richiede solitamente una quantità molto grande di prodotti naturali autentici. In questo studio abbiamo proposto un metodo rapido e non distruttivo per la determinazione simultanea di echinacoside, verbascoside, mannitolo, saccarosio, glucosio e fruttosio inCistanche tubulosemediante spettroscopia nel vicino infrarosso (NIRS). La spettroscopia a riflettanza diffusa nel vicino infrarosso (DRS) e la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) sono state condotte su 116 lotti di campioni di Cistanche tubulosa. I dati DRS sono stati elaborati utilizzando i metodi standard di varietà normale (SNV) e di correzione della dispersione moltiplicativa (MSC). La regressione dei minimi quadrati parziali (PLSR) è stata utilizzata per costruire modelli di calibrazione per i componenti di interesse in Cistanche tubulosa. Tutti i modelli sono stati quindi valutati calcolando l'errore quadratico medio della calibrazione (RMSEC), il coefficiente di correlazione della calibrazione (r). I valori r di tutti e sei i modelli di calibrazione sono stati determinati come maggiori di 0.94, suggerendo che ogni modello è affidabile. Pertanto, i modelli quantitativi NIR riportati in questo studio possono essere qualificati per quantificare accuratamente il contenuto di sei componenti medicinali inCistanche tubulose.
Parole chiave: Cistanche tubulosa; cromatografia liquida ad alta prestazione; spettroscopia nel vicino infrarosso; minimi quadrati parziali
introduzione
Cistanche(Hoffmg. Et Link) è un genere fanerogamico perenne della famiglia delle piante delle Orobanchaceae. La maggior parte delle specie appartenenti al genere Cistanche sono utilizzate da millenni come pianta medicinale in Cina; avere la reputazione di tonico superiore; e sono conosciuti come "Ginseng dei Deserti" [1,2].Cistanche tubuloseè un parassita obbligato delle radici della pianta perenne Tamarix Chinensis. È stato documentato nella Farmacopea cinese come l'autentica fonte di Cistanches Herba (nome cinese: Roucongrong) dall'edizione 2005 [3]. La moderna ricerca farmacologica sulle specie Cistanche è stata avviata negli anni '80 [4]. Indagini farmacologiche hanno mostrato che gli estratti delle piante di Cistanche possiedono un ampio spettro di attività, come curare la carenza renale e la stitichezza senile, migliorare la capacità di apprendere e memorizzare, anti-malattia di Alzheimer, migliorare l'immunità, anti-invecchiamento, anti-fatica, ecc. [1,5–7]. Negli ultimi tre decenni, studi farmacologici completi e sistematici sono stati combinati con indagini fitochimiche per illuminare le basi materiali degli effetti benefici delle radici delle piante di Cistanche. Queste indagini indicano che i glicosidi feniletanoidi (PhG) erano i principali componenti efficaci nelle piante di Cistanche, svolgendo ruoli chiave per il trattamento della carenza renale, dell'impotenza [8], dell'anti-invecchiamento [9] e del morbo di Alzheimer [10]. Il contenuto di due PhG (echinacoside e verbascoside) era richiesto nella farmacopea cinese. Nel frattempo, i carboidrati come mannitolo, saccarosio, glucosio e fruttosio nelle piante di Cistanche possiedono la funzione lassativa e i grappoli di carboidrati delle piante di Cistanche sono stati utilizzati per il trattamento della stitichezza [11].
Risorse selvagge diCistanche tubulosesono distribuiti principalmente nell'area circostante il deserto del Taklamakan nella regione autonoma dello Xinjiang meridionale in Cina. Simile a molte altre specie usate come medicine tradizionali cinesi (MTC), C. tubulosa è di grande valore economico e quasi estinta nel suo habitat selvaggio a causa della raccolta eccessiva. La coltivazione di C. tubulosa è iniziata negli anni '90 in Cina per garantire l'approvvigionamento di materie prime per Cistanches Herba e proteggere le risorse vegetali selvatiche. Nel 2017, nella prefettura di Hotan nello Xinjiang esistono quasi 13mila ettari di C. tubulosa coltivata [12,13]. Sono richiesti progressi nella tecnologia di impianto per espandere la coltivazione e migliorare la qualitàCistanche tubulose.
