I sierotipi di Salmonella Enterica in assenza dei geni TtrA e PduA migliorano la risposta immunitaria cellulare durante le infezioni dei pulcini

Salmonella spp. è uno dei principali agenti patogeni di origine alimentare responsabile di perdite economiche per l’industria del pollame e di conseguenze anche per la salute pubblica. Sia la capacità di sopravvivenza dei patogeni nell'ambiente intestinale durante l'infiammazione, sia la loro relazione con il sistema immunitario ospite, svolgono un ruolo chiave durante le infezioni nel pollame. L'obiettivo di questo studio era di quantificare la presenza delle popolazioni di macrofagi e di cellule CD4+ /CD8+ utilizzando la tecnica immunoistochimica, in linee commerciali di polli infettati sperimentalmente da ceppi selvatici e mutanti di Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium prive dei geni ttrA e pduA. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA ha attivato una percentuale maggiore dell'area colorata rispetto al tipo selvatico, ad eccezione delle galline ovaiole leggere. Il ceppo selvatico di Salmonella Typhimurium e le infezioni da Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA portano a un modello simile in cui, a 1 e 14 dpi, le tonsille cecali e l'ileo degli uccelli mostravano un'area colorata più espressiva rispetto a 3 e 7 dpi. In tutti i lignaggi studiati, è stata osservata un'infiltrazione prominente di macrofagi rispetto alle cellule CD4+ e CD8+. Nel complesso, gli animali infettati dal ceppo mutante hanno mostrato un'area colorata positivamente più alta rispetto al ceppo selvatico. Le delezioni in entrambi i geni ttrA e pduA hanno provocato un'infiltrazione più intensa di macrofagi e cellule CD4+ e CD8+ negli uccelli ospiti, suggerendo che non vi è alcuna attenuazione del patogeno, anche in diversi ceppi di Salmonella.

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La Salmonella enterica è un agente patogeno di origine alimentare che provoca perdite nel bestiame e impatti diretti sulla salute pubblica. Salmonella enterica subsp. enterica sierotipo Enteritidis (Salmonella Enteritidis) e Typhimurium (Salmonella Typhimurium) sono stati associati principalmente a infezioni alimentari per decenni. Tra il 1995 e il 2010, la Salmonella Enteritidis è stata identificata nel 34,2% di tutti i campioni positivi per Salmonella spp1. Oltre a ciò, Winter et al.2 hanno pubblicato uno studio sostanziale che indaga il ruolo del gene che codifica per il tetrationato, scegliendo il sierotipo Salmonella Typhimurium ma utilizzando i topi come modello sperimentale. Tenendo conto di ciò, approfondire la nostra conoscenza dell’interazione ospite-patogeno potrebbe aiutare a migliorare le misurazioni del controllo e dell’eradicazione. Nella patogenesi della salmonellosi sono coinvolti diversi fattori, come la capacità del patogeno di replicarsi in un ambiente mucoso infiammato, a seconda dell'acquisizione di nutrienti e della respirazione anaerobica2. Tuttavia, la disponibilità dei nutrienti non garantisce la sopravvivenza dei batteri in un ambiente competitivo densamente popolato da altri microrganismi. Pertanto, la capacità di Salmonella enterica di metabolizzare il tetrationato utilizzando la tetrationato reduttasi per produrre 1,2-propandiolo come fonte di energia conferisce un vantaggio in termini di fitness. Questo enzima è costituito da TtrA, TtrB e TtrC. La prima subunità citata appartiene alla superfamiglia delle molibdotterine (MPT) e ha un dominio di delimitazione FeS che è coinvolto nella riduzione del tetrationato in tiosolfato (S2O3 2−)2–4. Il Te 1,2-propandiolo è utilizzato dai microcompartimenti batterici (MCP). Questa struttura è costituita da sette diverse proteine, tra le quali PduA è il componente principale della struttura MCP5. Innanzitutto, l'1,2-propandiolo viene convertito in propionaldeide, che a sua volta viene ridotta a propanolo e propionato dall'attività della propandiolo deidratasi. Questo processo genera ATP mediante fosforilazione, un gradiente di elettroni (1-propanolo) per la rigenerazione del NAD e un intermediario (propionil-CoA) che può essere utilizzato come fonte di carbonio ed energia attraverso il metil citrato tramite, essendo dipendente dalla vitamina B12 sintetizzata in modo endogeno6. Durante le infezioni dei polli, la capacità dei sierotipi di Salmonella enterica di invadere e sopravvivere all'interno delle cellule epiteliali intestinali e dei macrofagi è seguita dall'evasione della risposta immunitaria7. In tale contesto, l’infezione è una fase critica che dipende dall’interazione tra cellule batteriche e cellule ospiti e dalla capacità dei batteri di superare le barriere dell’epitelio intestinale per garantirne la colonizzazione e la replicazione. Tuttavia, attiva le risposte infiammatorie e immunitarie8 che portano rispettivamente all'endocitosi e alla fagocitosi da parte delle cellule epiteliali e presentanti l'antigene (APC). L'attività antimicrobica di queste cellule innesca una risposta innata tramite i macrofagi e l'insieme della risposta immunitaria adattativa si basa sull'attivazione di CD4+ e CD8+9. Per far luce sulle interazioni ospite-patogeno dietro l'infezione intestinale da Salmonella nei polli, valutiamo la popolazione di cellule del sistema immunitario durante la colonizzazione intestinale e l'infezione sistemica negli uccelli di lignaggi commerciali sfidati da ceppi mutanti di tipo selvatico di Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium , che trasportano delezioni nei geni correlati alla metabolizzazione del tetrationato (ttrA) e dell'1,2-propandiolo (PDU).

