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Lin Bai|Gui-ying Shi|Ya-jun Yang|Wei Chen|Lian-feng Zhang|Chuan Qin

Cistanche ha un effetto antietà

Astratto

Sfondo: Il declino legato al tempo della capacità rigenerativa e dell'omeostasi degli organi è una caratteristica importante diinvecchiamento. Rehmannia glutinosa e Astragalus membranaceus sono stati usati come medicinali tradizionali cinesi a base di erbe per una maggiore immunità e una vita prolungata. Tuttavia, il meccanismo con cui questa medicina erboristica rallenta l'invecchiamento è sconosciuto. In questo studio, abbiamo studiato il meccanismo dell'erboristeriaeffetto antietà.

Metodi: i topi sono stati alimentati con diete integrate con R. glutinosa o A. membranaceus per 10 mesi; il gruppo di controllo è stato alimentato con una dieta standard. I fenotipi sono stati valutati utilizzando un sistema di punteggio di classificazione e un'analisi di sopravvivenza. Le percentuali dei fenotipi di senescenza delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono state determinate mediante analisi di ordinamento cellulare attivato dalla fluorescenza. La funzione e il meccanismo delle HSC sono stati analizzati mediante test clonogenico e reazione a catena della polimerasi in tempo reale.

Risultati: ileffetto antietàdi R. glutinosa è dovuto alla funzione potenziata delle HSC. I topi alimentati con R. glutinosa hanno mostrato caratteristiche di un rallentatoinvecchiamentoprocesso, tra cui una diminuzione della senescenza e un aumento del tasso di sopravvivenza. L'analisi della citometria a flusso ha mostrato una diminuzione del numero di cellule Lin–Sca1 più c–kit– (LSK), HSC a lungo termine (LT–HSC) e HSC a breve termine (ST–HSC) nel gruppo R. glutinosa. In vitro, i test clonogenici hanno mostrato una maggiore capacità di auto-rinnovamento delle LT-HSC del gruppo R. glutinosa, nonché il mantenimento della quiescenza dell'LSK attraverso l'espressione di p18 sovraregolata. Il gruppo R. glutinosa ha anche mostrato una diminuzione dei livelli di specie reattive dell'ossigeno e la percentuale di cellule ‐gal plus attraverso la downregulation della proteina associata alla senescenza cellulare p53 e p16.

Conclusione: esercita la Rehmannia glutinosaanti etàeffetti mantenendo la quiescenza e diminuendo la senescenza delle HSC.

PAROLE CHIAVE:antietà, cellule staminali ematopoietiche, quiescenza, Rehmannia glutinosa

1|INTRODUZIONE

L'invecchiamento è definito come il declino funzionale dipendente dal tempo che colpisce la maggior parte degli organismi viventi.1 La longevità degli organismi è principalmente mantenuta dalle cellule staminali.2 Le cellule staminali tessuto-specifiche hanno la capacità di autorinnovarsi e differenziarsi in una varietà di cellule effettrici. 3 Tuttavia, durante il processo di invecchiamento, questa capacità di auto-rinnovamento diminuisce, portando infine all'accumulo di tessuti danneggiati e non riparati negli organismi invecchiati.4 Perdita della capacità di mantenere un equilibrio tra quiescenza e differenziazione nella cellula staminale/progenitrice compartimento può provocare la morte o malattie associate all'età.2 Inoltre, studi recenti suggeriscono che il ringiovanimento delle cellule staminali può invertire il fenotipo dell'invecchiamento.5,6 Nel sistema ematopoietico, le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono responsabili della produzione di cellule del sangue. Nei topi anziani, il sistema ematopoietico mostra una compromissione delle cellule linfoidi T e B e il numero di cellule mieloidi è aumentato. Le HSC invecchiate hanno mostrato una ridotta attività di auto-rinnovamento e una ridotta capacità ricostruttiva dell'emopoiesi. In particolare, i cambiamenti legati all'età nel compartimento delle CSE si manifestano nell'ospite che invecchia come anemia, maggiore propensione a neoplasie mieloproliferative, diminuzione della funzione immunitaria e aumento dell'incidenza del cancro.7-9 Tuttavia, il meccanismo dell'invecchiamento delle CSE e gli effetti dei medicinali a base di erbe sull'invecchiamento delle CSE sono sconosciuti.10