Lo scopo principale della coltivazioneCistanche tubuloseè produrre Cistanches Herba, essendo ricco di quei componenti efficaci. Tuttavia, il contenuto dei componenti efficaci in Cistanches Herba, come PhG e oligosaccaridi, può essere significativamente influenzato da molti fattori durante la produzione [12,13]. Dovrebbe essere esplorato un sistema di rilevamento in tempo reale della qualità di C. tubulosa. Pertanto, è necessario sviluppare un metodo ad alta produttività per soddisfare pienamente l'esigenza di analizzare un gran numero di campioni in un breve periodo di tempo. Tradizionalmente, la determinazione di quei componenti primari efficaci, come PhG e carboidrati, in C. tubulosa veniva solitamente ottenuta mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) [14,15]. Sebbene sia accurato e affidabile, è dispendioso in termini di tempo e laborioso per la raccolta e l'elaborazione dei dati. Inoltre, è necessaria una grande quantità di tempo e impegno anche per la preparazione del campione che di solito comporta la polverizzazione, l'estrazione e la filtrazione dei test HPLC. Pertanto, per ottenere una quantità relativamente grande di dati sono necessari un principio chiaro e uno strumento facile da usare. Fortunatamente, la spettroscopia nel vicino infrarosso (NIRS) è stata ampiamente utilizzata per valutare prodotti agricoli [16], cibo [17], campioni medici [18] e prodotti farmaceutici [19] perché è rapida e non distruttiva. Pertanto, NIRS potrebbe soddisfare esattamente i requisiti per misurazioni efficienti di MTC, e non sorprende che NIRS sia stato applicato per l'identificazione qualitativa [20,21] e la quantificazione dei composti [22] in MTC.
In questo studio, il contenuto di sei componenti efficaci, tra cui echinacoside, verbascoside, mannitolo, saccarosio, glucosio e fruttosio in 116 lotti di campioni di C. tubulosa raccolti dalla prefettura di Hotan nello Xinjiang tra il 2013 e il 2015, sono stati inizialmente determinati mediante HPLC. Successivamente, i modelli di calibrazione di queste sei componenti sono stati stabiliti con il metodo della regressione dei minimi quadrati parziali (PLSR). Questi modelli sono stati quindi convalidati con il coefficiente di correlazione e gli errori di previsione nei set di calibrazione. I risultati hanno dimostrato che il metodo sviluppato potrebbe essere impiegato come metodo affidabile per l'analisi quantitativa di C. tubulosa.
Risultato
Analisi HPLC
Il contenuto di echinacoside e verbascoside è stato determinato con un metodo HPLC-UV ben definito in letteratura [3,23] e quattro carboidrati (mannitolo, saccarosio, glucosio e fruttosio) sono stati determinati con un metodo HPLC-ELSD ben definito in la letteratura [24] per tutti i 116 campioni. I metodi di preparazione e determinazione del campione sono stati descritti nelle Sezioni 3.1 e 3.3. La figura 1 mostra i cromatogrammi caratteristici degli standard misti. Si può vedere che tutte e sei le componenti efficaci erano separate dalla linea di base e quindi potevano essere quantificate. Il metodo HPLC è stato validato prima del test del campione. I principali risultati del metodo HPLC sono elencati nella Tabella 1. Nei risultati sono mostrati una relazione lineare favorevole (r=0.9998) e il recupero (98,5 percento) del metodo di determinazione dell'echinacoside, lo stesso risultato di tutti i cinque componenti. Pertanto, il contenuto dei sei componenti effettivi può essere determinato con precisione. Tutti gli intervalli di contenuto determinati sono riassunti nella Tabella 1.
Analisi NIRS
La Figura 2 mostra gli spettri NIR (4000–10,000 cm−1) dei campioni di C. tubulosa. Picchi di assorbimento significativi sono apparsi da 4000 cm-1 a 7500 cm-1 in tutti i campioni, mentre lievi fluttuazioni sono apparse da 7500 cm-1 a 10.000 cm-1. La deriva della linea di base degli spettri NIR si è verificata perché il campione è stato facilmente influenzato da fattori come la dimensione delle particelle e il colore (Figura 2A). Sono stati utilizzati pretrattamenti matematici degli spettri per ridurre in una certa misura l'influenza delle informazioni non necessarie. I pretrattamenti matematici includevano la prima derivazione (1a derivazione), la seconda derivazione (2a derivazione), la varietà normale standard (SNV) e la correzione della dispersione moltiplicativa (MSC). La Figura 2B mostra la 2a derivazione degli spettri NIR di C. tubulosa e le variazioni significative che si sono verificate da tre regioni, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 e 7000–7500 cm−1, sono ovviamente osservate .