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Risultati

Esperimento 1: sfida Salmonella Enteritidis.

I risultati della quantificazione della presenza delle cellule della risposta immunitaria nelle tonsille cecali, nel cieco, nell'ileo e nel fegato di polli da carne, galline ovaiole leggere e galline ovaiole semi-pesanti sono mostrati nelle Tabelle 1, 2 e 3. Abbiamo trovato più CD 4+ e infiltrazione di cellule macrofagiche da polli da carne infettati con Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA (SEΔttrAΔpduA) rispetto a polli da carne infettati con ceppo selvatico di Salmonella Enteritidis (wt-SE) o uccelli non infetti, in tutti i tessuti valutati. È stata trovata un'eccezione per l'infiltrazione di cellule CD4+ a 3 dpi nelle tonsille cecali, nell'ileo e nel fegato e per l'infiltrazione di macrofagi a 3 e 14 dpi nel fegato da polli da carne esposti a SEΔttrAΔpduA. Inoltre, il numero di cellule CD8+ infiltrate è stato osservato in quantità maggiore negli uccelli infettati con SEΔttrAΔpduA a 1 e 7 dpi nel cieco e nel fegato, a 3 dpi nelle tonsille cecali e a 14 dpi nell'ileo. Al contrario, gli uccelli esposti a wt-SE presentavano un'elevata infiltrazione di cellule CD8+ nell'ileo e nelle tonsille cecali rispettivamente a 1 e 7 dpi (Tabella 1; Figura supplementare S1). La Tabella 2 e la Figura S2 supplementare mostrano il CD4+ e il CD8+ e l'infiltrazione di macrofagi riscontrata nei tessuti di galline ovaiole semi-pesanti. In generale, si è riscontrata una grande variazione tra le aree degli infiltrati cellulari riguardanti sia il ceppo di sfida che i tessuti studiati. Gli uccelli trattati con SEΔttrAΔpduA hanno mostrato aree più elevate coperte da cellule CD4+ (nell'ileo a 1 e 14 dpi e nel fegato a 7 dpi) e macrofagi (nell'ileo a 7 dpi e nel fegato a 3, 7 e 14 dpi), che nello stesso tessuto degli uccelli sfidati con wt-SE. D'altra parte, le cellule CD8+ sono state trovate in quantità maggiori nelle tonsille cecali (a 1 e 7 dpi) e nel cieco (a 3 dpi) di uccelli infettati con il ceppo wt-SE. Diversamente osservato nei polli da carne e nei pulcini ovaiole semi-pesanti, la Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA ha innescato una risposta immunitaria meno intensa in aree cellulari rispetto al tipo selvatico, nella sfida con galline ovaiole leggere. Gli uccelli sfidati Wt-SE hanno mostrato aree di infiltrazione CD4+ più ampie nelle tonsille cecali (a 1 e 3 dpi), nel cieco (a 3, 7 e 14 dpi), nell'ileo (a 1 e 7 dpi) e nel fegato (a 14 dpi). Allo stesso modo, le sfide con SEΔttrAΔpduA hanno portato a una riduzione delle aree di infiltrazione sia di CD8+ nelle tonsille cecali (a 1 dpi) e nell'ileo (a 7 e 14 dpi), sia dei macrofagi nelle tonsille cecali e nel cieco (a 3 dpi), rispetto agli uccelli esposti a wt-SE. Non sono state osservate alterazioni significative dell'area delle cellule del sistema immunitario CD8+ e delle cellule dei macrofagi nel fegato sia degli uccelli esposti a SEΔttrAΔpduA che a wt-SE. I risultati dettagliati della sfida con le galline ovaiole sono mostrati nella Tabella 3 (vedi Figura supplementare S3).

