Effetto renoprotettivo dell'isoliquiritigenina sul danno renale acuto indotto da cisplatino attraverso l'inibizione di FPR2 nei macrofagi

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Tan Rui-Zhi et al

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Astratto

Danno renale acuto (AKI) è una grave complicanza nei pazienti critici. Prove crescenti hanno indicato che i macrofagi svolgono un importante ruolo pro-infiammatorioLesione renale acutae l'isoliquiritigenina (ISL) possono inibire l'infiammazione macrofagica, ma il suo ruolo nelLesione renale acutae il meccanismo sottostante è sconosciuto. Il presente studio mira a studiare l'effetto renoprotettivo dell'ISL sull'AKI e il ruolo dei recettori formilpeptidi 2 (FPR2) in questo processo. In questo studio, il modello AKI indotto da cisplatino e il modello infiammatorio macrofagico indotto da lipopolisaccaridi sono stati impiegati per eseguire gli esperimenti in vivo e in vitro. I risultati hanno mostrato che l'ISL è stato fortemente sollevatodanno renalee ha inibito l'infiammazione renale in vivo e sopprime la risposta infiammatoria macrofagica in vitro. È importante sottolineare che è stato riscontrato che FPR2 era significativamente sovraregolato rispetto al gruppo di controllo nell'AKI e nei macrofagi indotti da LPS, mentre era fortemente soppresso dall'ISL. È interessante notare che la sovraespressione di FPR2 con trasfezione di pcDNA3.1-FPR2 ha effettivamente invertito l'effetto antinfiammatorio dell'ISL nei macrofagi, suggerendo che FPR2 potrebbe essere il potenziale bersaglio dell'ISL per prevenire l'infiammazione e miglioraredanno renalediLesione renale acuta. Presi insieme, questi risultati hanno indicato che l'ISL ha migliorato il cisplatino indottodanno renaleinibendo FPR2 coinvolta l'infiammazione macrofagica, che può fornire una potenziale opzione terapeutica per AKI.

1. Introduzione

Acutorenelesione (AKI) è un tipo grave comune direnemalattia con elevata mortalità.1 È caratterizzata da un rapido declino della funzione renale che si verifica entro 7 giorni o meno. Pubblicazioni recenti hanno riportato che l'incidenza di AKI raggiunge il 5% dei pazienti ricoverati e il 30% dei pazienti gravi eAKIprovoca 2 milioni di morti in tutto il mondo ogni anno, che è diventato un problema sanitario globale. Sebbene la definizione sia ordinaria e uniforme, l'AKI può essere causato da una serie di ragioni, tra cui assunzione di farmaci nefrotossici, danno da ischemia-riperfusione (danno da ischemia-riperfusione, IRI), sepsi, chirurgia cardiovascolare, ipertensione e diabete.2,3 Vecchio età, diabete e insufficienza cardiaca aumentano il rischio di AKI, che di solito porta a malattia renale cronica irreversibile (CKD) e malattia renale allo stadio terminale (ESRD) in alcuni pazienti.4 In particolare, gli studi hanno dimostrato che quasi tutte le cellule immunitarie sono coinvolte nell'infiammazione immunitaria del rene nell'AKI.5 Tra questi, i macrofagi hanno dimostrato di avere un ruolo importante nella promozione dell'infiammazione renale.6 L'eliminazione dei macrofagi migliora il danno e l'infiammazione renale dell'AKI.7 Pertanto, un'efficace inibizione dell'infiammazione macrofagica può essere utile per migliorare gli attuali approcci terapeutici per la gestione dell'AKI.