Istituzione di modelli di calibrazione quantitativa
La regressione dei minimi quadrati parziali (PLSR) è un metodo di modellazione classico ed è stato ampiamente applicato nei modelli quantitativi a causa dell'elevata qualità dei risultati. I vantaggi del PLSR includono la sua buona capacità di previsione e la relativa semplicità. Il PLSR è stato anche ampiamente applicato nella creazione di modelli quantitativi di calibrazione di MTC [25]. Sulla base degli spettri NIR pretrattati, è stato stabilito il modello di analisi quantitativa NIR per i sei componenti efficaci in C. tubulosa utilizzando il metodo PLSR con i dati dell'analisi HPLC come valori reali. I 116 campioni sono stati divisi casualmente in set di calibrazione e validazione con un rapporto 3:1. Le condizioni più adatte per la calibrazione sono state scelte da un basso RMSEC e da un alto coefficiente di correlazione.
Selezione della Banda d'Onda per i Modelli di Calibrazione
La selezione di una banda d'onda adatta è stata un passo importante per la costruzione di modelli di calibrazione. In questo studio sono stati confrontati gli spettri dell'intervallo NIR di 4000–7500 cm-1 (consigliato dal software dell'analista TQ) e 4000–10.000 cm-1. È stato osservato che questo intervallo non era adatto per la calibrazione nell'intervallo compreso tra 4000 cm-1 e 7500 cm-1 dalla tabella 2. Pertanto, nel presente studio, gli intervalli spettrali per i sei costituenti chimici erano tutti selezionati nell'intervallo da 4000 a 10.000 cm-1 confrontando le prestazioni di RMSEC e il coefficiente di correlazione.
Selezione del numero ottimale di fattori per i modelli di calibrazione
Il PLSR spiega la quantità massima di variabilità nei dati riducendo la dimensionalità dei dati degli spettri mediante il calcolo dei fattori. Il problema dell'"insufficienza di adattamento" è apparso a causa di informazioni insufficienti che derivavano da un numero limitato di fattori; tuttavia, la scelta dei fattori maggiori dei valori ottimali introdotti nel modello determinerà il problema dell'"iperadattamento". Sia "idoneità insufficiente" che "idoneità eccessiva" ridurranno il potere predittivo dei modelli stabiliti [22]. La figura 3 mostra la relazione tra RMSECV e fattori per tutti e sei i composti. Pertanto, abbiamo selezionato quei fattori corrispondenti ai valori più bassi di RMSECV. La selezione ottimale dei fattori per i modelli di calibrazione è elencata nella Tabella 3.
Selezione del pretrattamento spettrale per i modelli di calibrazione
Un altro fattore influenziale più critico per i modelli di calibrazione è il pretrattamento spettrale che mira a ridurre l'influenza dello scattering e della deriva della linea di base, migliorare i rapporti segnale/rumore e rimuovere le variazioni irregolari. Sono stati utilizzati metodi di correzione della dispersione moltiplicativa (MSC) e standard normale variata (SNV) per eliminare l'influenza della diffusione delle radiazioni consueta. Per risolvere gli effetti della deriva della linea di base, sono stati confrontati gli spettri di 1a e 2a derivata ed è stata selezionata la 2a derivazione [26]. Per ottenere l'effetto desiderabile, abbiamo levigato gli spettri con l'algoritmo del filtro Savitzky–Golay (SG) prima della derivazione per prevenire l'ingrandimento del rumore. La tabella 3 mostra le informazioni sul pretrattamento spettrale ei suoi risultati per i modelli di calibrazione.
Valutazione dei modelli consolidati
Un buon modello di calibrazione NIRS dovrebbe avere bassi valori RMSEC e RMSEP, nonché un elevato coefficiente di correlazione (r) e piccole differenze tra RMSEC e RMSEP [27–29]. I modelli di calibrazione dei sei composti selezionati sono stati stabiliti secondo le procedure sopra menzionate (Tabella 3). I valori RMSEC e r per il set di calibrazione dell'echinacoside erano rispettivamente 27,6 e 0,9808. I parametri di prestazione di altri modelli di composti chimici sono elencati nella Tabella 3, da cui possiamo concludere che i modelli stabiliti emergono risultati predittivi soddisfacenti e possono essere utilizzati per l'analisi quantitativa rapida di C. tubulosa. I grafici a dispersione dei sei composti chimici sono mostrati nella Figura 4 per rendere i modelli di calibrazione più descrittivi e osservati visivamente. Come mostrato nella Figura 4, si sono verificate differenze minori tra i valori predittivi e misurati, poiché la maggior parte dei punti è stata distribuita attorno alla curva regressiva con un'equazione come y=x. Pertanto, nella Figura 4 sono state osservate eccellenti prestazioni predittive.