Tabella 1. Rappresentazione della differenza significativa correlata alla distribuzione quantitativa delle diverse cellule della risposta immunitaria negli organi di polli da carne infettati con ceppi selvatici e mutanti di Salmonella Enteritidis a diversi giorni dopo l'infezione. DPI, giorni post-infezione; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis di tipo selvatico; ns, nessuna differenza significativa. All'interno di ciascun organo e DPI, * indica la differenza mediante ANOVA a due vie seguita dal test di confronto di Bonferroni tra i valori dei ceppi selvatici e mutanti (*P inferiore o uguale a 0.05; **P inferiore maggiore o uguale a 0.01; ***P minore o uguale a 0,001; ****P minore o uguale a 0,0001). Il ceppo presentato nella tabella (∆-SE o wt-SE) come significativo all'interno dell'organo e del DPI è quello che mostra la maggiore area di infltrazione in ciascuna cellula.

Tabella 2. Rappresentazione della differenza significativa correlata alla distribuzione quantitativa delle diverse cellule della risposta immunitaria negli organi di galline ovaiole semi-pesanti infettate con ceppi selvatici e mutanti di Salmonella Enteritidis a diversi giorni dopo l'infezione. DPI, giorni post-infezione; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis di tipo selvatico; ns, nessuna differenza significativa. All'interno di ciascun organo e DPI, * indica la differenza mediante ANOVA a due vie seguita dal test di confronto di Bonferroni tra i valori dei ceppi selvatici e mutanti (*P inferiore o uguale a 0.{{10}}5 ; **P Inferiore o uguale a 0.01; ***P Inferiore o uguale a 0,001; ****P Inferiore o uguale a 0,0001). Il ceppo presentato nella tabella (∆-SE o wt-SE) come significativo all'interno dell'organo e del DPI è quello che mostra la maggiore area di infltrazione in ciascuna cellula.

Tabella 3. Rappresentazione della differenza significativa correlata alla distribuzione quantitativa delle diverse cellule della risposta immunitaria negli organi di galline ovaiole infette con ceppi selvatici e mutanti di Salmonella Enteritidis in diversi giorni post-infezione. DPI, giorni post-infezione; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis di tipo selvatico; ns, nessuna differenza significativa. All'interno di ciascun organo e DPI, * indica la differenza mediante ANOVA a due vie seguita dal test di confronto di Bonferroni tra i valori dei ceppi selvatici e mutanti (*P inferiore o uguale a 0.{{10}}5 ; **P Inferiore o uguale a 0.01; ***P Inferiore o uguale a 0,001; ****P Inferiore o uguale a 0,0001). Il ceppo presentato nella tabella (∆-SE o wt-SE) come significativo all'interno dell'organo e DPI è quello che mostra la principale area di infiltrazione in ciascuna cellula.

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Esperimento 2: sfida con Salmonella Typhimurium.