L'isoliquiritigenina (ISL) è un flavonoide con struttura a calcone, radicato nella famosa erboristeria tradizionale cinese.8 Negli ultimi anni ha attirato ampia attenzione da parte degli scienziati per le sue proprietà antiossidanti, antinfiammatorie, antiaggreganti piastriniche, antibatteriche , proprietà antivirali, antitumorali, epatoprotettive, neuroprotettive, di protezione cardiaca e di disintossicazione.9 È stato dimostrato che l'ISL inibisce la proliferazione cellulare, riduce i ROS e induce apoptosi, necrotico e morte delle cellule tumorali a vari livelli.10 Recenti i rapporti hanno indicato che l'isoliquiritigenina può inibire la produzione di IL-6 e TNF-a indotta dalla porzione lipidica A di LPS nei macrofagi RAW264.7 e attenuare la formazione del complesso LPS-TLR4/MD-2. Inoltre, l'ISL può indurre l'apoptosi delle cellule HepG2 attraverso le vie di segnalazione MAPK, STAT3 e NF-kB mediate da ROS.11 Prove sperimentali hanno anche mostrato che l'ISL induce l'attivazione intrinseca mediata da ROS e attiva il meccanismo della proteasi mitocondriale-citocromo c-cisteina dell'apoptosi delle cellule PC-12. Vale la pena notare che l'ISL è spesso usato come integratore alimentare per le donne.12 Studi recenti hanno dimostrato che l'ISL ha un significativo effetto antinfiammatorio sull'AKI, ma il meccanismo d'azione specifico non è ancora chiaro.

Precedenti ricerche del nostro team hanno scoperto che Mincle, la lectina di tipo C indotta dai macrofagi, è un recettore di riconoscimento del pattern transmembrana coinvolto nell'infiammazione renale,13 attraverso il quale abbiamo selezionato i recettori del peptide formile 2 (FPR2) che ha una certa relazione con Mincle da la banca dati GEO. Tuttavia, il suo ruolo nella malattia renale acuta non è stato verificato. FPR2 è un gene codificante per proteine ​​che appartiene alla famiglia dei recettori accoppiati a proteine ​​G e contiene 351 residui di amminoacidi.14,15 Sono 7- recettori accoppiati a proteine ​​G transmembrana che possono mediare la regolazione immunitaria, la secrezione del fattore infiammatorio, chemiotassi cellulare e adesione cellulare, che sono strettamente correlate all'insorgenza e allo sviluppo di varie malattie.16 La sua omologia con FPR1 e FPR3 raggiunge il 69% e l'83%. Le sottocelle FPR2 sono localizzate nella membrana cellulare e sono proteine ​​di membrana multi-pass. Sono espressi principalmente in neutrofili, eosinofili, monociti, cellule epiteliali, fibroblasti, cellule gliali, cellule mesangiali, ecc., distribuiti in vari organi come polmone, milza e fegato. In particolare, FPR2 è abbondantemente espresso nell'interstizio renale,17 dove risiedono le cellule infiammatorie. La funzione principale di FPR2 è quella di combinare alcuni mezzi specializzati che promuovono la decomposizione (SPM) per mediare l'attività di questi metaboliti nel sopprimere ed eliminare l'infiammazione. Tuttavia, il ruolo di FPR2 nell'infiammazione dell'AKI e se può essere utilizzato come bersaglio per un intervento farmacologico è ancora sconosciuto.

In questo studio, abbiamo impiegato un modello di AKI murino indotto da farmaci nefrotossici e un modello di cellule infiammatorie indotto da LPS per esplorare l'effetto di miglioramento dell'ISL sulla lesione e l'infiammazione dei reni nell'AKI, nonché il ruolo chiave di FPR2 nell'infiammazione renale e trattamento ISL dell'AKI. Questo studio fornirà nuove direzioni per comprendere il meccanismo del danno infiammatorio e le strategie di trattamento per l'AKI.

2. Materiali e metodi

2.1. Droghe

Isoliquiritigenin (purity>98 percento) è un composto isoflavonico estratto dalla radice di liquirizia. La sua formula molecolare è C15H12O4. In questo studio, l'isoliquiritigenina è stata acquistata da Chengdu Bio purify Phytochemicals Ltd. (BP0787), disciolta nel 10% di DMSO (ST038, Beyotime, Cina) e topi indotti da cisplatino sono stati somministrati per via intragastrica in una dose di 7,5 mg/kg e 30 mg /kg, rispettivamente.

2.2. Isolamento di BMDM

Sono stati selezionati topi maschi C57BL/6 con età di 6e8 settimane per isolare le cellule BMDM. Separare con cura l'osso della zampa posteriore dal femore e rimuovere i muscoli attaccati. Macinare le ossa in PBS con un mortaio fino a quando il colore delle ossa cambia dal rosso al bianco. Successivamente, raccogliere il supernatante e filtrare attraverso un colino 70, seguito da centrifugazione a 1500 rpm per 5 min. Gli eritrociti sono stati rotti in liquido filtrato con 10 - PBS, che è stato quindi filtrato su un colino cellulare da 40 mm. Incubare le cellule ottenute in un piatto di coltura da 10 cm e indurre con il 30 percento di surnatante L929 per 7 giorni. Le cellule BMDM sono state stimolate con 100 ng/ml LPS per costruire il modello cellulare infiammatorio.