Le persone si sono preoccupate di ritardare il processo di invecchiamento e rimanere giovani fin dai tempi antichi eanti etàè attualmente oggetto di ricerca. La medicina tradizionale cinese ha ricevuto una crescente attenzione per il trattamento di varie malattie associate all'invecchiamento. Molte erbe usate nella medicina tradizionale cinese sono note per fornire effetti positivi contro l'invecchiamento attraverso diversi meccanismi. Rehmannia glutinosa e Astragalus membranaceus sono stati ampiamente utilizzati in questo modo per migliaia di anni.

Rehmannia glutinosa è usata per trattare vari disturbi del diabete, migliorare il metabolismo osseo nell'osteoporosi e inibire l'infiammazione e la fibrosi del fegato. Inoltre, questa erba ha altri effetti tra cuiantistanchezza, proprietà antidepressive e neuroprotettive. Negli ultimi anni, gli studi farmacologici su R. glutinosa e sui suoi componenti attivi si sono concentrati principalmente sulle sue ampie azioni sul sangue, sul sistema endocrino, cardiovascolare e nervoso.11-14 Pertanto, è stato dimostrato che R. glutinosa possiede un forte sistema immunitario ‐attività di potenziamento, che ha fornito le basi teoriche per ulteriori studi.

L'Astragalus membranaceus possiede proprietà toniche, epatoprotettive, diuretiche ed espettoranti15 ed è stato dimostrato che ha proprietà immunomodulatorie,16antinfiammatorio,eantiossidanteeffetti.17 La delucidazione dei meccanismi molecolari alla base degli effetti delle medicine tradizionali cinesi nella pratica clinica è un passo chiave verso la loro applicazione a livello mondiale e questo argomento è attualmente oggetto di intenso interesse di ricerca.

Pertanto, in questo studio, abbiamo alimentato topi con diete integrate con R. glutinosa e A. membranaceus per 10 mesi per esplorare il meccanismo alla base della capacità di R. glutinosa di aumentare la longevità.

2|MATERIALI E METODI

2.1|Raggruppamento e trattamento degli animali

I topi femmina C57BL/6J sono stati mantenuti in un ambiente privo di agenti patogeni e alimentati con una dieta standard. L'uso di animali in questo studio è stato approvato dai comitati per la cura e l'uso degli animali dell'Istituto di scienze animali da laboratorio del Peking Union Medical College. I topi (di 10 mesi di età) sono stati divisi casualmente in tre gruppi (n=20/gruppo). Il gruppo di controllo è stato alimentato con una dieta standard (Beijing HFK Biosicence, Pechino, Cina). Le diete degli altri due gruppi sono state integrate con R. glutinosa e A. membranaceus macinati (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Pechino, Cina), rispettivamente, alla dose di 200 mg/die per 10 mesi. Questa dose è stata selezionata utilizzando il metodo di normalizzazione della superficie corporea per confermare le dosi di farmaco dagli studi sull'uomo agli studi sui topi. Il peso corporeo è stato determinato ogni 2 mesi e la sopravvivenza è stata registrata giornalmente.

2.2|Valutazione del grado di senescenza

È stato adottato un sistema di punteggio per valutare il grado di senescenza secondo criteri definiti da Takeda et al.18 Ciascuna categoria elencata nel protocollo è stata selezionata tra i segni clinici associati al processo di invecchiamento. Ogni topo è stato valutato a 18 mesi di età e il punteggio in ciascuna categoria è stato sommato per determinare il punteggio complessivo della valutazione.