I risultati della quantificazione della presenza delle cellule della risposta immunitaria nelle tonsille cecali, nel cieco, nell'ileo e nel fegato di polli da carne, galline ovaiole semi-pesanti e galline ovaiole leggere sono mostrati rispettivamente nelle Tabelle 4, 5 e 6. Nel complesso, i polli da carne infettati dal ceppo mutante hanno mostrato un'area marcata positiva superiore a quelli infettati con il ceppo selvatico di Salmonella Typhimurium (wt-STM), in tutti e quattro i giorni di campionamento. Inoltre, nei gruppi di controllo non infetti non sono state osservate alterazioni delle cellule della risposta immunitaria. Le aree cellulari CD4+ in tutti i tessuti dei polli da carne hanno raggiunto una differenza statistica a 1 dpi, con infiltrazioni maggiori per il test con Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA (STM∆ttrA∆pduA). Una differenza significativa tra l'area della risposta immunitaria quantificata degli uccelli esposti a STM∆ttrA∆pduA e wt-STM è stata, con infiltrazioni maggiori quando l'infezione era con il ceppo mutante nel cieco e nell'ileo a 1 dpi, e nel fegato a 14 dpi (celle CD8+); nel cieco, nell'ileo e nel fegato a 1 e 14 dpi (macrofagi) (Tabella 4; Figura supplementare S4). I risultati degli uccelli ovaioli semi-pesanti non hanno mostrato differenze statistiche tra i ceppi mutanti e quelli selvatici per le cellule CD4+ nel cieco e per le cellule CD8+ nelle tonsille cecali e nell'ileo in tutti e 4 i giorni post-infezioni valutate (Tabella 5; Figura supplementare S5). Tuttavia, quando è stata osservata un'area di concentrazione significativa di cellule del sistema immunitario, le galline ovaiole semi-pesanti sono state infettate con STM∆ttrA∆pduA: area di infiltrazione maggiore di macrofagi in tutti i tessuti studiati (a 1 e 14 dpi); un'importante area di infiltrazione di cellule CD4+ nelle tonsille cecali e nel fegato (a 1, 7 e 14 dpi) (Tabella 5; Figura supplementare S5). La Tabella 6 e la Figura S6 supplementare mostrano l'infiltrazione di CD4+, CD8+ e macrofagi riscontrata nei tessuti delle galline ovaiole leggere. Gli uccelli trattati con STM∆ttrA∆pduA hanno mostrato un'area di cellule principali del sistema immunitario CD4+ e cellule macrofagiche nelle tonsille cecali e nel cieco (a 14 dpi) e nell'ileo (a 1 e 14 dpi) rispetto alle cellule della risposta immunitaria area degli stessi tessuti di uccelli sfidati con wt-STM. Non è stata riscontrata alcuna differenza statistica per l'area di infiltrazione CD8+ nelle tonsille cecali, nel cieco e nell'ileo degli uccelli infestati. In contrasto con i risultati ottenuti in altri tessuti, il fegato degli uccelli colpiti da STM∆ttrA∆pduA presentava un'area colorata più espressiva delle cellule della risposta immunitaria per le cellule CD4+ e CD8+ a tutti e quattro i dpi, e macrofagi a 1 e 14 dpi.

Tabella 4. Rappresentazione della differenza significativa correlata alla distribuzione quantitativa delle diverse cellule della risposta immunitaria negli organi di polli da carne infettati con ceppi selvatici e mutanti di Salmonella Typhimurium a diversi giorni dopo l'infezione. DPI, giorni post-infezione; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium di tipo selvatico; ns, nessuna differenza significativa. All'interno di ciascun organo e DPI, * indica la differenza mediante ANOVA a due vie seguita dal test di confronto di Bonferroni tra i valori dei ceppi selvatici e mutanti (*P inferiore o uguale a 0.05; **P inferiore maggiore o uguale a 0.01; ***P minore o uguale a 0,001; ****P minore o uguale a 0,0001). Il ceppo presentato nella tabella (∆-STM o wt-STM) come significativo all'interno dell'organo e del DPI è quello che mostra la maggiore area di infltrazione in ciascuna cellula.