2.3. Atterramento e sovraespressione di FPR2 in BMDM

FPR2 è stato sottoregolato mediante trasfezione con Zeta LifeAdvanced Transfection Reagent (AD600050, Zeta life, USA) e FPR2 siRNA a BMDM (Le sequenze di FPR2 siRNA: Sense, 5'-GGAGAUGUGUAUUGUACAUTT-3'; Antisense, 5'-AUGUACAAUACA CAUCUCCTT-3". Sangon Biotech, Cina). Allo stesso modo, pcDNA3.{12}}Il plasmide FPR2 (costruito da Fenghui Biotech, Cina) è stato trasfettato in BMDM con ZETA per sovraesprimere FPR2 nelle cellule.

2.4. Esperimenti sugli animali

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida del Comitato Etico della Southwest MedicalUniversity. 32 topi maschi C57BL/6 sono stati acquistati da ChengduDaShuo Animal Co., Ltd, che sono stati divisi casualmente in 4 gruppi: gruppo sham, gruppo modello (gruppo AKI indotto da cisplatino), gruppo ISL a basso dosaggio (7,5 mg/kg, gruppo L), e gruppo ad alto dosaggio (30 mg/kg, gruppo H). Al gruppo modello è stato iniettato 20 mg/kg di cisplatino (P4394, Sigma-Aldrich, USA) il primo giorno, mentre al gruppo a basso dosaggio è stato somministrato 7,5 mg/kg ISL e al gruppo alto è stato somministrato 30 mg/kg ISL per 3 giorni . Dopo 3 giorni, siero e rene sono stati raccolti dai topi sacrificati.

2.5. Test di funzionalità renale

Dopo aver raccolto il siero di ciascun gruppo di topi, seguire rigorosamente le istruzioni dei kit per rilevare i livelli di creatinina sierica (C011-2-1, Jiancheng Biotech, Cina) e azoto ureico (C013-2-1, Jiancheng Biotech, Cina).

2.6. Colorazione patologica

Colorazione H&E: deceratura e reidratazione della sezione di routine, colorazione con ematossilina per 5 min, risciacquo con acqua RO, separazione di acido cloridrico all'1% per 2 s, risciacquo con acqua di rubinetto, immersione in etanolo al 75% per 2 s, eosina solubile in alcol all'1% per 30 s , risciacquo con acqua di rubinetto, etanolo al 100% Disidratare per 1 min, asciugare, xilene trasparente per 10 min, asciugare, sigillare con mezzo di montaggio balsamo neutro (36313ES60, Yepsen, Cina).

Colorazione PAS: le fette sono state poste in una soluzione acida periodica a temperatura ambiente per 5 e8 minuti, seguite da un risciacquo due volte con acqua RO. Quindi, mettere queste fette nel reagente Schiff per 10 e 20 min, risciacquare con acqua di rubinetto per 10 min, colorate in ematossilina per 1 e2 min, disidratate e trasparenti in alcol al 100 per cento, asciugare, sigillare con mezzo di montaggio balsamo neutro.

2.7. Immunofluorescenza

Posizionare le sezioni di tessuto congelate in PBS, lavare due volte, fissare con il 10 percento di formaldeide per 10 min. Il tessuto sulle sezioni è stato bloccato con siero di capra al 5% per 30 minuti, seguito da incubazione con FPR2 anti-topo primario di topo (1:200, sc-57141, Santa Cruz, USA) e F4/80 anti-topo di ratto anticorpi (1:200, sc-52664, Santa Cruz, USA) a4 - C durante la notte. Il giorno successivo, lavare le sezioni due volte con PBS, incubare con l'anticorpo secondario (1: 200) a temperatura ambiente per 1 h e colorare il nucleo con DAPI. Le immagini sono state catturate dal sistema EVOS.

2.8. Elisa

La concentrazione di IL-1b, IL-6, TNF-a nel siero e nel surnatante cellulare è stata analizzata utilizzando i kit ELISA (EMC001B, EMC004, EMC102A, Neobioscience, Cina) secondo le istruzioni del kit.