2.3|Citometria a flusso

Le cellule sono state raccolte dal timo, dalla milza, dal sangue periferico (PB) e dal midollo osseo (BM). La milza e il timo furono immediatamente asportati, lavati con soluzione fisiologica e pesati. Milza e timo sono stati delicatamente omogeneizzati in un omogeneizzatore di vetro e le cellule sono state sospese in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Le cellule di PB sono state applicate alla lisi dei globuli rossi del sangue (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Le cellule di BM sono state isolate lavando sia le tibie che i femori con PBS sterile. Tutte le cellule sono state isolate mediante filtrazione attraverso una rete di nylon sterile e colorate per 30 minuti a 4 gradi con i seguenti anticorpi coniugati con fluoroforo: ficoeritrina (PE) coniugata anti CD3 (G4.18), alloficocianina (APC) coniugata anti ‐ CD4 (OX35) e anti-CD8a coniugato con PE-Cy7 (OX8). Per le cellule BM, i marcatori del lignaggio sono stati colorati utilizzando CD4 anti-topo coniugato con biotina (RM4-5), CD5 (53-7,3) CD8a (53-6,7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), Anche TER119 (TER‐ 119) e Gr1 (RB6‐8C5), seguiti dalla colorazione con l'anticorpo APC-eFluor 780- streptavidina coniugata sono stati ottenuti da eBioscience (San Diego, CA, USA). Per la colorazione della superficie sono stati utilizzati i seguenti anticorpi: immunoglobuline APC (Ig)M (II/41), isotiocianato di fluoresceina (FITC) IgD (11-26), PE-Cy7 Sca- 1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3-6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP-Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) e PerCP-Cy5.5 CD3e (145-2C11). Tutti gli anticorpi sono stati ottenuti da eBiosciences (San Diego, CA, USA). I dati sono stati acquisiti da un FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) e analizzata utilizzando il software FlowJo (Three Star, Ashland, OR, USA).

2.4|Analisi del ciclo cellulare

Per l'analisi del ciclo cellulare, le cellule BM totali sono state colorate per i marcatori di superficie delle cellule staminali (Lin–Scali‐ 1 più c‐KitHigh; LSTKs), quindi fissate e permeabilizzate (00‐5123‐43; Becton Dickinson ) prima della colorazione con FITC Ki‐

67 anticorpo e 7-aminoattinomicina D (7-AAD). L'acquisizione dei dati è stata eseguita su FACS Aria II (Becton Dickinson). I dati sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo.

2.5|Colorazione gal associata alla senescenza

L'attività gal associata alla senescenza (SA) è stata anche saggiata mediante citometria a flusso utilizzando C12FDG come descritto dal produttore (Molecular Probes, Eugene, OR, USA). In breve, le cellule staminali sono state prima colorate per i marcatori di superficie cellulare e quindi incubate con 100 nmol L-1 bafilomicina A1 per 1 ora a 37 gradi per indurre l'alcalinizzazione lisosomiale. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state incubate con 2 mmol L-1 C12FDG per 1-2 ore a 37 gradi e quindi analizzate utilizzando un FACS Aria I (Becton Dickinson).

2.6|Determinazione della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS).

Le cellule sono state incubate con dicloro-diidro-fluoresceina diacetato (DCFH-DA; Beyotime, Shanghai, Cina) a 37 gradi per 20 minuti. DCFH-DA si diffonde passivamente nelle cellule, dove viene deacetilato dalle esterasi per formare 2',7'-diclorofluoresceina non fluorescente (DCFH). La quantità di fluorescenza emessa è correlata alla quantità di ROS nella cellula. I dati sono stati acquisiti su un FACS Aria I (Becton Dickinson) e analizzati utilizzando il software FlowJo.

2.7|Analisi della reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale

L'RNA totale è stato estratto dalle cellule utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. I geni di interesse sono stati amplificati da RNA totali trattati con DNasi I utilizzando la trascrittasi inversa M-MLV (Promega, Madison, WI, USA)