Tabella 5. Rappresentazione della differenza significativa correlata alla distribuzione quantitativa delle diverse cellule della risposta immunitaria negli organi di galline ovaiole semi-pesanti infettate con ceppi selvatici e mutanti di Salmonella Typhimurium a diversi giorni dopo l'infezione. DPI, giorni post-infezione; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium di tipo selvatico; ns, nessuna differenza significativa. All'interno di ciascun organo e DPI, * indica la differenza mediante ANOVA a due vie seguita dal test di confronto di Bonferroni tra i valori dei ceppi selvatici e mutanti (*P inferiore o uguale a 0.{{10}}5 ; **P Inferiore o uguale a 0.01; ***P Inferiore o uguale a 0,001; ****P Inferiore o uguale a 0,0001). Il ceppo presentato nella tabella (∆-STM o wt-STM) come significativo all'interno dell'organo e del DPI è quello che mostra la maggiore area di infltrazione in ciascuna cellula.

Tabella 6. Rappresentazione della differenza significativa correlata alla distribuzione quantitativa delle diverse cellule della risposta immunitaria negli organi di galline ovaiole infette con ceppi selvatici e mutanti di Salmonella Typhimurium in diversi giorni post-infezione. DPI, giorni post-infezione; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium di tipo selvatico; ns, nessuna differenza significativa. All'interno di ciascun organo e DPI, * indica la differenza mediante ANOVA a due vie seguita dal test di confronto di Bonferroni tra i valori dei ceppi selvatici e mutanti (*P inferiore o uguale a 0.{{10}}5 ; **P Inferiore o uguale a 0.01; ***P Inferiore o uguale a 0,001; ****P Inferiore o uguale a 0,0001). Il ceppo presentato nella tabella (∆-STM o wt-STM) come significativo all'interno dell'organo e DPI che mostra la principale area di infiltrazione in ciascuna cellula.

Discussione

I batteri, se esposti a condizioni anaerobiche, possono utilizzare substrati metabolici di tetrationato e 1,2-propandiolo come fonti di energia e respirazione10. Pertanto, la Salmonella spp. è stato a lungo oggetto di indagini su come la cancellazione di geni noti per essere responsabili di questi percorsi potrebbe influenzare la loro sopravvivenza nell'ospite. Per quanto ne sappiamo, è stato pubblicato un solo studio che ha indagato simultaneamente i ruoli dei geni che codificano per il tetrationato e il propandiolo. Il nostro gruppo di ricerca ha riportato gli effetti di queste delezioni valutando l'infezione sistemica e l'escrezione fecale di Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium in linee commerciali di pulcini11. Per aumentare la discussione su questo argomento, i presenti risultati hanno evidenziato la cellula immunitaria infiltrata in diversi tessuti di lignaggi di pulcini infettati sia con ceppi wild-type che mutanti portatori di delezioni nei geni ttrA e pduA. Durante l'esperimento di 2-settimana, le aree colorate positivamente delle cellule CD4+ e CD8+ e dei macrofagi seguono per lo più uno schema simile, in cui a 1 e 14 dpi presentano un numero maggiore di risposte immunitarie cellule. Ciò può essere spiegato dal contatto primario del sistema di difesa dell'ospite quando l'agente patogeno invade. Il precedente rapporto ha dimostrato che nei polli infetti, anche quando la Salmonella non viene escreta a 12 dpi, l'infezione può risultare positiva mediante tampone cloacale da 13 dpi12, spiegando perché le aree delle cellule del sistema immunitario a 3 e 7 dpi erano inferiori ma tornavano ad aumentare . A prima vista, ci si aspetterebbe che la risposta suscitata dall'ospite venga ridotta quando vengono eliminati sia pduA che ttrA poiché questi geni svolgono un ruolo importante nella sopravvivenza durante l'infezione da Salmonella2,4,13–15. Tuttavia, i nostri risultati che hanno confrontato un doppio mutante privo di entrambi i geni hanno mostrato il contrario: i ceppi mutanti di Salmonella Enteritidis e Salmonella Typhimurium hanno innescato una risposta immunitaria più elevata rispetto ai ceppi selvatici.