2.9. RealTime-PCR

L'RNA totale è stato estratto utilizzando un kit di estrazione dell'RNA (Tiangen, Cina) seguendo le istruzioni del produttore. Dopo aver trascritto inversamente l'RNA estratto in cDNA, aggiungendolo a un sistema di reazione da 10 ml per eseguire la PCR in tempo reale con il sistema Roche LightCycler 48{10}} e il sistema di reazione è il seguente: Eastep® qPCR MasterMix 2 -, 5 ml; modello di cDNA, 1 ml; primer a monte (10 mM), 0,5 ml; primer a valle (10 mM), 0,5 mL; Acqua priva di nucleasi, 3 ml. I primer utilizzati in questo esperimento sono stati sintetizzati da Sangon (Shanghai, Cina) e le sequenze di tutti i primer sono elencate nella Tabella 1.

2.10. Macchia occidentale

Il tampone di lisi RIPA è stato utilizzato per estrarre proteine ​​dai tessuti renali e dalle cellule BMDM. Dopo aver risolto la proteina in SDS-PAGEgel al 10% e trasferita sulla membrana PVDF, bloccando la membrana in BSA al 5% per 1 ora e lavata con TBST 3 volte, quindi incubando la membrana con anticorpi primari a 4 - C durante la notte (preparato con il 5 percento di BSA, 1: 1000). Quindi, le membrane sono state incubate con l'anticorpo secondario (IgG anti-topo di capra coniugata con perossidasi (ZB-2305, 1:3000), IgG anti-coniglio di capra (ZB-2301, 1:3000)). a temperatura ambiente per 1 h. Le immagini sono state catturate da un sistema di imaging in gel (BIORAD, USA). L'intensità del grigio delle bande è stata calcolata dal software Image J.

2.11. analisi statistica

I risultati sono stati mostrati come media ± deviazione standard. L'analisi dei dati è stata eseguita con un test ANOVA unidirezionale seguito da un confronto multiplo con il test LSD utilizzando il software SPSS 21.0. P < 0.05="" è="" stato="" considerato="" statisticamente="" significativo.="" ogni="" gruppo="" di="" esperimenti="" si="" duplica="" 3="">

3. Risultati

3.1. L'isoliquiritigenina ha migliorato il danno renale indotto dal cisplatino e ha inibito l'infiammazione renale

Per studiare gli effetti renoprotettivi e antinfiammatori dell'isoliquiritigenina nell'AKI, abbiamo rilevato i livelli di Cre e BUN sierici di ciascun gruppo, nonché l'espressione e la secrezione di citochine infiammatorie mediante PCR ed ELISA in tempo reale. Inoltre, la patologia renale è stata misurata mediante colorazione H&E e PAS. I risultati hanno mostrato che rispetto al gruppo normale, i livelli sierici di Cre e BUN erano aumentati nel modello AKI, mentre il trattamento con 7,5 mg/kg o 30 mg/kg di ISL ha ridotto significativamente i livelli sierici di Cre e BUN, tra questi , una dose di 30 mg/kg ha il miglior effetto terapeutico (Fig. 1A e B). In particolare, 30 mg/kg di ISL possono migliorare il danno tubulare renale in base alla percentuale di necrosi tubulare valutata (Fig. 1C). I risultati dell'ELISA e della PCR hanno mostrato che la secrezione di IL-1b, IL-6 e TNF-a è sottoregolata dopo l'intervento di ISL (7,5 mg/kg e 30 mg/kg) e l'espressione dell'mRNA anche di IL-1b, IL-6 e TNF-a sono stati notevolmente ridotti dalla somministrazione di 30 mg/kg di ISL (Fig. 1DeI). D'altra parte, i risultati della colorazione H&E e PAS hanno dimostrato che il rene nel gruppo AKI presentava grave danno tubulare renale, epitelio renale sparso, cellule mesangiali e iperplasia interstiziale mesangiale e infiltrazione di cellule infiammatorie, sorprendentemente 30 mg/kg di ISL può invertire efficacemente la lesione del rene nell'AKI (Fig. 1J). Tutti i risultati hanno rivelato che la somministrazione di 7,5 mg/kg e 30 mg/kg di ISL può sia migliorare il danno renale indotto dal cisplatino che inibire l'infiammazione renale, in cui 30 mg/kg di ISL hanno l'effetto migliore.