e primer poli-dT. I primer utilizzati per la PCR erano i seguenti: p21 (5′‐TCCAGACATTCAGAGCCACA‐3′ e 5′‐CGAAGAGACAACGG-CACACT‐3′, Tm=60 gradi, 30 cicli), p53 (5′‐CATGAACCGCCGACC- TATC‐ 3′ e 5′‐TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 grado, 35 cicli), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3′ e 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC‐3′, Tm=62 grado, 35 cicli), p57 (5′‐AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3′ e 5′‐TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3′, Tm=61 gradi, 30 cicli), p19 (5′‐ATGGGTCGCAGGTTCTTGGT‐ 3′ e 5′‐GTAGTGGGGGGTCCTCGCAGTT‐3 ′, Tm=61 grado, 35 cicli), p18 (5′-GGGACCTAGAGCAACTTACT-3′ e 5′-TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA-3′, Tm=61 grado, 30 cicli), gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (5′‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3′ e 5′‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3′, Tm {50}} grado, 25 cicli). La PCR in tempo reale (RT) è stata effettuata utilizzando SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Giappone) sul sistema di rilevamento ABI StepOne™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

2.8|Saggi clonogenici

Le HSC a lungo termine (LT) sono state ordinate mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e quindi coltivate in piastre cellulari da 96 pozzetti utilizzando un mezzo a base di metilcellulosa (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) . Sono stati preparati dieci pozzetti replicati per ciascun campione. Abbiamo utilizzato una piastra di coltura cellulare da 96 pozzetti, tre cellule per pozzetto. Due settimane dopo la semina, il numero e le dimensioni delle colonie sono state contate al microscopio.

2.9|analisi statistica

I dati sono stati analizzati dall'ANOVA unidirezionale utilizzando il software Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, USA) e GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). I dati sono stati presentati come media ± DS. P < 0.05="" è="" stato="" considerato="" per="" indicare="" la="" significatività="">

3|RISULTATI

3.1|R. glutinosa e A. membranaceus hanno esercitato effetti antietà

Per confermare ileffetti antietàdi R. glutinosa e A. membranaceus, abbiamo studiato gli effetti della somministrazione come integratore alimentare (200 mg/die). Successivamente, abbiamo registrato il peso corporeo, il grado di senescenza e il tasso di sopravvivenza dei topi. Il peso corporeo dei topi che si alimentavano con R. glutinosa o A. membranaceus era normale rispetto a quelli del gruppo di controllo, sebbene vi fosse una diminuzione del peso corporeo del gruppo R. glutinosa e A. membranaceus a 20 mesi (Figura 1A). L'analisi del grado di senescenza ha rivelato un aumento costante e irreversibile del punteggio di grading con l'avanzare dell'età nei gruppi R. glutinosa e A. membranaceus rispetto a quello del gruppo di controllo, sebbene l'aumento fosse più marcato nel gruppo A. membranaceus gruppo (Figura 1B). L'alto punteggio di classificazione era dovuto a un esordio precoce di perdita di passività e reattività, perdita di lucentezza della pelle e maggiore ruvidità, perdita di capelli, lesioni perioftalmiche, aumento della lordocifosi della colonna vertebrale e un aumento più marcato della loro gravità.18 Topi in A Il gruppo di topi membranaceus ha mostrato caratteristiche fenotipiche di senescenza più marcate, inclusa la perdita di lucentezza della pelle e la caduta dei capelli. Le curve di sopravvivenza hanno mostrato che la durata della vita dei topi nei gruppi R. glutinosa e A. membranaceus era leggermente più lunga di quella del gruppo di controllo (Figura 1C). Questi dati hanno confermato ileffetti antietàdi R. glutinosa e A. membranaceus, sebbene R. glutinosa sia risultato essere più efficiente nel rallentare il processo di invecchiamento.

FIGURA 1 Rehmannia glutinosa e Astragalus membranaceus avevanoeffetti antietà. I topi sono stati alimentati con diete integrate con R. glutinosa o A. membranaceus macinato (200 mg/die); il gruppo di controllo è stato alimentato con una dieta standard. A, Cambiamenti nel peso corporeo dei topi misurati ogni 2 mesi. B, Cambiamenti nel punteggio di classificazione della senescenza dei topi con l'età. C, Curve di sopravvivenza. I dati rappresentano la media ± SD; n=20 topi/gruppo. I dati rappresentano la media ± SD; n=5 topi/gruppo.*P < 0,05,="" ***p=""><>