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Un'area colorata più corta potrebbe portare a un numero elevato di colonie nel tratto intestinale, corroborando uno studio precedente, in cui i ceppi di Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA e Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA sono stati recuperati in numero maggiore dai tamponi cloacali rispetto al loro tipo selvaggio correlato11 . La Salmonella può comportarsi come un batterio extracellulare o intracellulare, a seconda del repertorio di nutrienti disponibile, e avviene come un passaggio tra la colonizzazione intestinale e l'internalizzazione nelle cellule ospiti16. Quando i batteri vengono ingeriti e uccisi dai macrofagi, alcuni frammenti peptidici vengono trasferiti sulla superficie della cellula presentante l'antigene, essendo codificati dal complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), di classe II. Questo legame peptide-MHC II stimola i linfociti T CD4+. Tuttavia, se i batteri decidono di invadere la cellula ospite, entrando nel citoplasma del macrofago, la connessione peptidica con un altro tipo di MHC, di classe I, stimola la produzione di linfociti T CD8+17. È interessante notare che le cellule CD4+ e CD8+ presentano lo stesso modello di macrofagi durante l'esperimento, rappresentando anche risposte immunitarie diverse. Poiché le cellule CD4+ e CD8+ rappresentano principalmente i linfociti T che fanno parte della risposta immunitaria adattativa, i macrofagi fanno parte della risposta immunitaria innata9. In aggiunta a ciò, abbiamo osservato che i polli da carne presentano aree marcate positive più espressive rispetto alle galline ovaiole, confermato da uno studio precedente in cui i polli da carne infettati con ceppi mutanti mostravano, ad esempio, una colonizzazione intestinale e un'infezione sistemica più invasiva11. I nostri risultati suggeriscono che l’approccio immunoistochimico fornisce informazioni interessanti sul comportamento delle cellule della risposta immunitaria su più organi di diverse linee commerciali durante l’infezione da sierotipi di Salmonella enterica. Inoltre, il presente studio evidenzia che la delezione di entrambi i geni, anche in diversi ceppi di Salmonella, ha prodotto batteri che hanno suscitato una risposta immunitaria più elevata nell’ospite, dimostrando che l’agente patogeno non è stato attenuato. Possiamo considerare che forse la Salmonella è riuscita a trovare un altro meccanismo di sopravvivenza diventando ancora più patogena. L'utilizzo degli operoni ttr e pdu in consonanza con gli operoni cob e PRP è stato dimostrato, nello studio precedente, come necessario per la respirazione anaerobica16, portandoci a credere che non solo sia necessario eliminare più geni da ciascun operone18, ma abbiamo anche valutare l'eliminazione di tutta questa serie, per raggiungere ceppi meno patogeni di Salmonella enterica.

Materiali e metodi

Gli esperimenti, eseguiti seguendo le linee guida e i regolamenti pertinenti, sono stati approvati dal Comitato Etico sull'Utilizzo degli Animali dell'Università Statale di San Paolo (Processo CEUA/Unesp—006621/18; il 10 maggio 2018), sono stati condotti nel Laboratorio di Patologia Aviaria Laboratorio del Dipartimento di Patologia, Teriogenologia e One Health della Scuola di Scienze Agrarie e Veterinarie, Università Statale di San Paolo (FCAV/ Unesp), Jaboticabal, Brasile.

Ceppi batterici e costruzione dei mutanti.

I ceppi batterici qui utilizzati sono stati conservati all'interno di un mezzo crioprotettore composto da brodo Lysogeny (LB; BD DifcoTM, USA) integrato con il 30% di glicerolo (Merck, BR—H30402394 228) e conservati in un ultra-congelatore (- 80°) presso il Laboratorio di Patologia Aviaria della FCAV/UNESP. Salmonella Enteritidis P125109 (numero di accesso: AM933172) e Salmonella Typhimurium str. 9819 sono stati indotti alla resistenza all'acido nalidixico e alla spectinomicina (Nalr Spcr) e hanno fornito il background genetico per la costruzione di ceppi mutanti mediante la tecnica Lambda-red20 con piccole modifiche, descritte in Saraiva et al.11. I batteri mutanti qui costruiti sono identificati nel testo come SEΔttrAΔpduA (Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA) e STMΔttrAΔpduA (Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆due).

Esperimento in vivo.