3.2. L'isoliquiritigenina ha ridotto l'espressione di FPR2 nei macrofagi dei topi AKI

Molti rapporti precedenti hanno indicato che FPR2 svolge un ruolo vitale nella risposta immunitaria e nelle malattie legate all'infiammazione. Tuttavia, il potenziale effetto di FPR2 nel rene di AKI non è definito. In questo studio, abbiamo eseguito l'immunofluorescenza per localizzare FPR2 e macrofagi (F4/80, un produttore di macrofagi). I risultati hanno mostrato che i macrofagi (macchie verdi) erano infiltrati in modo voluminoso nel rene dei topi AKI, mentre FPR2 (macchie rosse) era co-localizzato con F4/80, illustrando che FPR2 era principalmente espresso sui macrofagi e il livello di FPR2 era significativamente aumentato nel rene dei topi AKI (Fig. 2A). Abbiamo inoltre rilevato l'espressione dell'mRNA di FPR2 e delle proteine ​​correlate all'infiammazione mediante PCR in tempo reale e western blotting nel rene, e i risultati hanno dimostrato che 30 mg/kg di ISL possono sottoregolare efficacemente i livelli di mRNA e proteine ​​di FPR2 nel rene di topi AKI rispetto a 7,5 mg/kg del gruppo ISL (Fig. 2B, G, H). È importante sottolineare che i risultati del western blotting hanno mostrato che 30 mg/kg di ISL inibivano anche l'attivazione di p-65 e regolavano i livelli proteici di TNF-a, IL-6 e IL{{28} } b nel rene di topi AKI (Fig. 2CeF). Tutti i dati di cui sopra hanno suggerito che l'infiammazione renale alleviata dall'ISL dei topi AKI può essere correlata alla riduzione dell'espressione di FPR2 nei macrofagi.

3.3. L'isoliquiritigenina ha soppresso l'espressione e la secrezione di FPR2 e citochine infiammatorie nelle cellule BMDM indotte da LPS

Per rilevare ulteriormente gli effetti dell'ISL sulle cellule BMDM indotte da LPS, abbiamo esaminato il livello di mRNA di FPR2, l'espressione e la secrezione di citochine infiammatorie nelle cellule BMDM indotte da LPS dopo la somministrazione di ISL mediante PCR ed ELISA in tempo reale. I risultati hanno dimostrato che l'ISL ha ridotto il livello di mRNA di FPR2, IL-1b, IL-6 e TNF-a (Fig. 3AeD), nonché la secrezione di IL-1b , IL-6 e TNF-a nel surnatante cellulare nelle cellule BMDM indotte da LPS (Fig. 3EeG). I risultati di cui sopra hanno suggerito che il trattamento dell'ISL con la concentrazione di 40 mM ha fortemente inibito l'infiammazione nelle cellule BMDM indotte da LPS.

3.4. L'isoliquiritigenina ha sottoregolato i livelli proteici di FPR2 e citochine infiammatorie nelle cellule BMDM indotte da LPS

Abbiamo anche rilevato i livelli proteici di FPR2 e citochine infiammatorie nelle cellule BMDM indotte da LPS dopo la somministrazione di ISL mediante western blotting. I dati hanno mostrato che rispetto al gruppo di controllo, i livelli proteici di FPR2, p-p65, IL-6 e TNF-a erano significativamente aumentati nelle cellule BMDM indotte da LPS e fortemente ridotti con la somministrazione di ISL a 40 mM ( Fig. 4AeE). Questi risultati hanno ulteriormente illustrato che l'ISL può sopprimere l'attivazione di NF-kB e down-regolare i livelli proteici delle citochine infiammatorie nelle cellule BMDM indotte da LPS.