3.2|R. glutinosa ha ridotto il numero di cellule staminali ematopoietiche

Si ritiene che l'esaurimento delle cellule staminali sia la conseguenza integrativa di molteplici tipi di danni associati all'invecchiamento e una delle principali cause dell'invecchiamento dei tessuti e dell'organismo.1 Studi recenti suggeriscono che il ringiovanimento delle cellule staminali può invertire il fenotipo dell'invecchiamento a livello dell'organismo.5 Noi ipotizzato che ileffetti antietàdi R. glutinosa sono mediati dal miglioramento della funzione delle cellule staminali. Pertanto, abbiamo eseguito l'analisi citofluorimetrica del numero di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche isolate da topi (di età compresa tra 20 mesi) alimentati con diete integrate con R. glutinosa o A. membranaceus (200 mg/d) per 10 mesi (Figura 2A) . La percentuale di LSK è stata ridotta nei gruppi R. glutinosa e A. membranaceus (Figura 2B). Il numero di HSC LT e a breve termine (ST) è stato ridotto di circa il doppio nel gruppo R. glutinosa rispetto al numero nel gruppo di controllo (Figura 2C-D). Un numero maggiore di progenitori linfoidi comuni (CLP) è stato rilevato nel gruppo R. glutinosa rispetto al numero nel gruppo di controllo (Figura 2I). Non ci sono state differenze nel numero di progenitori multipotenti (MPP), progenitori mieloidi comuni (CMP), progenitori granulociti-macrofagi (GMP) e progenitori megacariociti-eritroidi (MEP) nel gruppo R. glutinosa rispetto al numero nel gruppo R. glutinosa. gruppo di controllo. Nel gruppo A. membranaceus, non c'era alcuna differenza significativa nel numero di LT- e ST-HSC rispetto ai numeri nel gruppo di controllo (Figura 2C-D). Inoltre, non vi era alcuna differenza nel numero di cellule MPP, CMP, MEP e CLP rispetto ai numeri nel gruppo di controllo (Figura 2E, 2F, 2H e 2I); tuttavia, il numero di GMP è stato ridotto nel gruppo A. membranaceus. Pertanto, i topi alimentati con diete integrate con R. glutinosa hanno mostrato un numero ridotto di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche.

3.3|R. glutinosa ha potenziato la funzione e mantenuto la quiescenza delle HSC

Per valutare la funzione delle HSC, è stato esaminato in vitro il potenziale clonogenico delle LT-HSC. Abbiamo selezionato le cellule LT-HSC in un mezzo a base di metilcellulosa utilizzando FACS e abbiamo contato il numero e la dimensione delle colonie dopo 14 giorni. Rispetto al numero e alla dimensione delle colonie prodotte dalle cellule dei topi del gruppo di controllo, le cellule dei topi del gruppo R. glutinosa hanno mostrato un aumento del numero delle colonie, soprattutto per le piccole dimensioni (P=0.0241 ) e clone di grandi dimensioni (P=0.0418), mentre non vi era alcuna differenza nel numero dei topi nel gruppo A. membranaceus (Figura 3). L'aumento delle dimensioni e del numero delle colonie nel gruppo R. glutinosa ha suggerito che questa erba migliora il potenziale di auto-rinnovamento delle LT-HSC.

La maggior parte delle HSC nei topi adulti rimane quiescente;19 pertanto, il mantenimento della quiescenza cellulare è un meccanismo essenziale per l'autorinnovamento delle cellule staminali.20,21 Le diminuzioni osservate nelle HSC suggeriscono una ridotta proliferazione cellulare in R. glutinosa e A. gruppi membranaceus; pertanto, abbiamo esaminato lo stato del ciclo cellulare delle HSC attraverso l'analisi del marcatore cellulare proliferativo Ki-67 combinato con la determinazione del contenuto di DNA 7-AAD nella popolazione LSK. Abbiamo osservato un numero maggiore di cellule LSK nella fase G0 nei gruppi R. glutinosa e A. membranaceus rispetto a quello nel gruppo di controllo (Figura 4A). Questi risultati hanno indicato che R. glutinosa e A. membranaceus hanno mantenuto la quiescenza delle HSC.