Esperimento 1: Salmonella Enteritidis. Da allevamenti commerciali sono stati ottenuti trentasei 1-pulcini di un giorno provenienti da ciascuno dei tre diversi lignaggi (polli da carne, galline ovaiole semi-pesanti e galline ovaiole leggere), per un totale di centotto animali. All'arrivo, il fondo delle scatole delle carte di trasporto è stato esaminato per confermare lo stato esente da Salmonella degli animali21, e gli animali sono stati alloggiati in gabbie metalliche all'interno della stanza acclimatata e hanno ricevuto mangime privo di antibiotici e acqua ad libitum. Il primo giorno è stato scelto un programma di luce da 24-h per garantire un'ingestione ottimale di acqua e cibo, quindi nella prima settimana è stato adottato un programma di luce da 12-h, diminuendo a 8 ore nei giorni rimanenti. L'inoculo è stato preparato secondo Berchieri Junior et al.22. A tale scopo, le colture congelate sono state inoculate in LB e incubate durante la notte a 37 gradi a 150 giri al minuto. Il giorno successivo, le colture batteriche sono state trasferite in terreno fresco e incubate per 18 ore nelle stesse condizioni di prima. Quindi, 0,2 mL delle colture contenenti 108 unità formanti colonie per mL (CFU/mL) sono stati inoculati per via orale mediante sonda gastrica direttamente nel gozzo degli uccelli. Sono stati formati nove gruppi (da A a I) e divisi in modo casuale in base ai diversi lignaggi e ceppi (Tabella 7). Uno, tre, sette e 14- giorni dopo l'infezione (dpi), tre uccelli per gruppo ogni giorno, entro la mattina, venivano soppressi mediante lussazione cervicale per raccogliere la sezione mediale delle tonsille cecali, dell'intestino cieco, e ileo e la sezione distale del lobo sinistro del fegato per ulteriori analisi immunoistochimiche (IHC). Per questo, i campioni sono stati immersi in n-Esano pa (n-Esano pa, Synth, Brasile) precedentemente refrigerati in azoto liquido. Immediatamente dopo il congelamento del tessuto, questo è stato trasferito in una crioprovetta da 2 ml (Corning, USA) e condizionato in azoto liquido. Dopo il campionamento, i tessuti sono stati conservati a -80 gradi fino al processo IHC.

Esperimento 2: Salmonella Typhimurium. Questo esperimento è stato condotto seguendo le stesse caratteristiche menzionate sopra nell'Esperimento 1. Trentasei pulcini (di 1 giorno) sono stati divisi casualmente in nove gruppi (da A a I) in base ai loro lignaggi e ceppi (Tabella 7).

Tabella 7. Gruppi stabiliti in base ai diversi lignaggi e ceppi. SE∆ttrA∆pduA, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; STM∆ttrA∆pduA, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis di tipo selvatico; wt-STM, Salmonella Typhimurium di tipo selvatico; NC, controllo negativo.

Immunoistochimica.