3.5. L'inibizione di FPR2 ha soppresso l'infiammazione indotta da LPS nelle cellule BMDM

Per esplorare il ruolo di FPR2 nell'infiammazione dei macrofagi, abbiamo usato siRNA per abbattere FPR2 nelle cellule BMDM. I risultati hanno mostrato che la trasfezione di siRNA può inibire significativamente l'espressione di FPR2 nel macrofago indotto da LPS (Fig. 5A) e ridurre efficacemente l'espressione di IL-1b e TNF-a (Fig. 5B e C). Inoltre, i risultati del western blot hanno dimostrato che dopo la trasfezione di siRNA, il livello proteico di FPR2 era significativamente inibito, indipendentemente dal fatto che fosse stimolato da LPS (Fig. 5D ed E). In particolare, l'abbattimento di FPR2 ha ridotto significativamente i livelli proteici delle citochine infiammatorie e ha inibito l'attività della segnalazione di NF-kB (Fig. 5FeK), indicando che FPR2 svolge un ruolo importante nel promuovere la risposta infiammatoria nei macrofagi. Inoltre, potrebbe essere l'obiettivo chiave dell'ISL per inibire l'infiammazione dei macrofagi.

3.6. La sovraespressione di FPR2 ha contrastato l'effetto antinfiammatorio dell'isoliquiritigenina nelle cellule BMDM indotte da LPS

Per determinare che l'ISL sopprime l'infiammazione nell'AKI attraverso l'inibizione di FPR2 nei macrofagi, abbiamo usato il plasmide di sovraespressione di FPR2 per sovraregolare l'espressione di FPR2 nelle cellule BMDM infiammatorie trattate con ISL. Come mostrato in Fig. 6, il livello di proteine ​​e mRNA di FPR2 era significativamente aumentato nel pcDNA3. 1- Gruppo trasfettato con FPR2 (Fig. 6A, B, G) e la sovraespressione di FPR2 ha effettivamente abolito l'effetto inibitorio di 40 mM ISL sull'attivazione di p65 e sui livelli proteici di IL-1b, IL-6 e TNF-a nelle cellule BMDM indotte da LPS (Fig. 6CeF). Allo stesso modo, l'up-regolato di FPR2 ha rimosso l'effetto soppressivo di 40 mM ISL sull'espressione e la secrezione di citochine infiammatorie nelle cellule BMDM indotte da LPS, come IL-1b, IL-6 e TNF-a (Fig. 6HeM), suggerendo che l'ISL ha ridotto l'infiammazione nelle cellule BMDM indotte da LPS inibendo FPR2.

4. Discussione

Il danno renale acuto è una delle malattie cliniche più comuni. Di solito porta alla compromissione della funzione immunitaria dei pazienti in un breve periodo. In caso di trauma, perdita di sangue, danno d'organo, shock, il rene è l'organo più suscettibile ed è incline a trasformarsi in una lesione acuta.18e20 Numerosi studi hanno confermato che l'infiammazione gioca un ruolo chiave nello sviluppo dell'AKI, che è stata considerata come potenziale obiettivo di intervento per il trattamento dell'AKI. Negli ultimi anni, le medicine cinesi hanno compiuto enormi progressi nell'intervento sull'infiammazione, tra cui la curcumina, la quercetina, la naringenina e altri monomeri. L'iso-liquiritigenina è un composto flavonoide, che ha molte attività biologiche, come antinfiammatorio, antiradicali liberi, antitumorale e altri effetti.21 Studi precedenti hanno scoperto che l'ISL inibiva l'apoptosi, l'infiammazione e la produzione di matrice extracellulare nell'angiotensina Cellule HK-2 indotte da II.22 Studi di Wu Yangping hanno dimostrato che l'ISL può sottoregolare IL-6 e IL{12}} inibendo l'attività di NF-kB nel modello di psoriasi, suggerendo L'ISL potrebbe essere un candidato per il trattamento della psoriasi e di altre malattie infiammatorie autoimmuni.23 D'altra parte, uno studio recente ha dimostrato che l'ISL potrebbe alleviare l'AKI settico sopprimendo la traslocazione di NF-kB p65 e inibendo le risposte infiammatorie.24 In questo studio, abbiamo scoperto che l'ISL può migliorare efficacemente la funzione renale nei topi AKI indotti da cisplatino, ridurre il danno renale e inibire l'infiammazione renale. Tuttavia, il meccanismo preciso dell'ISL che inibisce l'infiammazione non è chiaro.

FPR2 appartiene alla famiglia dei recettori chemiotattici ed è un recettore accoppiato a proteine ​​G di 7 volte transmembrana. Precedenti studi hanno scoperto che FPR2 è coinvolto in una varietà di processi fisiologici e patologici, tra cui risposte di difesa, infiammazione, malattie neurodegenerative, tumori, disturbi legati al metabolismo del glucosio e dei lipidi.25,26 FPR2 può essere sovraregolato da lipopolisaccaridi, vari fattori infiammatori, e la prostaglandina E2 nel processo infiammatorio che può svolgere un ruolo antinfiammatorio e pro-infiammatorio.27,28 I diversi effetti di FPR2 sull'infiammazione dipendono dall'ambiente e dai ligandi che attivano diverse vie di segnalazione.29 In questo studio, abbiamo scoperto che FPR2 è espresso principalmente nei macrofagi nell'interstizio renale ed è altamente espresso nel rene dei topi AKI indotti da cisplatino, suggerendo che FPR2 nei macrofagi può essere coinvolto nella risposta infiammatoria dei macrofagi nel rene AKI. Prove crescenti hanno confermato che un gran numero di macrofagi si è infiltrato nel rene entro poche ore dall'insorgenza di AKI e ha aggravato il danno renale rispondendo all'infiammazione.30e33 Pertanto, una sottoregolazione dell'infiammazione dei macrofagi infiltrati nel rene AKI può essere una direzione importante per migliorare l'AKI e non è noto se FPR2 sia coinvolto in questo processo.

I nostri risultati sperimentali hanno mostrato che il trattamento con ISL a basse e alte dosi nei topi AKI indotti da cisplatino, non solo può migliorare la struttura e la funzione renale, ma anche ridurre il livello di citochine infiammatorie. Inoltre, l'ISL può ridurre efficacemente il livello proteico di FPR2 e l'attività di p65. Poiché FPR2 è espresso principalmente nei macrofagi, indica che l'ISL può migliorare l'infiammazione renale inibendo FPR2 nei macrofagi. A causa dell'importante ruolo del macrofago infiltrato nell'infiammazione renale, abbiamo quindi estratto i macrofagi primari derivati ​​​​dal midollo osseo per il rilevamento in vitro dell'effetto di miglioramento dell'ISL sull'infiammazione dei macrofagi e sul potenziale meccanismo. I nostri risultati hanno mostrato che l'ISL può inibire significativamente l'infiammazione dei macrofagi indotta da LPS e sottoregolare l'espressione e la secrezione dei fattori infiammatori IL-1b, IL-6 e TNF-a. Allo stesso tempo, l'ISL può anche ridurre il livello proteico delle molecole infiammatorie nei macrofagi e inibisce l'espressione dell'mRNA e i livelli proteici di FPR2 stimolati da LPS. Per verificare il ruolo chiave dell'inibizione di FPR2 dell'infiammazione con ISL, abbiamo utilizzato il pcDNA3.1-FPR2plasmide per sovraesprimere FPR2 e abbiamo scoperto che nel macrofago infiammatorio trattato con ISL, la sovraespressione di FPR2 neutralizza l'effetto inibitorio di ISL sull'infiammazione, indicando che l'infiammazione dei macrofagi sottoregolata dall'ISL è principalmente attraverso l'inibizione di FPR2. In particolare, abbiamo utilizzato il modello AKI indotto da cisplatino in vivo e selezionato il modello cellulare infiammatorio indotto da LPS in vitro. Sebbene i reagenti di induzione dei due modelli non siano coerenti, questi due metodi sono attualmente riconosciuti per costruire modelli di infiammazione rispettivamente in vivo e in vitro. Dato che questa ricerca si concentra sulle risposte infiammatorie, è possibile utilizzare questi due metodi in uno studio.

Questi dati hanno dimostrato che l'ISL può ridurre efficacemente l'espressione di fattori infiammatori in vivo e in vitro e può essere ottenuto inibendo l'espressione di FPR2. L'ISL può quindi fungere da potenziale farmaco terapeutico per l'AKI.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal Luzhou - Southwest MedicalUniversity Joint Project (2017LZXNYD-P01 e 2018LZXNYD-PT03), dalla Southwest Medical University - Affiliated Traditional MedicineHospital Joint Project (2018XYLH-034), dal progetto di costruzione del Sichuan Provincial Key Laboratory of Medicina (2018#53), il progetto scientifico e tecnologico di Luzhou (2020-JYJ-56) e la borsa speciale congiunta Luzhou Municipal - Southwest Medical University per l'introduzione di talenti di alto livello (Lan Hui-Yao Team ).

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