L'analisi PCR in tempo reale dei regolatori del ciclo cellulare nelle cellule LSK ha rivelato che p18, p19 e p57 hanno svolto ruoli critici nel mantenimento della quiescenza delle HSC. 22-24 Non sono stati osservati cambiamenti evidenti per p57 e p19 (Figura 4C- D) e p18 è stato sovraregolato nel gruppo R. glutinosa rispetto a quello del gruppo di controllo e leggermente sovraregolato nel gruppo A. membranaceus (Figura 4B).

FIGURA 2 Rehmannia glutinosa e Astragalus membranaceus hanno influenzato il numero di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche. Topi (invecchiati

20 mesi) sono stati alimentati con diete integrate con R. glutinosa o A. membranaceus (200 mg/die) per 10 mesi (n=5/gruppo); il gruppo di controllo è stato alimentato con una dieta standard. Le cellule del midollo osseo (BM) appena isolate sono state colorate con gli anticorpi indicati e analizzate mediante citometria a flusso. A, Profili di colorazione rappresentativi delle popolazioni di cellule staminali ematopoietiche e progenitrici BM. B, La percentuale di Lin–Sca1 più cellule c-kit– (LSK) nelle cellule BM. C‐I, Numeri di cellule di (C) a lungo termine (LT; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐Kit, CD34 plus – , Flt3–); D, a breve termine (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit , CD34 plus plus , Flt3–); E, progenitore multipotente (MPP; Lin– ​​, Sca‐ 1 plus , c‐ Kit plus , Flt3 plus ); F, progenitore mieloide comune (CMP; Lin– ​​, Sca‐ 1– , c‐ Kit–, CD34 plus , CD16/ CD32–); G, progenitore dei granulociti-macrofagi (GMP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐Kit–, CD34 plus, CD16/CD32 plus); H, progenitore megacariocita-eritroide (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐Kit–, CD34–, CD16/CD32–); e I, progenitore linfoide comune (CLP; Lin– ​​, Sca‐ 1low, c‐ Kitlow, CD127 plus ). I dati rappresentano la media ± SD; n=5 topi/gruppo. *P < 0,05,="" **p=""><>

3.4|R. glutinosa ha ritardato la senescenza delle HSC

L'integrazione alimentare a lungo termine con R. glutinosa può prolungare la durata della vita dei topi. La senescenza cellulare aumenta con l'età; pertanto, abbiamo studiato la senescenza delle HSC nei topi invecchiati mediante analisi citometrica a flusso di HSC colorate con SA--gal utilizzando un substrato fluorescente-gal (C12FDG).25 La percentuale di cellule SA--gal-positive è stata ridotta nel Gruppo R. glutinosa, indicando che il R. glutinosa ritarda la senescenza delle cellule LSK (Figura 5A).

Le specie reattive dell'ossigeno svolgono un ruolo importante nella senescenza dell'HSC e la perdita della quiescenza dell'HSC è spesso correlata all'aumento dei ROS cellulari.26 L'analisi dei ROS intracellulari negli LSK ha mostrato che i livelli erano diminuiti nel gruppo R. glutinosa rispetto a quelli nel controllo gruppo (Figura 5B). Questi dati hanno indicato che R. glutinosa può mantenere la quiescenza delle HSC e migliorare la funzione delle HSC diminuendo i livelli di ROS.

Abbiamo quindi studiato l'espressione di diversi geni coinvolti nella senescenza cellulare mediante analisi RT-PCR di cellule LSK. Rispetto

FIGURA 3 Funzione delle cellule staminali ematopoietiche potenziata dalla supplementazione dietetica di Rehmannia glutinosa. Potenziale clonogenico in vitro di cellule stellate epatiche a lungo termine di topi (n=3)

con il gruppo di controllo, l'espressione delle proteine ​​p53 e p16 associate alla senescenza cellulare è stata sottoregolata nel gruppo R. glutinosa (Figura 5D-E). Ma l'espressione di p53 e p16 non è stata significativamente sottoregolata tra il gruppo A. membranaceus e il gruppo di controllo (Figura 5D-E). Presi insieme, questi dati mostrano che diversi geni chiave relativi al ciclo cellulare e alla senescenza cellulare regolano la funzione delle HSC nei topi alimentati con diete integrate con R. glutinosa.