Sezione dei tessuti. I campioni raccolti sono stati trasferiti da -80 gradi al criostato (Leica CM1860, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germania) a -22 gradi dove sono stati bloccati individualmente nel composto OCT (Tissue-Tek®, Sakura Finetek Europe BV, Paesi Bassi) ogni 30 minuti prima a una sezione di 6 µm utilizzando lame monouso a basso profilo (Leica 819, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germania). È interessante notare che le sezioni sono state eseguite a -22 gradi, ad eccezione delle sezioni del fegato, che sono state eseguite a -15 gradi. Sono state preparate diapositive contenenti tre ripetizioni del sezionamento di ciascun organo per risposta delle cellule immunitarie contrassegnate, con diradamento tra ogni ripetizione. Utilizzando un pennello, i tagli delle sezioni di tessuto sono stati posizionati su vetrini istologici pretrattati con poli-l-lisina (Sigma-Aldrich, Regno Unito, Cat n. P4832) e silano (Sigma-Aldrich, USA. Cat n. 440574). Successivamente i vetrini sono stati conservati a -20 gradi fino alla colorazione IHC. Colorazione delle cellule immunitarie. Innanzitutto, i vetrini sono stati immersi in 200 ml di acetone refrigerato (acetone PA—ACS, Synth, Brasile) e incubati a -20 gradi per 10 minuti. Successivamente, i vetrini sono stati trasferiti in una camera umida (EasyPath®, Brasile) a temperatura ambiente per 5 minuti per asciugare i campioni. Successivamente i vetrini sono stati lavati con PBS e lasciati in una pozzanghera per 5 minuti per evitare la disidratazione dei tessuti. Dieci, i tessuti sono stati immersi in 200 ml di H2O2 al 4% per 10 minuti in un luogo buio e lavati nuovamente con PBS. L'area attorno alle sezioni di tessuto è stata asciugata con carta assorbente e il campione è stato bypassato da una penna idrofobica (Dako Pen, Dako Denmark A/S, Danimarca). La fase di lavaggio che lascia una pozzanghera è stata ripetuta come in precedenza. Il kit privo di biotina Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection—Micropolymer (Abcam©, USA) è stato utilizzato per colorare le cellule immunitarie, scegliendo il metodo Avidin–Biotin Streptavidin Peroxidase Complex (ABC). Per questo, la pozzanghera è stata rimossa e ai tessuti sono state aggiunte goccioline di reagente bloccante il colore di fondo non specifico. I vetrini sono stati mantenuti all'interno della camera umida in un luogo buio per 30 minuti, la fase di lavaggio è stata ripetuta e sono stati aggiunti 200 µl di anticorpo primario (Mouse Anti-Chicken CD4-UNLB; Mouse Anti-Chicken CD{{34} } UNLB; Mouse Anti-Chicken Monocyte/Macrophage-UNLB, Southern Biotech, USA) diluito in una proporzione di 1:200 (v/v) nel reagente diluente dell'anticorpo (Antibody diluent, Abcam©, USA) è stato successivamente aggiunto. I vetrini sono stati incubati a 4 gradi per 18 ore. Il giorno successivo i vetrini sono stati lavati come in precedenza. Dieci goccioline dell'anticorpo secondario (Reveal Complement, Abcam©, USA) sono state aggiunte dopo aver rimosso il PBS in eccesso e la camera umida è stata posta in un ambiente buio per 30 minuti. Successivamente, una goccia di 3,3′-diaminobenzidina (DAB Chromogen 50×, Abcam©, USA) è stata diluita in 1 mL di substrato (DAB Substrate, Abcam©, USA), volume sufficiente per tre vetrini, e aggiunta al le sezioni di tessuto. Un minuto dopo, i vetrini sono stati immersi in 200 ml di dH2O per 5 minuti. Successivamente, sono stati trasferiti in un cubo di plastica contenente ematossilina Harris (Êxodo Científca, Brasile) e lasciati per 1 minuto. Posteriormente i vetrini sono stati lavati per 10 minuti sotto acqua corrente a bassa pressione. I vetrini sono stati sottoposti alla serie alcol-xilene (alcool 70%, alcol 90%, alcol 100%, xilene I e xilene II). Alla fine, i vetrini coprioggetto sono stati posizionati sui vetrini dopo aver aggiunto una goccia di mezzo di montaggio privo di acqua (Entellan®, Merck, Brasile). Le immagini delle sezioni di tessuto sono state scattate in modo casuale, scegliendo cinque campi di visualizzazione casuali, utilizzando un microscopio ottico (lente 400×) (Coleman®, modello N-120) con un adattatore per fotocamera digitale, per ulteriori analisi statistiche (Fig. 1 ).

Analisi dei dati.

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

La percentuale di cellule e macrofagi CD{{0}} e CD8+ è stata calcolata utilizzando Image-Pro Plus v.4.5.0.29 (MediaCybernetics, USA). Sono stati quantificati come valori percentuali in base all'area positiva del marcatore delle cellule immunitarie/area totale. L'analisi statistica e i grafici sono stati eseguiti utilizzando il software GraphPad Prism v.8.0.1 per macOS (GraphPad Sofware, La Jolla California, USA) e i dati sono stati inviati all'analisi della varianza (ANOVA) seguita da confronti multipli Bonferroni, considerando un livello di significatività inferiore al 5% (P inferiore o uguale a 0,05).

Figura 1. Sezione del cieco di un pollo infetto da Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA che mostra immunoreazioni nei macrofagi, 7 giorni dopo l'infezione (×400; avidina-biotina streptavidina perossidasi, controcolorata con ematossilina).

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