Materiali e metodi
Preparazione del campione
Dal 2013 al 2015 sono stati raccolti centosedici campioni di C. tubulosa dalla prefettura di Hotan nella regione autonoma dello Xinjiang. Tutti i campioni sono stati coltivati, ma sono stati raccolti in diversi stadi di crescita. Il peso fresco dei campioni variava da 20 ga 1000 g. Dopo l'essiccazione al sole, i campioni essiccati sono stati frantumati e setacciati attraverso un 60-setaccio a maglie [3,23].
Raccolta di dati spettroscopici NIR
Gli spettri NIR dei campioni sono stati raccolti a un intervallo di 8 cm-1 sulla regione spettrale di 4000–10.000 cm-1 con un sistema Antaris MXFT-NIR (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) dotato di un adattatore palmare a riflettore di fibre ottiche. Ciascuno spettro è stato ottenuto con una media di 64 scansioni. Tutti i campioni sono stati lasciati equilibrare a temperatura ambiente (25°C) prima della scansione degli spettri NIR per garantire che i campioni fossero analizzati alla stessa temperatura. L'umidità in laboratorio è stata mantenuta a livello ambiente.
Raccolta dati HPLC
Preparazione all'estrazione
Un grammo di polvere di C. tubulosa è stato estratto con 50 mL di metanolo al 50 percento in un matraccio conico con ultra-sonicazione (500 W, 40 kHz) per 30 minuti. L'estratto è stato conservato a 4 ◦C. Il supernatante dell'estratto è stato filtrato per ottenere un campione per l'analisi HPLC [3,23].
Determinazione simultanea di Echinacoside e Verbascoside con HPLC-UV
L'analisi cromatografica liquida è stata condotta su un sistema Shimadzu UHPLC (Shimadzu, Kyoto, Giappone) composto da due unità di erogazione di solvente LC-20ADXR, una pompa LC-20AD, un campionatore SIL-20ACXRauto , un forno a colonna CTO-20AC, un rilevatore DAD SPD-M20A, un sistema di degasaggio DGU-20A3R e un controller ICBM-20A.
Una colonna Grace Prevail Carboidrato ES (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) utilizzata per le separazioni cromatografiche è stata mantenuta a 35 ◦C. La fase mobile era costituita da acetonitrile (A) e 0,1 percento di acido formico acquoso (B) ed è stata rilasciata seguendo il programma del gradiente come segue: 0–7 min, un gradiente lineare di 10–20 percentuale A; 7–15 min, 20 percento A; e 15–20 min, un gradiente lineare del 20–10 percento A. La velocità di confronto della fase mobile era di 0,4 ml/min. Il monitoraggio UV è stato eseguito a 330 nm.
Determinazione simultanea di mannitolo, saccarosio, glucosio e fruttosio con HPLC-ELSD
L'HPLC è stato eseguito su un sistema LC Agilent serie 1100 (Palo Alto, CA, USA) costituito da un degasatore aG1322A, una pompa quaternaria G1311A, un autocampionatore G1311A, un controller di temperatura della colonna G1316A e un rilevatore DAD G1315B.
Una colonna Sigma Prevail Carboidrato ES (4,6 × 250 mm, 5 µm) è stata utilizzata per separazioni cromatografiche e mantenuta a una temperatura della colonna di 25 ◦C. La fase mobile era composta da acetonitrile e acqua (77:23, v/v) e l'alleato isocratico era fornito a una velocità simile di 0,7 mL/min. L'effluente è stato monitorato utilizzando un rivelatore di diffusione della luce evaporativa (ELSD) con parametri predefiniti [23,24].
Elaborazione dati
TQ Analyst (versione 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) è stato utilizzato per eseguire la divisione dei set di calibrazione e convalida, il pretrattamento matematico degli spettri, la definizione dei modelli di calibrazione e altri calcoli. Origin (versione 9.1) è stato utilizzato per creare le figure.
Conclusioni
Ringraziamenti: questo lavoro è stato sostenuto dal National Science and Technology Planning Project of China(2015BAD29B00-04).
Contributi dell'autore: Xinhong Wang ha concepito e progettato gli esperimenti. Xinhong Wang e Xiaoguang Wang hanno eseguito gli esperimenti. Xinhong Wang e Yuhai Guo hanno scritto il giornale.
Conflitti di interesse: Gli autori dichiarano che non vi sono conflitti di interesse.
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