3.5|R. glutinosa ha migliorato l'immunità dei linfociti B

I linfociti B e T sono entrambi importanti per le risposte immunologiche. I linfociti T svolgono un ruolo critico nell'immunità cellulare e nella sua regolazione, mentre i linfociti B partecipano principalmente all'immunità umorale. La proliferazione linfocitaria è l'indice più immediato che riflette l'immunità organica. Per studiare il ruolo nel potenziamento immunologico, sono stati esaminati gli effetti di R. glutinosa e A. membranaceus sulla proliferazione dei linfociti.

I topi nel gruppo R. glutinosa hanno mostrato un numero ridotto di HSC e un numero maggiore di CLP. L'analisi citometrica a flusso ha mostrato un aumento del numero di cellule B mature (B220 plus) nel PB, BM e milza dei topi nel gruppo R. glutinosa rispetto ai numeri rilevati nel gruppo di controllo (Figura 6A); tuttavia, non ci sono state differenze significative nel numero di cellule T (CD4 plus e CD8 plus), monociti e granulociti (CD11b plus) tra i due gruppi (Figura 6B-D). Pertanto, questi risultati indicano che la dieta R. glutinosa migliora l'immunità dei linfociti B.

FIGURA 4 Gli integratori alimentari di Rehmannia glutinosa e Astragalus membranaceus hanno mantenuto la quiescenza delle cellule staminali ematopoietiche. A, La percentuale di cellule in ciascuna fase del ciclo cellulare. Analisi citometrica a flusso della 7-aminoactinomicina D (7-AAD) e colorazione Ki-67 delle cellule Lin-Sca1 più c-kit- (LSK). B, Analisi della reazione a catena della polimerasi in tempo reale dell'espressione genica delle cellule LSK ordinate; GAPDH è stato utilizzato per la normalizzazione. I dati rappresentano la media ± SD di tre esperimenti. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

FIGURA 5 L'integrazione dietetica di Rehmannia glutinosa ha ridotto la senescenza delle cellule stellate epatiche (HSC). I topi (di 20 mesi) sono stati alimentati con diete integrate con Rehmannia glutinosa o Astragalus membranaceus (200 mg/die) per 10 mesi (n {{4} }}/gruppo); il gruppo di controllo è stato alimentato con una dieta standard. A, Analisi citometrica a flusso di cellule SA‐‐gal‐positive Lin – Sca1 più c‐kit – (LSK) utilizzando un substrato fluorescente della galattosidasi (C12FDG). B, La percentuale di cellule positive per specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle LSK. Analisi citometrica a flusso di LSK ROS-positivi. I dati rappresentano la media ± deviazione standard (SD). *P < 0.05,="" ***p="">< 0,001.="" c,="" il="" pattern="" di="" espressione="" dei="" geni="" associati="" alla="" senescenza="" cellulare="" nelle="" lsk;="" gapdh="" è="" stato="" utilizzato="" per="" la="" normalizzazione.="" i="" dati="" rappresentano="" la="" media="" ±="" sd="" di="" tre="" esperimenti.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

4|DISCUSSIONE

In questo studio, abbiamo studiato il meccanismo deleffetti antietàdi R. glutinosa o A. membranaceus integrando le diete dei topi con le erbe alla dose di 200 mg/die per 10 mesi. È stato riscontrato che R. glutinosa mostra effetti anti-invecchiamento, tra cui diminuzione della senescenza e aumento della sopravvivenza delle HSC, nonché

potenziata immunità ai linfociti B. Per quanto riguarda il meccanismo deleffetti antietà, abbiamo scoperto che R. glutinosa ha ridotto il numero di HSC, mentre è stata aumentata la capacità di proliferazione. Inoltre, R. glutinosa ha mantenuto la quiescenza delle HSC e ha ridotto il numero di cellule SA-gal-positive e i livelli di ROS attraverso la regolazione di p18, p53 e p16. In combinazione, i nostri risultati hanno confermato che ileffetti antietàdi R. glutinosa nei topi vengono medicati mantenendo la quiescenza e migliorando la funzione delle HSC.

La Rehmannia glutinosa, che è stata usata per migliaia di anni come fitoterapia tradizionale cinese, può essere usata per trattare l'ipoglicemia in vari disordini diabetici.27,28 È stato anche riportato che l'estratto di R. glutinosa migliora il metabolismo osseo.29 Inoltre, R. glutinosa inibisce le risposte infiammatorie e le sindromi,30,31 e protegge dai danni cellulari eliminando i radicali liberi.14,32 In questo studio, abbiamo scoperto che l'integrazione alimentare di topi con R. glutinosa esercitavaeffetti antietàe potenziato l'immunità dei linfociti B aumentando la capacità proliferativa delle LT-HSC e diminuendo il numero di cellule SA-gal-positive e i livelli di ROS.

È stato riscontrato che il grado di danno ossidativo aumenta con l'età in una varietà di cellule e tessuti. Lo stress ossidativo è un determinante critico dell'autorinnovamento delle HSC. La perdita della quiescenza delle LT-HSC è frequentemente correlata all'aumento dei ROS cellulari, che è negativamente associato all'autorinnovamento delle HSC.26 Catalpol è un glucoside iridoide, che è stato trovato nella radice di R. glutinosa. Catalpol ha mostrato in uno studio precedente l'inibizione dello stress ossidativo, del danno al DNA e dell'accorciamento dei telomeri attraverso la via PGC-1/TERT.33 Nel nostro studio, il livello di ROS era diminuito nelle cellule LSK del gruppo R. glutinosa rispetto al gruppo di controllo. Pertanto R. glutinosa prolunga la sopravvivenza dei topi inibendo lo stress ossidativo nelle HSC.

FIGURA 6 Analisi citofluorimetrica della percentuale di cellule immunitarie mature nel sangue periferico (PB), nel midollo osseo (BM), nella milza e nel timo. I topi (di 20 mesi) sono stati alimentati con diete integrate con Rehmannia glutinosa o Astragalus membranaceus (200 mg/die) per 10 mesi (n=5/gruppo); il gruppo di controllo è stato alimentato con una dieta standard. A, Analisi citometrica a flusso della percentuale di cellule B (B220 plus) in PB, BM e milza. B, Analisi citofluorimetrica della percentuale di cellule monocitarie e granulocitarie (CD11b plus ) in PB e BM. C e D, Analisi citometrica a flusso della percentuale di cellule CD4 plus e CD8 plus in PB, milza e timo. I dati rappresentano la media ± SD. *P <>

L'Astragalus membranaceus è anche usato nella medicina tradizionale cinese per promuovere l'immunità, ridurre la glicemia e promuovere l'apoptosi delle cellule tumorali, e ha ancheantiossidanteeanti etàproprietà. In questo studio, abbiamo scoperto che l'integrazione alimentare con A. memranaceus per 10 mesi non ha avuto effetti evidenti rispetto a quelli osservati nei topi di controllo, mentre il peso dei topi è stato ridotto a 20 mesi. Pertanto, A. membranaceus potrebbe non essere adatto per il trattamento LT di topi nutriti.

In conclusione, i nostri risultati mostrano che R. glutinosa può prolungare la durata della vita dei topi mantenendo la quiescenza e migliorando la funzione delle HSC. Inoltre, R. glutinosa può diminuire i livelli intercellulari di ROS e il numero di cellule SA-gal-positive e migliorare l'immunità dei linfociti B.

RINGRAZIAMENTI

Questo studio è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation for China (31672374), dal CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (CIFMS) (2016‐12M‐1‐012) e dal PUMC Youth Fund (2017310018).

CONFLITTO DI INTERESSI

Nessuno.

CONTRIBUTI D'AUTORE

Tutti gli autori elencati soddisfano i requisiti per la paternità. CQ e LFZ hanno ideato e progettato gli esperimenti. LB ha eseguito gli esperimenti e ha scritto il test principale del manoscritto. GYS ha eseguito e analizzato i dati di FACS. YJY ha progettato l'esperimento sulla Medicina Tradizionale Cinese. WC ha gestito i topi. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto.